Индукция гаплоидов в культуре тканей и использование гаплоидов и дигаплоидов в селекции растений

Под гаплоидами имеются в виду особи, несущие одинарный или гаплоидный набор непарных хромосом. В природе гаплоиды могут возникать спонтанно с частотой один гаплоид на 10⁵ -10⁶ растений. Гаплоидные растения отличаются меньшей высотой стебля, позднеспелостью и, как правило, стерильны. Для востановления исходного набора хромосом гаплоиды обрабатывают колхицином, что позволяет получить фертильные растения, полностью гомозиготные по всем аллельным генам. Возможно и спонтанное восстановление уровня плоидности в процессе деления клеток. Гаплоидный уровень генотипа позволяет вести отбор рецессивных мутаций, проявляющихся фенотипически. Все генетические «изъяны» организма на гаплоидном уровне обнаруживаются легче, чем на диплоидном. Кроме того, у гаплоидов не проявляются генетические эффекты доминирования, но хорошо идентифицируются аддитивные и особенно эпистатические эффекты генов, что позволяет вести отбор ценных генотипов с такими эффектами.

Применение гаплоидов в селекции растений позволяет решить следующие задачи:

• 1. Быстрое получение константного нерасщепляющегося материала после гибридизации (в F₂), гомозиготного по всем аллельным генам. В этом случае длительность селекционного процесса у самоопылителей сокращается на 3−4 года. Весьма перспективен такой подход для гетерозисной селекции, где создание инцухтлиний растянуто во времени на 5−6 лет;
• 2. Эффективный отбор мутантов, т.к. при отсутствии явления доминирования все гены гаплоидов фенотипически проявляются и идет элиминация организмов, несущих летальные и полулетальные гены;
• 3. Получение моносомных линий и их использование для генетического анализа и хромосомной инженерии;

Первое гаплоидное растение обнаружили Блэксли с соавторами в 1922 году и предложили использовать гаплоиды в селекции. В культуре in vitro гаплоидные растения были получены впервые Гуха и Магешвари в 1964 году при культивировании незрелых пыльников дурмана. Получение гаплоидов на основе методов культуры in vitro возможно тремя способами:

Андрогенез — развитие гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников или микроспор (Рис. 1).

Рис. 1. Формирование эмбриогеных структур (а) и регенерантов (б) у пшеницы T. aestivum в культуре пыльников (Орлов, Сидоров, 2003)

Возможен прямой андрогенез, когда из пыльников развиваются эмбриоиды, а затем растения, а также непрямой андрогенез, когда образованию эмбриоидов предшествует стадия формирования каллуса. Предпочтительнее прямой андрогенез, поскольку каллус может образовываться как из микроспор, так и из соматических клеток пыльника. В последнем случае формируются гетерозиготные растения.

Гиногенезразвитие гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек.

Партеногенез — развитие гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы (метод гаплопродюсеров).

Метод изолированных пыльников и микроспор получил наибольшее распространение, он применяется более, чем для 250 видов растений, в том числе для таких хозяйственно ценных культур, как пшеница, рис, кукуруза, ячмень, люцерна, лен, апельсин, виноград, яблоня и др. При культуре пыльников не всегда удается исключить размножение диплоидных клеток ткани пыльника, поэтому использование пыльцы там, где это возможно, предпочтительнее. На образование гаплоидов в результате андрогенеза влияют следующие факторы:

Генотип, а также взаимодействие генома и плазмона. Представители ряда семейств (пасленовые, сложноцветные, злаковые и др.) образуют андрогенные гаплоиды с большей частотой по сравнению с другими семействами. Наблюдается значительный полиморфизм по способности к андрогенезу в пределах семейств, родов и видов растений. Возможно выделение генотипов с высоким андрогенетическим потенциалом и передача этого признака в процессе гибридизации. Устанавливаются локализация и наследование генов, ответственных за образование андрогенного каллуса и эмбриоидов. Показано независимое наследование этих процессов. П. А. Орлов (1995) на примере аллозамещенных линий пшеницы показал, что основные этапы морфогенеза в культуре пыльников (дедифференцировка, пролиферация каллуса, индукция эмбриогенеза) осуществляются под совместным контролем ядерных генов и плазмогенов, о чем свидетельствует усиление или ингибирование морфогенетических процессов при замещении собственной цитоплазмы вида растений на чужеродную.

