Белковые вещества. 
Предмет и задачи биохимии

Лекция 2. Общая характеристика белков и аминокислот

1. Строение, классификация и свойства аминокислот

Белки — это высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, состоящие из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Иными словами белки — это полимеры, мономерами которых являются аминокислоты. Белки построены из сотен или тысяч аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями. Разнообразие существующих в природе белков зависит от особенностей аминокислотного состава, количества аминокислотных остатков и порядка их сочетания.

1. Общая характеристика аминокислот

Всего в природе обнаружено около 300 аминокислот. По способности входить в состав белков аминокислоты бывают:

• 1) Протеиногенные (протеин — белок; генезис — дающий, рождающий). Количество белковых, или протеиногенных аминокислот, составляет относительно невелико: в живых организмах имеется 20 основных протеиногенных аминокислот. Помимо стандартных 20 аминокислот, в белках встречаются и модифицированные аминокислоты, которые являются производными обычных аминокислот.
• 2) Непротеиногенные (в состав белков не входят); бывают б, в и г.

Примеры:

• · в-аланин (входит в состав витаминов В₃);
• · г-аминомасляная кислота (участвует в передаче нервного импульса; участвует в цикле обезвреживания аммиака).

В виде очищенных препаратов белковые (протеиногенные) аминокислоты представляют собой белые кристаллические вещества: сладкие, горькие или не имеющие вкуса.

Все белковые аминокислоты являются б-аминокислотами с характерной общей структурной особенностью: наличием карбоксильной и аминной групп, связанных с атомом углерода в б-положении.

Помимо карбоксильной и аминогрупп, каждая аминокислота имеет радикал, который у разных аминокислот неодинаков по структуре, электрическому заряду и растворимости.

2. Классификация протеиногенных аминокислот

Существует несколько классификаций протеиногенных аминокислот, в основу которых положены разные критерии. Рассмотрим лишь некоторые из них:

Классификация по электрохимической природе радикала ®:

• а) неполярные аминокислоты (их 8) — гидрофобные (нерастворимые в воде): аланин (ала); валин (вал); лейцин (лей); изолейцин (иле); пролин (про); фенилаланин (фен); триптофан (три); метионин (мет);
• б) полярные аминокислоты (их 12) — растворяются в воде; в свою очередь они делятся на:

незаряженные (их 7): глицин (гли); серин (сер); треонин (тре); цистеин (цис); тирозин (тир); аспарагин (асп); глутамин (глн);

заряженные отрицательно (их 2): аспарагиновая кислота (асп); глутаминовая кислота (глу);

заряженные положительно (их 3): лизин (лиз); гистидин (гис); аргинин (арг).

Классификация по способности синтезироваться в организме человека и животных:

• а) незаменимые (не синтезируются в организме, поэтому должны поступать с пищей, их 8): валин, лейцин, изолейцин, триптофан, фенилаланин, метионин, треонин, лизин);
• б) заменимые (синтезируются в организме) — их 12.
• 3. Биологическая роль аминокислот

Помимо того, что аминокислоты являются структурными блоками белков, они используются в живых организмах для синтеза разнообразных веществ. Разные аминокислоты (как протеиногенные, так и непротеиногенные) являются предшественниками пептидов, азотистых оснований, гормонов, витаминов, нейромедиаторов, алкалоидов и других важнейших соединений. Так, например, из триптофана синтезируются витамин РР (никотиновая кислота) и серотонин, из тирозина — такие важные гормоны, как адреналин, норадреналин, тироксин. Из аминокислоты валин образуется витамин В_{3 (}пантотеновая кислота). Аминокислота пролин является соединением, защищающим живые клетки от многих стрессов (в том числе, окислительного).

• 4. Уровни организации белковых молекул
• (структура белков)

Существует 4 уровня организации белковых молекул:

Первичная структура

Первичная структура белка представляет собой полипептидную цепь, состоящую из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями:

кетоформа енольная форма Пептидная связь характеризуется следующими свойствами:

• 1) атомы О и Н пептидной связи имеют трансориентацию;
• 2) четыре атома пептидной связи лежат в одной плоскости, т. е. для пептидной связи характерна компланарность;
• 3) пептидная связь в молекуле белка проявляет кето-енольную таутомеризацию;
• 4) длина C-N-связи, равная 0,13 нм, имеет промежуточное значение между длиной двойной ковалентной связи (0,12 нм) и одинарной ковалентной связи (0,15 нм), из чего следует, что вращение вокруг оси C-N затруднено;
• 5) пептидная связь прочнее обычной ковалентной, т.к. она является полуторной (из-за перераспределения электронной плотности).

