Апробация IRAP маркеров на основе ретротранспозона Кассандра для проведения анализа генетического полиморфизма в роде Prunus

Введение

. За несколько десятилетий активного использования ДНК-маркеров в генетике, значительно расширился набор используемых маркерных систем. Богатство маркерных систем позволяет проводить оценку генетического разнообразия и филогенетического родства, основываясь на полиморфизме различных участков генома, будь-то сайты рестрикции, точковые мутации, микросателлитная ДНК, гены кодирующие рРНК и т. д. Для увеличения точности и объективности генетического анализа необходимо введение в исследовательскую практику новых маркерных систем (1).

Ретротранспозоны являются важным компонентом, распространенным в большинстве эукариотических геномов. Для них характерен процесс транспозиции без вырезания из генома, обусловленный циклами транскрипции, обратной транскрипции и встраивания новой копии в геном. Данная особенность способствует широкому и равномерному распределению ретротранспозонов на хромосомах (2). Благодаря вышеперечисленным свойствам изучение ретротранспозонов перспективно для разработки новых ДНК-маркеров. В частности существует ряд маркерных систем, таких как RBIP, REMAP, SSAP, RBIP, доказавших свою эффективность в генетических исследованиях на различных биологических объектах (3).

SSAP, IRAP и REMAP являются мультилокусными маркерами, ориентированными на анализ фрагментов ДНК с не идентифицированной локализацией в геноме. В IRAP анализируемые области располагаются между вставками ретротранспозонов. Метод SSAP позволяет анализировать последовательности между сайтом вставки ретротранспозона и сайтом рестрикции, к которому присоединяется специфичный адаптер. Метод REMAP оценивает полиморфизм областей, локализованных между ретротранспозонными вставками и ближайшими микросателлитами. RBIP маркеры, в отличии от выше перечисленных маркерных систем, позволяет определить наличие ретротранспозонной вставки в конкретном локусе. Метод RBIP анализирует, подобно SSR маркерам, единичные специфические локусы с известным месторасположением. Для данных маркерных систем характерен широкий выбор подходов к детектированию продуктов: проведение электрофореза в агарозном и полиакриламидном геле, использование капиллярного электрофореза и микрочипов. Таким образом, применение ДНК-маркеров основанных на полиморфизме ретротранспозонных вставок перспективно в изучении филогении и генетического разнообразия (2).

Одним из крупных и экономически важных таксонов семейства Rosaceae является род Prunus. На формирование отдельных видов в рамках рода оказали влияние процессы полиплоидии, отдаленной гибридизации и интродукция. Перечисленные факторы видообразования способствовали возникновению современного видового богатства и разнообразия Prunus (4). В связи со сложностью эволюционного процесса и видовым разнообразием рода, данный таксон представляет интерес для молекулярно-генетических исследований.

С использованием ДНК-маркеров различной природы были проведены филогенетические исследования, направленные на выявление родственных связей внутри рода Prunus. В частности использовались такие маркерные системы как ITSs, рестрикционный анализ хлоропластной ДНК, RAPD и др. Данные, полученные в ходе молекулярно-филогенетических исследований подтвердили предположения о наличии двух ветвей эволюции рода Prunus Amygdalus-Prunus и Cerasus-Laurocerasus-Padus (5). В свою очередь в эволюционной ветви Amygdalus-Prunus было выявлено 3 основных кластера: один наиболее генетически отдаленный, соответствующий подроду Amygdalus и два более близких по отношению другу к другу, соответствующие секциям Euprunus и Armeniaca (6).

Наибольшую сложность представляет внутривидовая классификация сливы домашней, мировой генофонд которой насчитывает более полутора тысяч сортов. Были предприняты многочисленные попытки внутривидовой систематизации сортов сливы домашней, основанные как на естественных, так и на искусственных системах распределения сортов сливы домашней по группам. Основываясь на морфо-физиологических характеристика в рамках вида слива домашняя было выделено 4 подвидов: слива европейская (венгерки); тернослива; ренклод; мирабель. Однако лишь ограниченное количество сортов сливы домашней можно достоверно отнести к конкретным подвидам исходя из совокупности их признаков (7).

На основе LTRs последовательностях транспозона Кассандра, обнаруженного у сливы домашней (8), были разработаны два IRAP маркера (Cass1 и Сass2). В дальнейшем эффективность разработанных маркеров была продемонстрирована на 8 словацких сортах сливы домашней (9). Кассандра является не автономным ретротранспозоном относящимся группе TRIMs (terminal-repeat retrotransposons in miniature). Данный ретротранспозон включает консервативную область 5S рибосомы и связанные с полимеразой III промотор и терминатор в LTR последовательности. Подобно остальным представителям группы TRIMs Кассандра не обладает рамками считывания для синтеза ретротранспозонных белков (8).