Физиологические факторы андрогенеза. Важными для успешного андрогенеза in vitro являются возраст, физиологическое состояние и условия культивирования растениядонора, стадия развития пыльцы, оптимальная для изолирования пыльников. Выращенные в поле растениядоноры превосходят тепличные; цветки, образовавшиеся в начале цветения, предпочтительнее появившихся позже. Успешному андрогенезу способствует высокая интенсивность освещения при культивировании доноров пыльников. Лучшие результаты обычно получаются при использовании стадии одноядерной пыльцы, однако оптимум для разных видов может варьировать от стадии тетрад до двуядерного пыльцевого зерна. В качестве специального приема, используемого для повышения эффективности андрогенеза in vitro, может служить холодовая предобработка пыльников перед их посадкой на питательную среду. Срезанные бутоны или колосья помещают в холодильную камеру. Для некоторых пасленовых эффективна обработка в течении 2−3 дней при температуре +3 ⁰ С; для мягкой пшеницы и ее гибридов эффективно содержание изолированных колосьев в течение 7−9 суток при +3 ⁰ С; для рапса можно применять предобработку бутонов при температуре + 4 ⁰ С 1−3 дня. А. П. Ермишин (1998) для повышения андрогенетической способности генотипа картофеля предложил ряд специальных приемов: изменение гормонального баланса донорных растений в результате их прививки на томат или обработки экзогенными гормонами (6- БАП, гиббереллин), подсветка растений дугово-ртутными лампами ДРИ -2000;6 при длине дня 16 часов и освещенности 10−15 тысяч люкс.

Условия культивирования пыльников. Пыльники культивируют на агаровых, жидких или двухфазных средах. Двухфазная среда состоит из двух слоев: твердого слоя агаровой среды и тонкого слоя жидкой среды, расположенного сверху. Питательными средами служат среда МурасигеСкуга с половинной концентрацией солей, среда Нич, среда N ₆ и другие. Состав питательной среды отличается более высоким содержанием сахарозы. Для стимуляции андрогенеза часто добавляют ауксины и цитокинины (например 2,4-Д стимулирует андрогенез у пшеницы, кинетин и 2,4-Д — у ячменя). Оптимальная температура культивирования пыльников 25−30 ⁰, условия освещенности — обычно темнота до появления каллусов или эмбриоидов, затем культивирование на свету.

Гиногенез получил меньшее распространение в сравнении с андрогенезом. Тем не менее он успешно применяется для получения гаплоидов у сахарной свеклы, подсолнечника, картофеля, риса, пшеницы, кукурузы, ячменя, табака, хлопчатника, райграса пастбищного. Этот метод может быть использован для получения гаплоидов у мужскистерильных растений. Для получения гиногенных гаплоидов используют неопыленые завязи и семяпочки. Начало растению могут дать яйцеклетка, а также синергиды и антиподы, а также окружающие зародышевый мешок клетки соматических тканей (нуцеллус, интегумент). В этом случае регенеранты могут стать диплоидными или полиплоидными. Гиногенез аналогично андрогенезу может быть прямым и непрямым. В последнем случае эмбриоиды образуются из каллуса. А. М. Свирщевская, В. Е. Бормотов (1994) разработали основные приемы культивирования неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы на питательных средах с 6 БАП, повышенным содержанием меди и сахарозы, а также применением ионообменных смол на стадии адаптации гиногенетических линий, что позволило получить растения с хорошо развитым листовым аппаратом и сформированными корнями. Линии представляют хозяйственную ценность по продуктивности и сахаристости и вовлечены в гетерозисную селекцию сахарной свеклы.

Партеногенез (метод гаплопродюсеров) Суть метода получения гаплоидов на основе партеногенеза заключается в гибридизации нескрещиваемых видов растений, в результате которой вследствие генетической несовместимости происходит элиминация отцовских хромосом и начинает развиваться гаплоидный зародыш. Наиболее успешно отработана методика такого получения гаплоидов у ячменя, где в качестве гаплопродюсера используют вид Hordeum bulbosum (ячмень луковичный) (табл. 1).

Таблица 1. Общая схема получения удвоенных гаплоидных линий Hordeum путем межвидовой гибридизации и элиминации хромосом.

Для получения гаплоидов у пшеницы и овса используют в качестве гаплопродюсера кукурузу. Опыленные колосья обрабатывают раствором 2,4-Д для оптимизации условий развития зародышей.

