Введение. 
Нейротропное и антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) in vitro и in vivo

Актуальность проблемы Изучение механизмов регуляции биологических процессов, как в норме, так и при воздействии стресс факторов (гипоксия, ишемия, токсины и др.) является одной из значимых современных задач как биологии, так и медицины. В связи с чем остается актуальным вопрос о поиске веществ цитопротекторного действия, способных защитить клетки головного мозга от повреждающего действия стрессогенных факторов, в том числе гипоксии. Среди химических веществ, способных контролировать уровень метаболизма клетки в условиях сниженного уровня содержания кислорода, выделяют нейротрофический фактор головного мозга (англ. — Brain-derived neurotrophic factor или BDNF) (Larsen E.C. et al., 2007, Dirnagl U. et al., 2009), относящийся к семейству нейротрофинов. Нейротрофины — одни из важнейших регуляторных белков, обеспечивающих основные процессы жизнедеятельности человека и животных (Гомазков О.А., 2006, 2011), функции которых в основном связаны с работой центральной нервной системы (ЦНС). BDNF обеспечивает рост и развитие головного мозга в эмбриогенезе, а также образование и функционирование нейронных сетей в раннем постнатальном периоде (Martin J.L. et al., 2011). Недавними исследованиями показана возможность модулирования нейротрофическим фактором синаптической передачи в гиппокампе и некоторых отделах коры зрелого головного мозга (Rose C.R. et al., 2004, Edelman et al., 2014). В результате взаимодействия BDNF с тирозинкиназным рецептором В (англ. — TrkB) происходит активация нескольких сигнальных каскадов, обеспечивающих модулирующее действие нейротрофического фактора на синаптическую передачу сигнала в клетке, в частности при обучении (Aptowicz C.O. et al., 2004, Сunha C. et al., 2010, Leal G. et al., 2014).

Как в норме, так и в условиях ишемии/гипоксии действие BDNF опосредованно запуском основных сигнальных метаболических путей: митоген-активированного протеинкиназного пути (англ. — MAPK) и фосфоинозитол-3-киназного пути (англ. — PI-3) (Sun X. et al., 2008, Maddahi A. et al., 2010). Важным компонентом данных сигнальных механизмов является цАМФ-зависимый транскрипционный фактор (англ. — CREB), который способствует BDNF-опосредованному выживанию нейронов в центральной нервной системе, активируя антиапоптотическую экспрессию генов на ранних стадиях постнатального развития (Choi J.S. et al., 2003, Arthur J.S.C. et al., 2004). Однако экспериментальные данные по объяснению механизмов разностороннего действия BNDF противоречивы (Markham A. et al., 2012) и являются предметом дискуссии в научном мире. Так, например, выявлено, что в раннем онтогенезе BDNF играет важную роль не только в нейропротекции, но и в патогенезе нейродегенеративных заболеваний (Mizoguchi Y. et al., 2009, Grande I. et al., 2010, Jiang Y. et al., 2010, Chen A. et al., 2013).

Кроме того, не менее важным аспектом при изучения антигипоксических свойств цитопротекторов является разработка адекватных и легко воспроизводимых моделей гипоксии и методов оценки протекторного действия. Особый интерес представляет исследование действия гипоксии на сетевом уровне организации нейронов, возможный на современном уровне развития электрофизиологической техники при помощи мультиэлектродной системы регистрации внеклеточных потенциалов действия (англ. — Мultielectrode Аrrays). Длительное культивирование клеток различных структур головного мозга на мультиэлектродных матрицах in vitro дает уникальную возможность не только исследовать при одновременой оптической визуализации изменения морфофункциональных свойств нейронов в хроническом эксперименте, но и моделировать различные патологические состояния ЦНС (Potter S.M., DeMarse T.B., 2001, Madhavan R. et al., 2006, Stegenga J. et. al., 2008, Pan L. et. al., 2009, Pimashkin A.S. et al., 2011).

По мере изучения механизмов действия BDNF на нейросетевом уровне появится возможность разработки новых лекарственных средств и соответствующих способов коррекции ишемических процессов в нервной ткани при нейродеструктивных заболеваниях.

