Отбор штаммов рода Bacillus с противогрибковой активностью для создания эффективных биопрепаратов

Ежегодный ущерб, наносимый вредителями и болезнями сельскохозяйственным культурам, по данным организации по продовольствию и сельскому хозяйству ООН, составляет примерно 20−25% потенциального мирового урожая продовольственных культур. Поэтому роль защиты растений в увеличении производства и сохранении сельхозпродуктов огромна [1].

В северном регионе — основной житнице республики — чрезвычайную опасность для яровой пшеницы представляют корневая гниль, бурая ржавчина и септориоз, которые проявляются почти ежегодно и в зависимости от природных условий года и других факторов распространяются на площади до 3−5 млн. га, потери урожая достигают 15−20% и более [2].

Основной урон сельскому хозяйству наносят фитопатогенные грибы родов Fusarium, Bipolaris, Penicillum и др., являющиеся возбудителями различных гнилей, пятнистостей, увядания, скручивания листьев и других заболеваний растений.

Биологический контроль фито-патогенов in vitro является до сих пор одним из основных критериев отбора практически полезных штаммов. Для селекции бактерий-антагонистов против возбудителей наиболее распространенных болезней зерновых и овощных культур были выделены изоляты спорообразующих микроорганизмов.

Анализ тенденции развития в области защиты растений в России, США и других странах показал, что против фитопатогенных организмов определенную перспективу имеет применение биологического метода, в частности, микроорганизмов-антагонистов и индустрированной устойчивости растений.

Ученые многих стран мира отдают предпочтение использованию биологических препаратов бактериального происхождения [3]. Так, в связи с биологизацией и экологизацией сельскохозяйственного производства направление по созданию биопрепаратов для защиты растений становится все более актуальным.

Существует множество биологических функций микроорганизмов, направленных на осуществление биосинтеза метаболитов различного действия.

Потенциальным объектом агробиотехнологии являются ризосферные PGPR (от Plant Growth-Promotion Rhizobacteria), широко используемые для разработки биологических средств защиты растений от фитопатогенов, а также биопрепаратов, стимулирующих рост и повышающих продуктивность растений [4].

Механизм действия этих микроорганизмов на фитопатогены включает конкуренцию за источник питания, эффективную колонизацию ризосферы, синтез антибиотических и росторегулирующих веществ [5, 6]. Так, использование микробных культур на основе микроорганизмов-антагонистов фито-патогенов позволяет не только надежно контролировать развитие бактериальных и грибных инфекций в течение всего вегетационного периода, но и во время хранения сельскохозяйственной продукции или посевного материала [7].

Известно, что 60−90% живой биомассы почвы составляют микроорганизмы, физиолого-биохимическая активность которых в 100−1000 раз выше, чем макроорганизмов.

Почвенные микроорганизмы-антагонисты способны подавлять развитие фитопатогенных микромицетов, в том числе и фузариев, за счет секреции в среду экзометаболитов с выраженной антибиотической активностью, а также ферментативного разрушения гифов грибов и жесткой конкуренции за жизненное пространство и питательный субстрат. Использование бактерий рода Bacillus как биоагентов микробных препаратов имеет ряд преимуществ: данные микроорганизмы легко культивируются, могут длительное время храниться, а также использоваться в виде спор, что облегчает инокуляцию посевного материала и пролонгирует длительность действия биопрепарата в природной среде [8]. Российские ученые уделяют большое внимание использованию для биологической защиты растений бактерий из родов Pseudomonasи Bacillus [9].

Отечественных разработок по созданию биологических фунгицидов очень мало, поэтому данная проблема для нас представляет огромный интерес, так как Казахстан полностью зависит от ввозимых иностранных пестицидов и биофунгицидов.

Материалы и методы

Отбор антагонистов фитопатогенов проводили методом диффузии в агар с применением агаровых блоков.

Суспензию тест-культуры фитопатогена вносили в расплавленный агар и разливали его в чашки Петри. Пробочным сверлом (диаметр 6−8 мм), предварительно опущенным в спирт и обожженным в пламени горелки, вырезают 4 агаровых блока.

На поверхность агара после застывания помещали агаровые блоки, вырезанные с питательной средой СПА, где можно культивировать бактерии-антагонисты.

