Рисунок ранней репликации хромосом растений

Поиск новых методов, позволяющих получать рисунок дифференциального окрашивания высокого разрешения, был начат нами с методики выявления репликативного бэндинга, основанной на асинхронности репликации ДНК хромосом в течение S-фазы. В основе этого метода лежит включение в процессе репликации ДНК аналогов оснований с последующей их детекцией. В результате, на хромосомах млекопитающих выявляется высокоразрешающий так назваемый «репликативный» бэндинг. У млекопитающих процесс синтеза ДНК имеет двухфазный характер, поэтому в хромосомах можно выявлять рисунки, соответственно, ранней и поздней репликации. У человека рисунок ранней репликации сходен с G-, а поздней — с Rи С-бэндингом при использовании так называемого FPG (Fluorochrom Plus Giemsa) метода выявления репликативного бэндинга [Захаров и др., 1982]. Применительно к хромосомам растений мы адаптировали вариант метода выявления рисунков ранней репликации хромосом — BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинг. Он основан на встраивании бромдезоксиуридина (BrdU) в ДНК в начале S-периода ее синтеза и последующим разрушением участков ДНК со встроенным аналогом с помощью облучения ультрафиолетовым светом [Захаров и др., 1982]. При этом участки хромосом, реплицирующиеся в середине и конце S-фазы, выделяются как темно окрашенные (Giemsa-положительные) сегменты (бэнды). В этом варианте методики используется обработка BrdU в высокой концентрации, что блокирует большинство делящихся клеток корневой меристемы в начале S-фазы. После снятия BrdU-блока, в первом митотическом делении на хромосомах выявляется рисунок ранней репликации.

Для отработки методики в качестве модельного объекта было выбрано крупнохромосомное растение — ячмень (Hordeum vulgare L.), хромосомы которого имеют длину 6−12 мкм. У этого модельного объекта нам удалось получить рисунок ранней репликации, который был специфичен для каждой из 7 гомологичных групп хромосом (Рис. 1).

• — рисунок поздней репликации хромосом (по данным Uozu et al., 1997);
• — рисунок ранней репликации хромосом;
• — рисунок G-подобной окраски (окрашивание раствором Giemsa после обработки трипсином);
• — рисунок С-окраски хромосом.

Ранее считалось, что у растений асинхронность репликация ДНК в течение S-периода выражена в меньшей степени, чем у млекопитающих [Cortes et al., 1980; Kakeda, Yamagata, 1991]. Однако, как показали наши исследования, асинхронность репликации ДНК в течение S-периода у растений может проявляться достаточно отчетливо. При этом на хромосомах ячменя, как и на хромосомах человека [Захаров и др., 1982], рисунок поздней репликации хромосом в целом совпадает с рисунком С-окраски [Uozu et al., 1997], а рисунок ранней репликации хромосом — с рисунком G-подобного дифференциального окрашивания, выявляемого на хромосомах после обработки трипсином (Рис. 1). Этот факт еще раз подтверждает единство основных принципов хромосомной организации геномов высших эукариот.

Большое число сегментов, которые выявил на хромосомах ячменя метод репликативного бэндинга, побудило нас попытаться использовать этот подход для изучения мелких хромосом растений с целью идентификации этих хромосом по рисункам ранней репликации (См. раздел 2.1).