Определение активности эстераз в препаратах мозга и крови

Спектрофотометрические измерения активности эстераз и PON1 в препаратах тканей проводили на спектрофотометре Gilford-250 (England) в кюветах объемом 3 мл и длиной пути луча 1 см при 25oC. Для всех полученных данных вносилась поправка на спонтанный гидролиз субстрата.

Определение активности АХЭ и БХЭ проводили колориметрическим методом Эллмана [459] с использованием 1 мM ацетилтиохолина (АТХ) и 1 мM бутирилтиохолина (БТХ) в качестве субстратов, соответственно, в 0.1 M K-Na-фосфатном буфере pH 7.5 при 25oC в присутс твии 0.33 мМ ДТНБ. При определении активности АХЭ в крови использовали специфический ингибитор БХЭ — 0.02 мM этопропазин (10 минутная преинкубация) [128, 135, 462]. Для снижения интерферирующего влияния абсорбции гемоглобина при 412 нм (е412 = 14 150 M-1 Ч cm-1), длина волны анализа в обоих случаях была изменена на 436 нм (е436=10 600 M-1cm-1) [462]. Количество гемолизованной крови, взятой для анализа, составляло 0.8 — 1 мл.

Определение активности АХЭ и БХЭ в плазме крови и гомогенате мозга проводилось при стандартной длине волны 412 нм и соблюдении вышеописанных условий. Количество плазмы крови человека, взятой для анализа составляло 60 и 10 мкл, плазмы крысы — 15 и 40 мкл, 9S фракции гомогената мозга мыши — 20 и 75 мкл для АХЭ и БХЭ соответственно, и 20 мкл препарата 9S фракции гомогената мозга кур, предварительно разбавленного в соотношении 1:3 рабочим буфером. Реакцию гидролиза начинали внесением субстрата: 40 мкл 75 мМ водного раствора АТХ или БТХ соответственно. Объем рабочего буфера для каждой реакции рассчитывали, исходя из суммарного объема реакционной смеси — 3 мл.

Измерение активности КЭ в цельной крови, плазме и препаратах мозга проводили с 1 мM 1-NA в качестве стандартного субстрата в 0.1 M K-Na-фосфатном буфере, pH 8.0 при 25oC. Измерения проводились при длине волны 322 нм (е322=2200 M-1cm-1) [171, 173, 463−465]. Для элиминирования PON1 и холинэстеразного гидролиза субстрата перед внесением субстрата реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин со специфическими ингибиторами PON1/арилэстераз (2 мM ЭДТА) и холинэстераз (40 µM эзерин) [466]. Количество гемолизованной крови, взятой для анализа, составляло для человека и крысы 1 мл, для мыши 0.8 мл; количество плазмы крысы 15 мкл, плазмы человека 50 мкл; количество 9S гомогената мозга мышей — 60 мкл. Реакцию начинали внесением субстрата 60 мкл 50 мМ раствора 1-NA. Объем рабочего буфера рассчитывался исходя из суммарного объема реакционной смеси равного 3 мл.

Арилэстеразная активность PON1 в крови и плазме оценивалась по скорости гидролиза 4 мМ PhA по накоплению фенола при длине волны 270 нм (е270=1310M-1cm-1) в соответствии с методом KitchenB.I.

Гидролитическая активность определялась спектрофотометрически при 25oC в 0,1 М трис-HCl буфере pH 8,0 в присутствии 1 мМ CaCl2 и специфического ингибитора холинэстераз — эзерина (40 µM, 10-минутная преинкубация) [466]. Количество гемолизованной крови, взятой для анализа, составляло 0.4 — 0.5 мл, количество плазмы — 10 мкл, реакцию начинали внесением субстрата — 300 мкл 40 мМ раствора PhA. Суммарный объем реакционной смеси — 3 мл.

Параоксоназную активность PON1 в плазме человека и крысы оценивали по гидролизу PO (по накоплению 4-нитрофенола) в соответствии с методом Furlong C.E. [468], измерения проводили при длине волны 405 нм (е405=18 050 M-1cm-1) [469]. Для анализа брали 50 мкл плазмы человека и 10 мкл плазмы крысы. Реакцию начинали внесением субстрата — 30 мкл 120 мМ запасного раствора PO в ацетоне (конечная концентрация 1.2 мМ). Суммарный объем реакционной смеси — 3 мл.

Концентрации и объемы реагентов реакционной смеси для проведения измерений активности ферментов суммированы в Таблице 2.2.-1. Измерения проводились в трипликате, результаты представляли в виде mean ± SEM, которые были рассчитаны с использованием программы GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Таблица 2.2. — 1. Реагенты для спектрофотометрического определения активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в кюветах объемом 3 мл.