Регенеранты, полученные одним из методов, описанных выше (андрогенез, гиногенез, партеногенез), различаются по генотипу и фенотипу. Изменчивость, проявляющаяся при получении гаплоидов, называется гаметоклональной. Наиболее частое проявление такой изменчивостиальбинизм растений, вызванный хлорофиллдефектностью. Такие растения не способны к фотосинтезу и могут культивироваться только в условиях in vitro. Возможные причины альбинизмамутации ядерных или пластидных генов. Альбинизм чаще проявляется у андрогенных гаплоидов и реже — у гиногенных.

При получении гаплоидов среди регенерантов могут возникнуть полиплоиды, дигаплоиды, анеуплоиды, миксоплоиды. Андрогенные полиплоидные растения могут быть гомои гетерозиготными. Гетерозиготные полиплоиды и диплоиды развиваются из микроспор, имеющих нередуцированное число хромосом. Образование гомозиготных диплоидных растений (дигаплоидов) при андрогенезе происходит из гаплоидных микроспор. В связи с частой цитогенетической изменчивостью при получении гаплоидов необходим цитологический контроль уровня плоидности у полученных растенийрегенерантов. Так, например, А. П. Ермишин (1998) получил широкий спектр цитогенетической изменчивости среди андрогенных регенерантов картофеля. (табл.2.

Табл.2. Анализ хромосомного состава растений-регенератов, полученных в культуре пыльников картофеля.

По хромосомному составу растениярегенеранты подразделялись на четыре группы: 1) дигаплоиды (2х=24) и анеуплоиды с числом хромосом, близким к 24;

2) триплоиды (3х=36) и соответствующие анеуплоиды; 3) тетраплоиды (4х=48) и соответствующие анеуплоиды; 4) химерные формы, имеющие клетки с различным уровнем плоидности. Доли каждой из трех первых групп были приблизительно одинаковы, химер — несколько меньше. Доля дигаплоидов составила 12−15%.

Изменчивость среди гаплоидных регенерантов по хозяйственно-ценным признакам можно повысить, если использовать для получения гаплоидов не константный материал, а гибриды F₁. Образующиеся гаметы у гибридов F₁ в результате рекомбиногенеза будут нести различные комбинации генов родителей. Перевод полученных гаплоидов на диплоидный уровень позволит быстро использовать широкий спектр изменчивости у константных дигаплоидов. Получение дигаплоидов от гаплоидов возможно спонтанно или путем использования колхицина. Первый путь предпочтительнее, поскольку упрощает процесс получения дигаплоидов. Использование гаплоидов, полученных in vitro получает все большее распространение в селекционной практике. Так, китайские селекционеры создали с применением культуры пыльников новые высокоурожайные сорта риса и пшеницы. Созданные за короткий срок, эти сорта занимают уже большие площади: рис — 170 000 га и пшеница — 70 000 га (Бутенко, 1990). В США получены двойные межлинейные гибриды кукурузы, созданные с участием гаплоидов. Помимо кукурузы, гаплоидию можно эффективно применять в селекции на гетерозис картофеля, люцерны, сорго, сахарной свеклы, подсолнечника, рапса, капусты, моркови и др.).

В Германии получены перспективные формы табака, новые межвидовые и межродовые гибриды зерновых и люпина, более 1000 клонов картофеля. В СНГ на основе гаплопродюсеров созданы два сорта ячменя Исток и Одесский 115 (ВСГИ, Одесса), ведутся интенсивные работы по получению гаплоидов у пшеницы (Саратовский ГУ), тритикале, рапсу (Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Бел НИИ земледелия и селекции), картофелю (НИИ картофельного хозяйства, Россия; Институт генетики и цитологии НАН Беларуси) и др.

Гаплоидия может быть успешно использована для преодоления межвидовой несовместимости у видов с разным уровнем плоидности. Так, например, дикие виды картофеля являются диплоидными, в то время как культурный картофель — тетраплоид. Получение дигаплоидов от тетраплоидов, вовлечение их в гибридизацию с дикими диплоидными видами, отбор ценных форм и последующее восстановление у них тетраплоидного уровня представляет интерес для селекции картофеля. А. П. Ермишиным (1990) предложена оригинальная схема гетерозисной селекции картофеля с использованием оценки комбинационной способности дии тетраплоидных родителей. Вегетативный способ размножения культуры позволяет закрепить достигнутый гетерозисный эффект.