Дедифференцировка и каллусогенез как основа создания пересадочных клеточных культур

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Значительно реже культивируют клетки опухолей растений разного происхождения. Культуры опухолевых клеток при поверхностном и глубинном выращивании мало отличаются внешне и на уровне морфологии клеток от культур каллусных клеток. Значительным физиологическим различием между ними является гормононезависимость опухолевых клеток, позволяющая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Опухолевые клетки лишены также способности дать начало нормально организованным структурам — корням или побегам в процессе органогенеза и эмбриоидам в процессе соматического эмбриогенеза. В некоторых случаях они образуют тератомы (уродливые органоподобные структуры), нормальное развитие которых дальше не происходит.

Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести гормононезависимость. Природа такой гормононезависимости к одному или обоим гормонам (ауксину и цитокинину), применяемым при выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормононезависимость клетки). При генетической гормононезависимости каллусные клетки ведут себя так же, как опухолевые, при эпигенетической они теряют признак гормононезависимости в ряду превращений клетка — растение — клетка, что и является доказательством негенетической природы такой приобретенной гормононезависимости.

Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей разных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду in vitro в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий. Для этого с помощью растворов, содержащих активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экспланты, тщательно отмывая их затем от употребляемого раствора стерильной водой. Стерилизуют в автоклаве или фильтрованием через ультрафильтры питательную среду. В автоклаве при давлении 19,6- 104 Па (2 атм) в течение 1 ч или сухим паром в шкафах при 160 °C в течение 1,5 ч стерилизуют посуду, инструменты, материалы, необходимые для работы. Манипуляции с культурами проводят в боксах микробиологического типа, облучаемых перед работой ультрафиолетом, или в ламинар-боксах, где асептика достигается постоянной подачей стерильного воздуха в рабочий объем (Р. Г. Бутенко, 1964).

Особенности дедифференцировки клеток экспланта и каллусогенеза зависят от эпигенетических характеристик составляющих его тканей. Клетки тканей запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла листа и других специализированных тканей, эксплантированных на питательную среду, содержащую минеральные соли, источники углерода, витамины и гормоноподобные вещества, должны дедифференцироваться, т. е. потерять структуры, характерные для их специфических функций в растении и вернуться к состоянию делящейся клетки. На рис. I изображены фазы клеточного цикла и показано, в каких из них клетки могут выйти из цикла деления (митотического цикла) и перейти в дифференцированное состояние и соответственно вернуться в цикл при дедифференцировке и индукции их к делению.

В большинстве случаев клетки переходят к. специализации из фазы G1, предшествующей S-фазе, в которой происходит центральное событие в делении клетки — синтез ДНК, специализированные клетки возникают редко в результате выхода клеток из цикла деления после репликации ДНК, в G2-фазе.

гормононезависимость каллусный клетка эксплант.

При изучении молекулярных механизмов дедифференцировки, действия гормонов и других факторов, индуцирующих деление, небезразлично, в какой фазе клеточного цикла данная клетка перешла к дифференцировке, т. е. с какой фазы ей предстоит двигаться повторно по циклу. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. Так, взятый целиком фрагмент стебля имеет в своем составе клетки — эпидермальные, первичной коровой паренхимы, камбия и сосудистой системы, сердцевинной паренхимы. В разных условиях культивирования и в зависимости от различий в физиологическом состоянии исходного растения можно наблюдать преимущественную пролиферацию клеток камбия и его молодых дериватов, коры и сердцевинной паренхимы. Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани, так как некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации или эпигенетически наследуемые признаки.

В клетках экспланта, состоящего из неделящихся, специализированных клеток, в самом начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматическими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к процессу деления. Для разделения этих процессов можно рекомендовать прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в течение 3—6 суток. Это позволяет исключить не только изменения, связанные с травмой, но и возможное не контролируемое влияние эндогенных гормонов экспланта на изучаемые процессы. При соблюдении указанного условия становится ясной роль в индукции клеточного деления фитогормонов группы ауксинов и цитокининов, дедифференцировке специализированных клеток и в поддержании каллусных клеток в делящемся состоянии, приводящем к образованию первичного каллуса. При этом наблюдаются сложные взаимодействия между ауксинами и цитокининами. Присутствие в среде одного ауксина определяет переход специализированной клетки из покоящейся фазы Go к вступлению в 5-фазу клеточного цикла.

Однако для завершения фазы синтеза ядерной ДНК, синтеза белков, стимулирующих переход клеток к митозу и цитокинезу, необходимо добавление к среде кинетина или другого цитокинина.

В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех форм РНК, исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменениях в активности генов и белкового аппарата клеток при дедифференцировке.

После помещения на питательную среду меристемы стебля томатов наблюдалось прекращение митозов, свойственных ткани in vivo, клетки дедифференцировались, увеличивались в объеме, теряли характерную для стематической клетки форму, изменялась структура ядра и цитоплазмы и только после этого в них происходило деление, приводящее к формированию каллусной ткани.

Образование каллуса не во всех случаях связано с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть в результате пролиферациивнутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Примером каллуса, не связанного с травмой, является каллусогенез, наблюдающийся в культуре изолированного пыльника. Гаплоидная микроспора, проявившаяся в результате мейоза, при культивировании пыльника in vitro отклоняется в ряде случаев от нормального процесса микроспорогенеза, ее ядро индуцируется к повторным делениям, а сама клетка дедифференцируется и превращается в каллусную. Образование каллуса при эксплантировании фрагмента ткани в условиях in vitro свойственно двудольным и однодольным покрытосеменным и голосеменным растениям, папоротникам, мхам, печеночникам.

Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4—6 недель (в зависимости от темпов роста), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Размер транспланта (переносимого кусочка) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно колеблется от 60 до 100 мг массы ткани на 30—40 мл питательной среды.

Резюмируя, можно отметить, что техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную, пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интактного растения. Клетки различно дифференцированные (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу дедифференцнации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус.

В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.