Активность НТЭ в 9S фракции гомогената мозга мышей и кур определяли дифференциальным методом Джонсона [250] с небольшими модификациями [470] как разность в скорости гидролиза фенилвалерата между образцами, инкубированными в течение 20 мин с 50 мкМ PO (PO-резистентная эстеразная активность) и 50 мкМ PO и 250 мкМ MX (параоксон+мипафокс) — резистентная эстеразная активность, как описано в работе [299].

Раствор фенилвалерата и запасные растворы ингибиторов готовили, как описано выше для препарата ЛиоНТЭ. Запасной раствор PO (2.5 мМ) готовили в ацетоне в день проведения измерений.

Для определения РО-резистентной активности мозга мыши готовили пробу 1: 0.44 мл 50 мМ трис-HCl, 0.2 мМ ЭДТА, рН 8.0 рабочего буфера (рН 8.0), 0.01 мл РО (50 мкМ конечная концентрация PO в пробе), реакцию ингибирования параоксоном начинали внесением 0.05 мл препарата 9S фракции гомогената мозга (0.25 — 0.30 мг белка в пробе). Общий объем пробы 0.5 мл.

Для определения (РО + МХ) — резистентной активности мозга мыши готовили пробу 2: 0.43 мл 50 мМ трис-HCl, 0.2 мМ ЭДТА, рН 8.0, 0.01мл 12.5 мМ раствора МХ в 50 мМ трис-цитратном буфере, рН 6.0 (250 мкМ конечная концентрация MX в пробе), 0.01мл 2.5 мМ раствора РО в ацетоне (50 мкМ конечная концентрация PO в пробе). Реакцию ингибирования начинали внесением 0.05 мл 9S фракции гомогената мозга. Общий объем пробы 0.5 мл. Инкубацию проводили в течение 20 мин при 370. Ингибирование останавливали внесением избытка субстрата — 0.5 мл эмульсии фенилвалерата. Через 20 минут реакцию гидролиза субстрата останавливали внесением 0.5 мл раствора SDS [1% (в/об)] + 4-AAP [0.025% (в/об)]. Через 5 минут добавляли 0.25 мл 0.4% (в/об) водного раствора K3[Fe (CN)6], в результате чего развивалась окраска. Интенсивность окрашивания детектировали на микропланшетном спектрофотометре Bio-Rad Benchmark Plus при длине волны 510 нм. Все измерения проводили в трипликате. Разница между значениями оптической плотности пробы 1 и пробы 2 соответствует активности НТЭ.

ЭлектрохимическоеопределениеактивностиНТЭвкрови.

Активность НТЭ в крови определяли дифференциальным методом согласно Johnson M.K. [250] с электрохимической детекцией на потенциостатической системе IPC-2000 (Институт физической химии РАН, Москва, Россия) [316]. Работа проводилась на базе химического факультета МГУ в лаборатории Постгеномной химии кафедры химической энзимологии.

Для измерения активности НТЭ в крови каждый образец крови (гемолизат 1:100 в 50 мМ Трис-HCl, 0.2 мМ ЭДТА, рН 8.0 рабочем буфере) в количестве 0.3 мл инкубировали при 37oC с 50 мкM РО в течение 20 мин — проба 1, и, параллельно, с 50 мкM РО + 250 мкM МХ также в течение 20 мин — проба 2. Реакцию начинали добавлением гемолизата крови. Суммарный объем инкубационной смеси составлял 0.4 мл. Реакцию останавливали добавлением субстрата — 100 мкл эмульсии фенилвалерата (приготовленной как описано выше для препарата ЛиоНТЭ, конечная концентрация в пробе 0.56 мM) и инкубацию продолжали в течение 40 мин при 37oC. Гидролиз субстрата останавливали добавлением 50 мкл 1% (в/об) водного раствора SDS. Cуммарный объем пробы составлял 550 мкл.

Амперометричесое измерение фенола проводили в 1-мл двухэлектродной ячейке с перемешиванием после 50-кратного разбавления образцов в ячейке прибора 50 мM Na-фосфатным буфером, содержащим 100 мM NaCl (pH 7.0). В качестве рабочего электрода использовали планарный тирозиназный LBL биосенсор. Электрод подсоединяли к проточной электрохимической ячейке, снабженной комбинированным Pt-Ag/AgCl электродом. Все измерения проводили при -150 мВ относительно Ag/AgCl референсного электрода при помощи управляемого компьютером потенциостат-гальваностата IPC-2000 (ИФХ РАН). Каждое измерение проводили в двух повторах. Сенсор калибровали по отклику на фенол (10−6 M) в том же рабочем буфере. Аналитический сигнал сенсора определяли как разность величин стационарного тока до и после добавления пробы. Активности НТЭ рассчитывали, используя калибровочные зависимости по фенолу, полученные в тех же условиях, и вводили поправку на спонтанный гидролиз субстрата, измеренный в отдельных экспериментах. Активность НТЭ рассчитывали как разность фенилвалерат-гидролизующей активности в пробах 1 и 2.