Для каждого индивидуального белка последовательность аминокислот в полипептидной цепи является уникальной. Она определяется генетически и в свою очередь определяет более высокие уровни организации данного белка.

Аминокислотный остаток, находящийся на том конце цепи, где имеется свободная аминогруппа, называется аминоконцевым, или N-концевым, а остаток на другом конце, несущем свободную карбоксильную группу, — карбоксиконцевым, или С-концевым. Название полипептида начинается с N-конца.

Вторичная структура

Вторичная структура белка представляет собой способ укладки полипептидной цепи в упорядоченную форму за счет системы водородных связей. Полипептидная цепь самопроизвольно скручивается и приобретает более энергетически выгодную форму. Вторичная структура белков имеет две основные разновидности:

1) б-спираль (как правило, правозакрученная); стабилизируется между кислородом карбонильной группой и водородом аминогруппы.

Между Н и О образуется водородная связь. Она слабая, но поскольку этих связей много, то эта структура устойчивая. Каждая пептидная группа участвует в образовании 2-х водородных связей.

Гидрофильные радикалы R оказываются наружу, а гидрофобные радикалы R¹ находятся внутри спирали (прячутся внутрь от растворителя).

2) в — складчатый слой. При образовании этой структуры несколько полипептидных цепей, не сворачиваясь в б-спираль, связываются межцепочечными водородными связями. Например, такой структурой обладают в-кератины (входят в состав шелка). в-складчатая структура возникает между смежными полипептидными цепями. Складчатые листы могут быть образованы параллельными (N-концы направлены в одну сторону) и антипараллельными полипептидными цепями (N-концы направлены в разные стороны).

При взаимодействии между собой вторичных структур может образовываться сверхвторичная структура (суперспираль). Например, суперспирализованная б-спираль встречается в фибриллярных белках.

Третичная структура

Третичная структура белков представляет собой глобулу и характерна для глобулярных белков. На третичном уровне организации возникает активный центр и белок приобретает функциональную активность.

Связи, стабилизирующие третичную структуру:

• 1) дисульфидная (возникает между радикалами цистеина; эта связь прочная, но способна легко восстанавливаться);
• 2) ионная (образуется между заряженными радикалами аминокислот);
• 3) водородная (возникает между радикалами полярных аминокислот);
• 4) изопептидная (образуется между карбоксильной и аминогруппой радикала);
• 5) гидрофобное взаимодействие (между гидрофобными аминокислотами).

У глобулы полярные радикалы в гидратированном состоянии находятся снаружи, гидрофобные радикалы внутри.

В пределах глобулы часто выделяют домены — участки полипептидной цепи, которые самостоятельно от других участков той же цепи образуют структуру, во многом напоминающую глобулярный белок. В пределах одной полипептидной цепи может встречаться несколько доменов.

Четвертичная структура

Четвертичная структура характерна только для олигомерных белков (олигомерные белки — белки, состоящие из нескольких полипептидных цепей).

Протомер — полипептидная цепь в составе олигомерного белка.

Четвертичная структура — характерный способ расположения протомеров олигомерного белка. Активный центр возникает при объединении протомеров.

К примеру, четвертичной структурой обладает гемоглобин — белок крови, содержащийся в эритроцитах (переносит кислород); его молекула имеет 2б — и 2 в-протомера.

Биологический смысл образования четвертичной структуры.

• 1) Экономия биологического материала (ДНК, РНК).
• 2) Сведение к минимуму ошибок синтеза.
• (пример: допустим, в белке 100 тыс. аминокислот; а вероятность ошибки — 1 аминокислота на 100 тыс. аминокислот, тогда весь белок будет неактивен).
• 3) Существование четвертичной структуры позволяет регулировать активность ферментов.

Ферменты-специфические белки, выполняющие функции катализаторов: А >В (допустим, что продукт реакции В накапливается). Тогда он связывается с ферментом и изменяет взаимодействие протомеров; в результате этого белок теряет функциональную активность и реакция прекращается.

Таким образом, молекулы белков характеризуются определенной конформацией — пространственной структурой молекулы.

Нативная конформация — структура молекулы, в которой молекула существует в организме и функционирует (эта структура наиболее энергетически выгодна и стабильна).

Поскольку все уровни организации белковой молекулы определяются последовательностью аминокислот на первичном уровне, то полипептидная цепь способна восстанавливать нативную конформацию.