После агаровые блоки засевали исследуемыми культурами. Чашки с агаровыми блоками инкубировали 7 суток при температуре 30 ⁰С. Суспензию тест-культуры фитопатогена вносили в среду из расчета 10 мл на 100 мл питательной среды.

Результаты и их обсуждение

бактерия антагонистический активность противогрибковый Биологический контроль фитопатогенов in vitro является до сих пор одним из основных критериев отбора практически полезных штаммов. Для селекции бактерий-антагонистов против возбудителей наиболее распространенных болезней зерновых и овощных культур были выделены изоляты спорообразующих микроорганизмов.

Целью нашей работы являлось изучение противогрибковой активности бактерий рода Bacillus для создания в дальнейшем на их основе эффективных биопрепаратов. Проведена проверка выделенных изолятов спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus на антагонистическую активность против фитопатогенных грибов в условиях in vitro.

Нами были взяты на проверку антагонистической активности 10 штаммов рода Bacillus, выделенных из почв Акмолинской области спорообразующих микроорганизмов. В качестве тест-объектов при определении антагонистического спектра бактерий использовали штаммы грибов Fusarium oxysporum 91, Fusarium heterosporum 84 и Alternaria alternata А8, взятых из коллекции Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина, кафедры агрохимии и почвоведения. Данные грибы являются возбудителями наиболее распространенных болезней растений.

Особенности воздействия метаболитов бактерий группы Bacillus на развитие мицелия проявлялись в следующем. Вокруг колоний бактерий группы Bacillus формируется округлая, четко выраженная зона подавления роста мицелия гриба.

На границе зоны подавления роста гриба и колонии бактерий сформировался ободок, чуть приподнятый над средой.

Результаты микроскопирования мицелиальной клетки гриба A. Alternata А8 представлены на рисунках 1 и 2. При микроскопировании подавленного мицелия просматриваются морфологические изменения клеток мицелия. Они заметно округляются, укорачиваются в гифах, наблюдается грануляция цитоплазмы, происходит образование хламидоспор, на концах конидий образуются пузыревидные вздутия (рис. 2).

Показатели антагонистической активности выделенных штаммов бактерий рода Bacillus по отношению к фитопатогенным грибам приведены в таблице 1.

Как показывают данные таблицы 1, в результате антагонистического действия бактерий рода Bacillus на фитопатогенные грибы вокруг колоний бактерий наблюдается отсутствие зоны роста гриба. Наиболее сильными антагонистическими свойствами по отношению к F. heterosporum 84 обладали бактерии Bacillus шт. 2, Bacillus шт. 31, Bacillus шт. 9, Bacillus шт. 18. Диаметр зон подавления роста гриба колебался в пределах от 21 до 41 мм. Диаметр в пределах 3−14 мм отмечен у 6 испытуемых штаммов бактерий по отношению к F. heterosporum 84. Активность против гриба F. oxysporum 91 проявили бактерии Bacillus шт. 31, Bacillus шт. 2, Bacillus шт. 9, Bacillus шт. 29, зона подавления мицелия колебалась в пределах 18−45 мм. Активность против гриба A. Alternate А8 проявили бактерии Bacillus шт. 31, Bacillus шт. 2, Bacillus шт. 9, Bacillus шт. 29, Bacillus шт. 18, зона подавления мицелия колебалась в пределах от 18 до 38 мм. По тестированию фунгицидной активности штаммов бактерий было выявлено, что все штаммы давали четко выраженную границу между бактериальной и грибной культурами.

В результате проведенных экспериментов были отобраны 3 активных штамма микроорганизмов (Bacillus шт. 31, Bacillus шт. 2, Bacillus шт. 9) с наибольшей антифунгальной активностью по отношению к фитопатогенным грибам и на их основе наработана культуральная жидкость. Диаметр зон подавления роста гриба F. oxysporum 91 колебался в пределах от 23,3 до 45 мм. Диаметр в пределах 21,7−41,7 мм отмечен у отобранных штаммов бактерий по отношению к F. heterosporum 84. Активность против гриба A. alternata А8, зона подавления мицелия колебалась в пределах 25 до 36,7 мм.

Далее нами был поставлен повторный опыт по отношению к фитопатогенам. Результаты исследования показаны на рисунках 3 и 4.