Целью настоящей работы является апробация маркеров Сass1 и Сass2, разработанных на сливе домашней, на сортах персика, сливы русской и алычи и проведение генотипирования 9 отечественных и зарубежных сортов сливы домашней, c последующим анализом полученных данных.

Объекты и методы. В качестве растительного материала для экстракции ДНК использовались молодые листья. Были проанализированы 9 генотипов сливы домашней: Краснодарская, Ренклод Альтана, Милена, Кабардинская ранняя, Герцог, Кубанский карлик, Подруга, Стенлей, Керасий кислая. Так же в исследование были включены два генотипа сливы русской, два генотипа алычи, сорт нектарина Лола и сорт персика Ранний Кубани. ДНК экстрагировалась методом CTAB.

Концентрация компонентов ПЦР-смеси: 1Х буфер, 0,3 мМ dNTP, 3 mM MgCl2, 0,75 mM праймеров (Cass1 или Сass2), 1 ед. ДНК-полимеразы, 20 нг ДНК на одну реакцию. Условия проведения ПЦР-реакции: Для Cass1 — 1 мин предварительной денатурации при 94 С; 32 цикла включающие следующие этапы: денатурация 1 минута 94 С, 1 минута отжиг праймеров при 54 С, 3 минуты элонгация при 72 С; в конце 32 циклов заключительная элонгация при 72 С 10 минут. Для Cass2 — 3 мин предварительной денатурации при 94 С; 32 цикла включающие следующие этапы: денатурация 40 сек при 94 С, 40 секунд отжиг праймеров при 61 С, 2 минуты элонгация при 72 С; в конце 32 циклов заключительная элонгация при 72 С 5 минут.

Электрофорез проводили в 2% агарозном геле в течении 1 часа при напряжении 120 вольт. Статистическую обработку данных проводил с использованием программы DendroUPGMA, доступной на сайте: http://genomes.urv.cat/UPGMA/.

Результаты и обсуждение. По результатам электрофореза продуктов амплификации был установлен полиморфизм используемых в работе маркеров в исследуемой выборке сортов. При оценке данных полученных с применением маркера Cass1 было выявлено 13 фрагментов у 9 генотипов сливы домашней из них 9 полиморфных (Рис. 1).

Рисунок 1 Электрофоретический анализ продуктов амплификации маркера Cass1 (слива домашняя).

Примечание: М — маркер молекулярной массы; 1−8 сорта сливы домашней: 1 Краснодарская, 2 Ренклод Альтана, 3 Милена, 4 Кабардинская ранняя, 5 Герцог, 6 Кубанский карлик, 7 Подруга, 8 Стенлей.

В свою очередь, при общем анализе 15 исследуемых генотипов косточковых было выявлено 19 фрагментов, 17 из которых являлись полиморфными. Для генотипов сливы домашней было выявлено 6 фрагментов обнаруженных только у данного вида. Для двух сортов персика так же были установлены 6 специфических фрагментов, не выявленных у 13 оставшихся генотипов (Рис 2).

Рисунок 2 Электрофоретический анализ продуктов амплификации маркера Cass1(разные виды рода Prunus).

Примечание: М — маркер молекулярной массы. Нектарин: 1- Лола, Персик: 2- Ранний Кубани; Алыча: 3 — Геогджа, 4 — Неберджаевская ранняя; Слива русская: 5- Кубанская комета, 6-Гек; Слива домашняя: 7-Стенлей, 8-Керасий кислая.

Для маркера Cass2 было выявлено 12 полиморфных фрагментов из 17 обнаруженных у генотипов сливы домашней и 22 полиморфных фрагмента у 15 генотипов косточковых из 23. 9 фрагментов были уникальны для сливы домашней, 5 уникальны для сортов персика (Рис. 3 и Рис. 4).

Рисунок 3 Электрофоретический анализ продуктов амплификации маркера Cass2 (разные виды рода Prunus).

Примчеание: М — маркер молекулярной массы. Нектарин: 1- Лола, Персик: 2- Ранний Кубани; Алыча: 3 — Геогджа, 4 — Неберджаевская ранняя; Слива русская: 5- Кубанская комета, 6-Гек; Слива домашняя: 7-Стенлей, 8-Керасий кислая.

