Количественная оценка энергии тимоцитов до и после воздействия ЭПО

В целом митохондриальная активность клетки определяется числом энергизированных митохондрий (n_мх) и уровнем их ПП.

Если после предварительной инкубации тимоцитов с ЭПО в клетках возросло число яркофлуоресцирующих митохондрий (при одинаковых условиях последующей инкубации этих клеток с ДСМ), значит, соответственно увеличивалась суммарная свободная энергия (), запасаемая в ПП митохондрий, которую можно оценить по данным экспериментов с тимоцитами (см. главу 4).

Согласно таблице 7.2.1. среднее число митохондрий в тимоцитах после инкубации клеток с ЭПО в среднем (для 27 тимусов) увеличилось на 10 шт.

Таблица 7.2.1. Влияние ЭПО (0,15 мкМ) на число активных митохондрий (N_m и на интенсивность флуоресценцию ДСМ (F) в тимоцитах (средние значения для клеток из 12 тимусов) [25 ].

Следовательно, средняя энергия на клетку возросла в среднем до значений.

.

Как показано выше в главе 1, при активации кальциевого насоса (переноса двух ионов кальция) необходима энергия порядка 47,5 кДж/моль, однако, после деактивации АТФ-аз обратно возвращается энергия порядка 17 кДж /моль, которая затем может использоваться в следующем цикле транспорта кальция. Отсюда следует, что для последующей активации одного кальциевого насоса в лимфоците достаточно 42 кДж/моль, т. е. энергии, выделяемой при гидролизе макроэргической фосфатной связи одной молекулы АТФ В то же время необходимо наличие электрокабеля из нескольких митохондрий, в котором может происходить перераспределение энергии ПП и кальция в процессе распространения сокращения элементов ЦС в тимоците.

Из рассмотренных результатов экспериментов с ЭПО следует, что для индивидуальных тимусов исходная митохондриальная активность и концентрации кальция в цитоплазме тимоцитов могут сильно различаться, что отражается на интенсивности и характере флуоресцентного ответа клеток с ДСМ на действие ЭПО.

Зрелые малые Тхелперы имеют определённый размер с диаметром порядка 7 мкм. Тогда на половине окружности меридиана уместится примерно 10−14 митохондрий размером 0,5 мкм каждая. Действительно как видно на фото число активных МХ-ий в одной цепи, соединяющей полюса стимулированного тимоцита составляет примерно 12 штук. Интересно, что на этом изображении можно видеть волнообразное искривление этой цепочки (с амплитудой в две МХ). Из решения телеграфного уравнения следует, что для запуска волны сокращений после ЭПО-сигнала достаточно две связные митохондрии вблизи поверхности, которые обеспечат включение МЭК после ЭПО-сигнала. протонный митохондриальный кальциевый Остановка движения лимфоцитов при переносе суспензии клеток на стекло (при комнатной температуре) восстанавливает ПП митохондрий, который теперь не тратится на механические сокращения. Этим можно объяснить возгорание флуоресценции ДСМ в большем числе митохондрий (в 25% тимоцитах), что и регистрируется как стимулирующий ЭПО — эффект.

Из опытных данных получим, что средняя суммарная энергия митохондрий на клетку при этом возрастает на:

17(16 — 6) = 170 кДж/моль,.

если не учитывать возможное изменение на каждую митохондрию (. В принципе она должна быстро выравниваться в МЭК.

Это энергия была потрачена: на сигнальные процессы внутри клетки, на сократительные процессы, сопряженные с работой кальциевых насосов.

Из работ других исследователей [8,12]следует, что один элементарный акт сокращения использует свободную энергию гидролиза молекулы АТФ, преобразуя её энергию упругой деформации белка в микрофиламенте.

В этом акте стационарная скорость энергопродукции:

где.

— число тормозящих мостиков, — константа скорости распада тормозящих мостиков.

— длина зоны, в которой мостик развивает тянущую силу, — сила мостика,.

.

энергия гидролиза одной молекулы АТФ в одном элементарном цикле (тратится) Однако, на сегодня не известно какие именно сократительные белки могут участвовать в связывании с комплексом кальций-кальмодулин при стимуляции тимоцитов гормонами. Известно, что микрофиламенты ЦС лимфоцита содержат актин, уже фосфорилированный миозин и тропонин, поэтому предполагается, что процесс сокращения — расслабления микрофиламентов в этих зонах идёт путём скольжения по типу замыкания — размыкания мостиков (как в мышечных клетках: рис.).

Процесс замыкания-размыкания мостиков в сократительном элементе Вопрос о конкретном механизме сокращения белков в тимоцитах требует специальных исследований.

Из рассмотренных результатов экспериментов с ЭПО следует, что для индивидуальных тимусов исходная митохондриальная активность и концентрации кальция в цитоплазме тимоцитов могут сильно различаться, что отражается на интенсивности и характере флуоресцентного ответа клеток с ДСМ на действие ЭПО.

Пороговый уровень энергии, необходимый для запуска волнового процесса в при ЭПО-стимуляции тимоцитов можно оценить из данных экспериментов на тимоцитах с ДСМ (табл.7.2.1): в контроле число активных митохондрий на клетку, имеющий рабочий уровень ПП — 6 шт.

Используя формулу (3) для выбранной рабочей концентрации ДСМ, свободная энергия, запасённая в ПП митохондрий одного тимоцита будет:

= 6×17 = 102 (кДж/моль)

Полученная оценка нижнего порога энергии оказалась порядка величины энергии, выделяемой при гидролизе трёх молекул АТФ, т. е. необходимой для активации двух кальциевых насосов и одного акта элементарного сокращения.

Об инверсии дозы-эффекта ЭПО.

В то же время, как следует из кривых доза-эффект ЭПО (Рис 3.1), при росте дозы ЭПО свыше С_ЭПО > 20 U/мл происходит снижение эффекта стимуляции митохондрий или даже инверсия его. Это может быть связано с повреждением мембран и кальциевых каналов (АТФ-аз), токсическая концентрация кальция в цитоплазме повреждает часть митохондрий и они теряют ПП [3] .

Таким образом, по-видимому, чем больше в Т-хелпере исходно активных митохондрий с высокими ПП, тем эффективнее она реагирует на ЭПО, возбуждая большую площадь поверхности, «включая» в работу все МЭК.

Важно отметить, что впервые на основе такого подхода можно обобщить механизм неспецифических эффектов и других гидрофильных гормонов в не мышечных клетках, для которых характерно наличие МЭК, а именно в Т-хелперах и В-лимфоцитах, а также в макрофагах.

Согласно нашей модели гормональный сигнал ЭПО включает МЭК и активирует подвижность Т-_хелперов в течение первой фазы до 60 мин, при этом не исключено, что начинается и внутриклеточный каскад реакций, вызывающих активацию ядерных процессов и синтез специфических белков (типа лимфокинов), который может реализовываться в последующих фазах (свыше 90 мин).

Известно, что повышенное содержание гормонов в крови могут способствовать аллергической иммунной реакции. По данным наблюдений с зондом ДСМ в крови [2] больных с аллергическим синдромом, как правило, повышена подвижность Т-хелперов. Имеются клинические данные, указывающие на то, что при некоторых патологических состояний ЭПО повышает выход в кровь макрофагов, лимфоцитов, усиливая их миграцию [16.28,29] Эти факты находятся в согласии с нашей моделью ЭПО-стимуляции лимфоцитов гормоном ЭПО.