5. Классификация белков

До сих пор не существует единой, строго научной классификации белков, с помощью которой можно было бы их систематизировать. Поэтому используется несколько разных классификаций.

По составу белки делят на:

Простые — белки, состоящие только из аминокислот и при гидролизе распадающиеся соответственно только на аминокислоты. По характеру растворимости эти белки можно разделить на следующие группы:

• 1. Альбумины — белки, растворимые в воде. Альбумины легко высаливаются из водных растворов с помощью солей. Они широко распространены в органах и тканях животных и растений.
• 2. Глобулины — нерастворимы в чистой воде, но растворяются в слабых водных растворах различных солей. Обычно в качестве растворителя используют 10% -ный NaС1 или КCl. Глобулины встречаются как в животных, так и в растениях, однако особенно много их в белках семян бобовых.
• 3. Глютелины — белки растительного происхождения, растворимые в растворах щелочей, так как содержат большое количество дикарбоновых аминокислот (глутамат, аспартат). Глютелины содержатся в семенах злаков, у которых они (совместно с проламинами) составляют основную массу клейковины, а также в зеленых частях растений.
• 4. Проламины — белки растительного происхождения, растворимые в 50−70% -ном растворе этилового спирта. Содержат 20−25% глутамата и 10−15% пролина (отсюда название). Проламины встречаются исключительно в семенах злаков, у которых они (совместно с глютелинами) составляют основную массу клейковины.

Сложные — кроме белковой части, содержат небелковую группу.

• 1. Липопротеины (в своем составе содержат липиды).
• 2. Металлопротеины (содержат металлы, к примеру, многие ферменты).
• 3. Нуклеопротеины (содержат нуклеотиды).
• 4. Гликопротеины (содержат углеводы).

Липо — и гликопротеиды входят в состав мембран клеток.

По конформации белки делят на:

Фибриллярные — состоят из параллельно расположенных полипептидных цепей, которые образуют волокна-фибриллы. Очень прочные, нерастворимые в воде. Выполняют структурную функцию (соединение тканей животных). Примеры: коллаген (кости), б-кератины (волосы, ногти).

Глобулярные — имеют форму глобулы, растворимы в воде. Выполняют динамическую функцию (движение веществ). Примеры — ферменты, гормоны, антитела, транспортные белки.

Промежуточные белки — имеют форму фибриллы, но растворимы в воде. К примеру, миозин, фибриноген.

По количеству полипептидных цепей белки делят на:

Мономерные (состоят из одной полипептидной цепи).

Олигомерные (состоят из нескольких полипептидных цепей).

По пищевой ценности белки делят на:

Сбалансированные (полноценные); содержат все незаменимые кислоты в нужных человеку пропорциях. К ним относятся белки животного происхождения (мясо, рыба, молоко).

Несбалансированные; незаменимые аминокислоты отсутствуют, либо их очень мало. К ним относятся белки растительного происхождения (за исключением сои, амаранта).

По выполняемым функциям белки делят на:

Ферментативные (каталитически активные; только белки способны выполнять эту функцию).

Структурные (входят в состав клеточных мембран).

Строительные (например, коллаген, который входит в состав костного вещества; кератин, который входит в состав ногтей и волос).

Транспортные (транспортируют различные вещества, например, белок гемоглобин переносит кислород).

Защитные (например, такие белки, как антитела, обеспечивают защиту от инфекций).

Регуляторные (например, гормоны — регулируют обмен веществ).

Запасающие, или резервные (белки семян, яиц).

Сократительные (такие белки мышечных волокон как актин и миозин).

Кроме того, белки, а точнее, образующиеся при их гидролизе аминокислоты, при полном расщеплении способны давать некоторое количество энергии. Однако энергетическая функция не является основной для белков и аминокислот.