Рис. 3 Электрофоретический анализ продуктов амплификации маркера Cass2 (слива домашняя) полиморфизм генотип слива персик

Примечание: М — маркер молекулярной массы. 1 Краснодарская, 2 Ренклод Альтана, 3 Милена, 4 Кабардинская ранняя, 5 Герцог, 6 Кубанский карлик, 7 Подруга, 8 Стенлей.

На основе результатов генотипирования 15 генотипов косточковых по маркерам Cass1 и Сass2 была построена дендрограмма, полученная в ходе кластерного анализа UPGMA, с применением коэффициента Dice. 15 генотипов были разделены на 3 группы, соответствующие происхождению образцов (Рис. 4).

Рис. 4 Дендрограмма UPGMA кластеризации генотипов косточковых, построенная на основе данных генотипирования по IRAP маркерам Cass1 и Сass2.

Наиболее отдаленная группа была представлена двумя сортами персика и нектарина (P. persica). Вторая группа соответствовала диплоидным видам сливы русской (P. rossica) и алычи (P. cerasifera), находящимся в близком генетическом родстве. Все генотипы сливы домашней (Prunus domestica) были отнесены к третей группе. Результаты кластеризации не отразили предполагаемой внутривидовой структуры сливы домашней, основанной на выделении четырех подвидов. Для внутривидового анализа требуется применение большего количества маркеров и более детальное проведение оценки полученных данных.

Исходя из полученных данных, был подтвержден более высокий полиморфизм маркера Cass1 в сравнении с Cass2. Оба маркера дают значительный полиморфизм между генотипами сливы домашней и могут быть использованы как эффективный инструмент в генотипировании представителей данного вида. В процессе апробации маркеров на сортах алычи сливы русской и персика были получены легко интерпретируемые спектры ПЦР — фрагментов. Однако маркер Cass1 не выявил отличий между сортами персика, а исходя из данных по Cass2, генотипы персика отличались по одному локусу.

Заключение

. В данной работе была успешно проведена апробация маркеров Сass1 и Сass2, комплементарных LTRпоследовательностям ретротранспозонa Кассандра, на видах P. persica, P. cerasifera и P. rossica. У всех исследуемых генотипов по двум маркерам были получены ПЦР-продукты. В связи с высоким межвидовым уровнем полиморфизма, использование Сass1 и Сass2 перспективно для проведения дальнейших исследованиях представителей рода Prunus. Для детального внутривидового анализа генотипов сливы домашней на основе отработанных IRAP маркеров в дальнейшем планируется разработка REMAP маркеров.

• 1 Mohan, M. Genome mapping, molecular markers and marker-assisted selection in crop plants / M. Mohan, S. Nair, A. Bhagwat, T.G. Krishna et al. // Mol. Breed. — 1997. — V.3 — P.87−103
• 2 Kumar, A. Plant retrotransposons / A. Kumar, J.L. Bennetzen // Annu. Rev. Genet. — 1999. — V.33 — P.479−532
• 3 Kalendar, R. IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques / R. Kalendar, T. Grob, M. Regina et al. // Theor. Appl. Genet. — 1999. — V.98 — P.704−711
• 4 Zohary D, Is the European plum, Prunus domestica L., a P. cerasifera EHRH. Ч P. spinosa L. allopolyploid? Euphytica, — 1992. — V60, — P75−77.
• 5 Sangtae L. A phylogenetic analysis of Prunus and the Amygdaloideae (Rosaceae) using ITs sequences of nuclear ribosomal DNA / L. Sangtae, W. Jun //American Journal of Botany, — 2001 — V88(1) — P150−160.
• 6 Badenes M.L. Phylogenetic relationships of cultivated Prunus species from an analysis of chloroplast DNA variation / M.L. Badenes, D.E. Parfitt // Theor Appl Genet — 1995 — V90 — P1035−1041
• 7 Витковский В. Л. Плодовые растения мира СПб: Издательство «Лань», 2003. 592 c.
• 8 Kalendar R, J. Tanskanen, W. Chang, et al. Cassandra retrotransposons carry independently transcribed 5S RNA. / R Kalendar, J. Tanskanen, W. Chang et al. // Proc Natl Acad Sci U S A., — 2008 — V.105 — P.5833−5838.
• 9 Senkova S., Utilization of IRAP technique for plums genotypes differentiation. / S. Senkova, J. Ziarovska, M. Bezo et al // Bioscience Research, — 2013. — V.10 (1) — P.01−07