При изучении штамма Bacillus шт. 2 выявлено, что он обладает наиболее сильным антибиотическим действием по отношению ко всем исследуемым фитопатогенным грибам. Сильно выраженный антагонизм он проявил особенно в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium oxysporum 91, где прозрачная зона достигла 46,0 мм, эффективность подавления роста гриба F. heterosporum 84 также была высокой — 42,0 мм. В отношении остального фитопатогена — AAlternatci А8 проявил среднюю степень антагонизма. Средний радиус зоны лизиса данного штамма составляет 41,5 мм.

Из числа исследуемых тест-культур штамм Bacillus шт. 9 проявлял ярко выраженное антагонистическое действие только по отношению к двум фитопатогенам — зона подавления A. alternata А8 и F. oxysporum 91 составляет от 36,7 до 33,3 мм.

При изучении антибиотического действия штамма Bacillus sp. 31 установлено, что он ингибирует развитие всех изучаемых фитопатогенных грибов.

При подсеве фитопатогенов отмечен рост штамма в виде волнообразного полукруга и в радиусе 28,3 мм для гриба A. Alternata А8, 30,0 мм — для гриба F. oxysporum 91, 39,7 мм — для гриба F. heterosporum 84.

Отобранные активные штаммы-антагонисты были идентифицированы генно-молекулярными, а также классическими методами исследования. На основании изученных методов штамм Bacillus sp. 31 отнесен к виду Bacillus cereus, штамм Bacillus sp. 2 — к виду Bacillus subtilis, штамм Bacillus sp. 9 — к виду Bacillus cereus.

Выводы

В настоящее время перспективным направлением является разработка безопасных и эффективных биологических средств борьбы с патогенными грибами и микроорганизмами, которая предполагает широкое применение препаратов на основе бактерий-антагонистов и их метаболитов, проявляющих активность против широкого спектра грибных патогенов. Наибольшей антифунгальной активностью из всех исследованных штаммов по отношению к фитопатогенным грибам обладали штаммы бактерий Bacillus subtilis 2, Bacillus cereus 31 и Bacillus cereus 9.

В заключение можно сказать, что отбор активных штаммов позволит рекомендовать бактерии-антагонистов для создания на их основе высокоэффективных экологически безопасных препаратов защиты растений от заболеваний, вызываемых патогенными грибами.

• 1. Койшибаев М., Пономарева Л. А. Вредоносность болезней яровой пшеницы с воздушно-капельной инфекцией в Северном Казахстане // Вестн. сельхоз. науки Казахстана. — 2008. — № 8. — С. 15−19.
• 2. Morgounov A., Rosseva L. and Koyshibayev M. Leaf rust Wheat in Northern Kаzakhstan and Siberia incidence virulence and breeding for resistance // Australian Journal of Agricultural Research. — 2007. — № 56. — Р. 847−853.
• 3. Maurhofer M., Keel C., Schider C. et al. Disease control and pest management, Influence of enhanced antibiotic production in Pseudomonasfluorecens strains CHAO on its disease suprossive capacity // Phythopatology. — 1992. — № 82. — 190−195.
• 4. Pfender W.F., Kraus J. and Loper J.E. Agenomic region from Pseudomonas fluorecens Pf-5 required for pirrolnitrinpriduction and inhibition ot Pyrenophora tTitici-repentis in wheat straw // Phythopatology. — 1993. — № 83. — 1223−1228.
• 5. Надыкта В. Д. Перспективы биологической защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов // Защита и карантин растений. — 2004. — № 6. — С. 26−28.
• 6. Воронин А. М., Кочетков В. В. Биологические препараты на основе псевдомонад // АГРО XXI. — 2000. — 140 с.
• 7. Benizri E., Baudon E., Guckert A. Root colonization by inoculated plant growth-promoting rhizobacteria // Biocontrol science and technology. — 2001. — № 11. — 557−574.
• 8. ШтерншисМ.В., Джалилов Ф. С., АндрееваИ.В. и др. Биопрепараты в защите растений. — Новосибирск, 2000. — 128 с.
• 9. Кузин А. И., Кириченко П. М., Кузнецова Н. И. и др. Фунгицидные свойства штаммаBacillussubtilis// Сельскохозяйственная микробиология в XVIII—XIX вв.еках: Материалы Всерос. конф. — СПб., 2001. — С. 30.