Лекция 3. Основные свойства белков и методы разделения белков и аминокислот

• 1. Основные свойства белков
• 1. Физико-химические и химические свойства белков отличаются исключительным разнообразием
• 1. Кислотно-основные (амфотерные) свойства. Определяются главным образом ионизируемыми R-группами пептидной цепи. В зависимости от реакции растворителя белок будет диссоциировать либо как кислота (в щелочном растворе), либо как щелочь (в кислом растворе). Поэтому в щелочном растворе молекулы белка будут заряжены отрицательно, а в кислом — положительно. Для каждого белка характерно определенное значение рН, соответствующее изоэлектрической точке, при которой белок остается неподвижным в электрическом поле. При значениях рН, лежащих выше изоэлектрической точки, белок несет суммарный отрицательный заряд, а при значениях рН ниже изоэлектрической точки — суммарный положительный.
• 2. Растворимость белков в воде. Характерна для глобулярных белков, в то время как фибриллярные белки являются гидрофобными. Как правило, растворимость в воде минимальна в их изоэлектрической точке. Она повышается по мере уменьшения ионной силы раствора и понижается при увеличении концентрации нейтральных солей (высаливание). При изоэлектрической точке наблюдается также наименьшая вязкость белковых растворов и наиболее легкое осаждение белка из раствора.
• 3. Гидролиз пептидных связей. В живых клетках он осуществляется при участии протеолитических ферментов (протеаз).
• 4. Оптические свойства. Заключаются в способности вращать плоскость поляризации света, рассеивать световые лучи ввиду значительных размеров белковых частиц и поглощать ультрафиолетовые лучи (оптические свойства белков используют при их количественном определении, измерении молекулярной массы и т. д.).
• 5. Гидрофильность белков. Вследствие того, что при образовании пространственной структуры белков гидрофобные радикалы аминокислот прячутся внутрь молекулы, а полярные, как правило, оказываются на поверхности, белки при взаимодействии с водой окружаются гидратной оболочкой и набухают. Набухание зерна при замочке, кондиционировании и прорастании, набухание белков муки при изготовлении теста, образование студней при добавлении желатины к различным кондитерским изделиям — все эти процессы тесно связаны с набуханием белков.
• 6. Способность белковых растворов превращаться в коллоидные системы — гели. В гелях растворитель и белок образуют одну внешне гомогенную массу, подобную студню. Гели обладают рядом физических свойств, характерных для твердого вещества. Свойства геля зависят от наличия в нем как бы своеобразного скелета, состоящего из белковых молекул. В гелях имеется гидратационная вода, окружающая толстым слоем коллоидные частицы белка, а также вода, удерживаемая в капиллярных пространствах между ними.
• 7. Набухание геля — способность поглощать и удерживать большое количество воды (впитывание воды). Сопровождается увеличением его объема и сильным давлением. Набухание геля зависит от концентрации водородных ионов и от присутствия солей. Минимальное набухание наблюдается при изоэлектрической точке данного белка. Явление, обратное набуханию, — отделение воды от геля — называется синерезисом.
• 8. Денатурация — изменение уникальной структуры нативного белка, сопровождающееся потерей характерных для него свойств: растворимости, биологической активности, электрофоретической подвижности. Денатурация может вызываться повышением температуры, РН, механическим воздействием, излучением. Денатурация, как правило, затрагивает третичную и частично вторичную структуры белковой молекулы и не сопровождается какими-либо изменениями первичной структуры. При определенных условиях денатурированный белок можно частично или полностью вернуть к исходному состоянию. Такой белок называют ренатурированным. Денатурация белков имеет большое значение в явлениях жизни. Она сопровождается параллельно идущими изменениями гидрофильности белков и их способности к взаимодействию с другими веществами. Так, по мере старения организма происходит постепенная денатурация белков и снижение их гидрофильности. Пример подобной необратимой денатурации — это старение семян, которые, даже при наиболее благоприятных условиях хранения, через определенный срок теряют способность к прорастанию; при этом одновременно происходит уменьшение гидрофильности белков. Весьма важную роль играет процесс обратимой денатурации белков — переход глобулярных белков в фибриллярное состояние и обратные превращения. Возможно, что именно с подобными обратимыми превращениями белков, сопровождающимися изменениями их гидрофильности и реактивности, теснейшим образом связаны такие явления, как завядание растений, движение протоплазмы. Денатурация белков происходит в целом ряде процессов пищевой промышленности: при выпечке хлеба и кондитерских изделий, при сушке макарон, овощей, молока или яичного порошка, при изготовлении консервов.
• 9. Осаждаемость — способность белков осаждаться под действием солей, ионов тяжелых металлов и органических растворителей. Водная оболочка, имеющаяся вокруг белковой глобулы, способствует устойчивости белковых растворов и препятствует осаждению белка. Если отнять у белковых глобул связанные с ними молекулы воды (дегидратация) и уменьшить таким образом их гидратацию, то они начнут слипаться, образуя более крупные частицы белка, и в конце концов будут оседать из раствора. Каждый индивидуальный белок разделяемой смеси осаждается из нее при определенной концентрации той или иной соли, в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Процесс осаждения белка из раствора под действием солей называется высаливанием.
• 10. Качественные (цветные) реакции. Обладая аминокислотными радикалами различной химической природы, белковые молекулы способны давать широкий круг реакций. При взаимодействии белка с отдельными химическими веществами возникают окрашенные продукты реакции, образование которых обусловлено наличием в молекуле белка той или иной аминокислоты или химической группировки. Поэтому так называемые цветные реакции на белки часто используют для установления белковой природы вещества, изучения аминокислотного состава различных природных белков, количественного определения белков, количественного определения в белке той или иной аминокислоты.
• 2. Выделение белков из биологического материала