Таким образом, целью исследования явилось изучение нейротропного действия нейротрофического фактора головного мозга на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro, а также исследование антигипоксических свойств BDNF при моделировании гипоксической гипоксии in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

• 1. Изучить нейротропное действие BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей в культуре диссоциированных клеток гиппокампа на 7, 14 и 21 день их развития in vitro (DIV);
• 2. Исследовать ранние и отдаленные эффекты антигипоксического действия BDNF на активность нейронной сети первичных культур клеток гиппокампа при моделировании острой нормобарической гипоксии in vitro;
• 3. Изучить эффект BDNF на выживаемость, двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, сохранение и воспроизведение следов долговременной памяти у экспериментальных животных в раннем и отдаленном периодах после воздействия острой гипобарической гипоксии in vivo.

Научная новизна В диссертации впервые проведено комплексное исследование влияния нейротрофического фактора BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа на разных этапах развития in vitro. Выявлен дозо-зависимый нейротропный эффект BDNF на биоэлектрические показатели функционального состояния нейронных сетей первичной культуры гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro, заключающийся в увеличении длительности сетевой пачечной активности при отсутствии изменений в количестве спайков и повышении синхранизации активности нейронов в составе сети при формировании спонтанной сетевой пачки. Нейротропный эффект имел транзиторный характер, наступал с задержкой в 10−15 мин и длился не менее 2-х часов.

На модели острой гипоксии in vitro впервые выявлено антигипоксическое действие BDNF, наиболее выраженное при аппликация нейротрофического фактора в концентрации 1 нг/мл за 20 мин до острой нормобарической гипоксии. Установлено, что превентивное применение BDNF препятствует повреждениям и гибели нейронов в культурах диссоциированных клеток гиппокампа в отдаленном постгипоксическом периоде, что способствует нормализации спонтанной биоэлектрической активности нейронов в составе сети после гипоксии/реоксигенации. Антигипоксическое действие BDNF реализуется через взаимодействие белка с тирозинкиназным рецептором В (TrkB).

Антигипоксическое действие BDNF, выявленное на клеточном уровне in vitro, подтверждено при моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo. Впервые показано, что превентивное интраназальное введение BDNF, 4 мкг/кг и 40 мкг/кг способствует выживаемости животных на «смертельной площадке», увеличению устойчивости животных к гипоксии, а также сохранению следов долговременной пространственной памяти, двигательной и исследовательской активности в постгипоксическом периоде.

Практическая и теоретическая значимость работы Полученные в работе данные о действии нейротрофического фактора BDNF на структурно-функциональное состояние нейронных сетей гиппокампа в процессе синаптогенеза расширяют теоретические представления о роли BDNF в функционировании мозга в постнатальном периоде. Выявлены антигипоксические свойства нейротрофического фактора в условиях острой гипоксии как in vitrо, так и in vivo. Раскрытие механизмов нейропротекторного действия BDNF может способствовать разработке новых терапевтических подходов к коррекции ишемических процессов в нервной ткани при нейрососудистых заболеваниях.

Положения, выносимые на защиту.

• 1. Нейротрофический фактор головного мозга дозозависимо модулирует спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей диссоциированных культур клеток гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro.
• 2. Нейротрофический фактор головного мозга является компонентом эндогенной антигипоксической системы защиты клеток мозга в постнатальном периоде, способствует повышению выживаемости нейронов и сохранению функциональности нейронных сетей как в условиях гипоксии/реоксигенации, так и в отдаленном постгипоксическом периоде через взаимодействие с тирозинкиназным рецептором В (TrkB).
• 3. Превентивное интраназальное введение нейротрофического фактора головного мозга увеличивает устойчивость животных к условиям острой гипобарической гипоксии, а также способствует сохранению долговременной пространственной памяти после гипоксии/реоксигенации.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на X сессии молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Н.Новгород, 2011), Седьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2011), Всероссийской молодежной конференции — школы «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011), Восьмом международном форуме по нейронауке FENS 2012 (Испания, Барселона, 2012), IV Съезде биофизиков России (Н.Новгород, 2012), IV Международном симпозиуме Topical Problems of Biophotonics — 2013 (Н.Новгород, 2013), XXII Съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Волгоград, 2013), Восьмом международном симпозиуме по нейропротекции и нейровосстановлению (Германия, Магдебург, 2014), Международной научной школе «Горизонты современной нейронауки» (Н.Новгород, 2014), Международном конгрессе по нейронаукам (Красноярск, 2014), Девятом международном форуме по нейронауке FENS 2014 (Италия, Милан, 2014), Десятом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2014), Симпозиуме «Новейшие методы клеточных технологий в медицине» (Новосибирск, 2014).