Хотя около двух десятков белков удалось синтезировать, синтезы эти очень сложны, трудоемки, длительны и дороги. Поэтому единственно реальным методом получения белков служит их выделение их из природных источников. Познание строения белка — одна из актуальных проблем современности. На ее решении сосредоточены совместные усилия специалистов различных наук: биологии, физики, химии и математики.

Установить строение природного белка очень трудно вследствие сложности структуры, высокой молекулярной массы и чувствительности белковой молекулы к внешним воздействиям, приводящей к необратимым изменениям его строения. Это ограничивает выбор средств исследования строения белка. Весьма ответственной операцией является очистка белка с целью удаления воды и примесей минеральных солей.

Впервые белок (клейковина) был выделен Я. Беккари из пшеничной муки в 1728 году. Эту дату принято считать годом зарождения химии белка.

Аминокислотный состав белка устанавливают методом его гидролиза кислотами, щелочами или ферментами. Широко применяется кислотный гидролиз (80% -ная серная или 20% -ная соляная кислота), протекающий наиболее полно.

Для определения аминокислотного состава белка применяют различные физико-химические методы, например, распределительную и ионообменную хроматографию.

Выделение белков из какого-либо биологического материала (семян, листьев, плодов и т. д.) заключается в экстрагировании их тем или иным растворителем после измельчения этого материала. В качестве растворителей применяются вода, солевые растворы, водно-спиртовые растворы, слабые кислоты и щелочи. Полученный раствор белка затем обрабатывается тем или иным способом — нагревается, насыщается солями и диализируется, насыщается спиртом или ацетоном, нейтрализуется. При этом из раствора выделяется соответствующая фракция белков, которая отделяется и высушивается, причем последняя операция обычно осуществляется путем проведения препарата белка через спирт все возрастающих концентраций.

С помощью этих методов получено и исследовано огромное количество белков растительного и животного происхождения. Однако за последние годы стало очевидно, что применявшиеся ранее методы выделения белков весьма несовершенны. Установлено, что эти методы в большинстве случаев приводят к большей или меньшей денатурации белков. Вместе с тем было показано, что белки, считавшиеся ранее индивидуальными, однородными, в действительности представляют собой смеси или комплексы, состоящие из нескольких белков, различающихся по своим физическим, химическим и биологическим свойствам.

Эти результаты были получены благодаря новым принципам и методам выделения и исследования однородности белков, разработанным на различных белках животного происхождения, в первую очередь, на белках плазмы крови.

Какие же условия выделения обеспечивают получение неденатурированных препаратов белка?

Поддержание возможно более низкой температуры на всех этапах получения препарата белка. Установлено, что наилучшей является температура, близкая к температуре замерзания растворителя, применяемого для экстрагирования белков.

Поддержание рН на соответствующем уровне, близком к нейтральной реакции или же к изоэлектрической точке данного белка.

Таким образом, применение кислот и щелочей для экстрагирования белков недопустимо. Органические растворители — спирт и ацетон, применяемые для осаждения и сушки белков, могут вызвать их глубокую денатурацию, сопровождающуюся потерей растворимости и свойственной им ферментативной активности. Это можно наблюдать при осаждении какого-либо из растительных водорастворимых белков при помощи спирта или ацетона — белок становится совершенно нерастворимым в воде и теряет многие из свойственных ему ферментативных функций.

Однако осаждение белков органическими растворителями не вызывает денатурации при условии, если эта операция проводится при низких температурах (-3 или — 5? С).

3. Методы разделения белков и аминокислот

Исследование однородности белковых препаратов и выделение отдельных белковых фракций производится с помощью различных методов, наиболее важные из которых основаны на применении ультрацентрифугирования, электрофореза, хроматографии, а также на изучении растворимости белков.

• 1. Методы разделения белков и аминокислот, основанные на различиях веществ в молекулярной массе:
  • а) ультрацентрифугирование. В ультрацентрифуге сначала осаждаются более тяжелые молекулы, затем менее тяжелые.
  • б) гель-фильтрация. При этом методе хроматографическая колонка заполняется пористыми гранулами сильно гидратированного углеводного полимера, чаще всего сефадекса (специальным образом обработанные производные высокомолекулярного углевода декстрана). При фильтровании через такую колонку смеси низкомолекулярных и высокомолекулярных белков небольшие белковые молекулы, проникая через поры внутрь гранул сефадекса, будут протекать по колонке медленнее, чем белки, молекулы которых не помещаются в порах гранул и поэтому быстрее вытекают из колонки.
• 2. Методы разделения белков и аминокислот, основанные на различиях в их кислотно-основных свойствах (или различия их электрических зарядов):
  • а) метод электрофореза. Смысл электрофореза заключается в разделении находящихся в растворе веществ в электрическом поле на основе различий их электрических зарядов. Электрофоретическое исследование белка производят обычно при нескольких значениях рН, т.к. установлено, что если при одном рН препарат белка ведет себя как однородное вещество, то при другом рН этот же препарат может быть неоднородным.

За последние годы широкое распространение получил электрофорез растворов белков и пептидов на различных носителях — фильтровальной бумаге, целлюлозном или крахмальном порошке, полиакриламидном геле. Эти методы позволяют анализировать чрезвычайно малые количества белков.

б) диск-электрофорез в полиакриламидном геле, при котором смесь белков подвергается одновременному воздействию электрического поля и градиента рН. Он обладает особенно высокой разрешающей способностью.

Фильтрование через гель, так же как и электрофорез в полиакриламидном геле, широко применяется для быстрого приблизительного определения молекулярной массы белков.

в) ионообменная хроматография. В ионообменной хроматографии в качестве носителя используются полимеры, несущие на себе заряд — ионообменные смолы:

катионообменные смолы (заряженные отрицательно) — обмениваются катионами;

анионообменные смолы (заряженные положительно) — обмениваются анионами.

Например, часто используется катионообменная полистероидная сульфированная смола. Если раствор аминокислот имеет кислую среду, при загрузке колонки положительно заряженные аминокислоты и белки вытесняют натрий и соединяются с сульфид-анионом. При добавлении гидрооксида натрия рН увеличивается; когда рН достигнет значения, равного изоэлектрической точке молекулы белка, аминокислоты теряют заряд и становятся нейтральными. Под действием силы тяжести аминокислота выходит из колонки, потеряв заряд. Разные белки (аминокислоты) имеют разные значения изоэлектрических точек.

• 3. Методы разделения, основанные на различиях в веществ по растворимости:
  • а) метод фракционирования белков солевыми растворами. Основан на том, что каждый индивидуальный белок разделяемой смеси осаждается из нее при определенной концентрации той или иной соли, в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Процесс осаждения белка из раствора под действием соли называется высаливанием. При дальнейшем насыщении солью выпадает следующий индивидуальный белок и, таким образом, можно один за другим выделить относительно чистые индивидуальные белки.
  • б) распределительная хроматография на бумаге. Этот метод основан на различной степени распределения компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами (подвижной и неподвижной) и заключается в том, что каплю гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, один конец которой опускают в органический растворитель. Растворитель под действием капиллярных сил всасывается бумагой и, проходя по полоске бумаги, увлекает за собой аминокислоты.

Скорость перемещения аминокислот по бумаге зависит от их химического строения и способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителях. В качестве подвижного растворителя используют водонасыщенный фенол, n-бутиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают бумагу. Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость, например, в феноле, тем быстрее они движутся вслед за фронтом органического растворителя.

4. Определение первичной структуры белка

Наиболее ответственной процедурой при установлении первичной структуры белков является определение последовательности аминокислотных остатков. В настоящее время эту работу ведут преимущественно либо фенилизотиоцианатным методом Эдмана.

Метод Эдмана реализуется в специально созданном для этой цели приборе, получившем название секвенатор (от sequence — последовательность). Метод Эдмана сводится к обработке фенилизотиоцианатом белка или пептида, присоединенного через С-концевую аминокислоту к инертному носителю (полистиролу или пористому стеклу) в колонке секвенатора. После промывки колонки растворителями (метанол, дихлорэтан) образовавшийся фенилтиокарбамилпептид подвергают воздействию безводной трифторуксусной кислоты, в результате чего высвобождается анилинотиозолинон и в его составе N-концевая аминокислота, а укороченный на один аминокислотный остаток пептид или белок остается связанным с носителем.