Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ фосфорорганическими соединениями

Определение бимолекулярных констант ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ исследуемыми ФОС (ki, М-1мин-1) проводили с использованием коммерческих препаратов ферментов фирмы Sigma-Aldrich (США) — ацетилхолинэстеразы (АХЭ, Е.С. 3.1.1.7) эритроцитов человека (500 Ед/мг, C0663), бутирилхолинэстеразы (БХЭ, Е.С. 3.1.18) сыворотки крови лошади (500 Ед/мг, (C4290)), карбоксилэстеразы (КЭ, E.C. 3.1.1.1.) печени свиньи (150 Ед/мг, (E2884)); и стабильного лиофилизованного препарата НТЭ мозга кур (ЛиоНТЭ), полученного по методике, разработанной в нашей лаборатории и детально описанной в работах [457, 458]. ЛиоНТЭ — это мембранная (Р2 + Р3) фракция гомогената головного мозга кур, предварительно обработанная параоксоном (40 мкМ, 40 мин), которая представляет собой параоксон-резистентную эстеразную активность мозга.

Для кинетических исследований использовали 3−4 концентрации ингибитора (~ 0.5Ч IC50, М; 1ЧIC50, М и 2ЧIC50, М) и для каждой концентрации 4−5 различных интервалов времени инкубации. Ферменты инкубировали с исследуемыми соединениями в соответствующем рабочем буфере в условиях [I]0>>[E]0 при 25 °C для АХЭ, БХЭ, КЭ и при 37 °C для НТЭ. Конечная концентрация растворителя (ацетон) составляла не более 1% об/об. В отдельных экспериментах нами было показано, что в данной концентрации ацетон не оказывает значимого влияния на активность ферментов. Запасные растворы ингибиторов готовили непосредственно перед проведением экспериментов. Контрольные пробы содержали соответствующий объем растворителя без ингибитора.

Остаточную активность АХЭ и БХЭ определяли методом Эллмана [459] с 1 мM ацетилтиохолином (АТХ) и 1 мM бутирилтиохолином (БТХ) в качестве субстратов, соответственно, в 0.1 M K-Na-фосфатном буфере pH 7.5 при 25oC, л=412 нм, (?412 = 14 150 M-1 cm-1) в присутствии 0.33 мМ ДТНБ.

Активность КЭ определяли с использованием 1 мM 4-NPA в качестве субстрата в 0.1 M K-Na-фосфатном буфере pH 8.0 при 25o, л=405 нм (?405 = 13 300 M-1cm-1).

Активность НТЭ определяли как разность между параоксон-резистентной (ЛиоНТЭ) и (параоксон+мипафокс)-резистентной (ЛиоНТЭ + мипафокс 250 мкМ, 20 мин) эстеразной активностью в соответствии с дифференциальным методом Johnson M.K. (1977) [250]. Реакцию проводили в 50 мМ трис-HCl буфере рН 8.0 с 0.2 мМ ЭДТА при 37 °C, субстрат — 1.4 мМ фенилвалерат. Выделяющийся в результате реакции фенол определяли при л = 510 нм (?510 = 13 900 M-1 min-1). Измерения проводили на микропланшетном спектрофотометре.

Bio-Rad Benchmark Plus (France) в 96-и луночных планшетах.

Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ и КЭ

Контрольная проба без ингибитора содержала 10 мкл 5% раствора ацетона в соответствующем рабочем буфере и 40 мкл раствора фермента в буфере.

Опытная проба содержала 10 мкл раствора ингибитора определенной концентрации и 40 мкл раствора соответствующего фермента. Реакцию ингибирования начинали внесением фермента. Реакционную смесь инкубировали при 25 °C в течение 1, 2, 4, 6 мин для максимальной концентрации ингибитора; в течение 2, 4, 6, 8 мин для средней концентрации и в течение 3, 6, 9, 12 мин для минимальной концентрации ингибитора. Реакцию ингибирования АХЭ и БХЭ останавливали внесением 1.25 мМ раствора субстрата (АТХ и БТХ соответственно) в рабочем буфере, содержащем 0.33 мМ ДТНБ (общий объем вносимого раствора 200 мкл). Реакцию ингибирования КЭ останавливали внесением 1.25 мМ раствора субстрата (4-NPA) в 200 мкл рабочего буфера. Суммарный объем реакционной смеси составлял 250 мкл.

Исследование кинетики ингибирования НТЭ

Перед экспериментом лиофилизованный препарат НТЭ, хранящийся в стеклянных запаянных ампулах при -70oC, ресуспендировали в гомогенизаторе Поттера (тефлон: стекло) в 5 мл рабочего буфера. Определение активности проводили через 0.5−1 ч, концентрация белка в препарате составляла 0.1−0.14 мг/мл (Bradford M.M., 1976). Субстрат фенилвалерат готовили непосредственно перед проведением эксперимента: запасной раствор фенилвалерата в этаноле 15 мг/мл (84 мМ) разбавляли в 30 раз 0.03% водным раствором Тритона Х-100, тщательно перемешивая для получения эмульсии, и получали рабочую концентрацию фенилвалерата — 2.8 мМ. Запасной раствор мипафокса (12.5 мМ) готовили в 50 мМ Трис-цитратном буфере, рН 6.0.

Исходную активность препарата ЛиоНТЭ (V0) определяли как разницу между РО-резистентной фенилвалерат-гидролизирующей активностью (VPO) — проба 1 (0.855 мл рабочего буфера, 0.02 мл растворителя (ацетон) и 0.125 мл препарата ЛиоНТЭ, объем смеси 1 мл) и (РО+МХ)-резистентной активностью (VPO+MX) — проба 2 (0.835 мл рабочего буфера, 0.02 мл растворителя, 0.02 мл 12.5 мМ раствора МХ (250 мкМ конечная концентрация), 0.125 мл препарата ЛиоНТЭ, объем смеси 1 мл). Добавлять PO в пробы не требуется, поскольку при получении препарата ЛиоНТЭ (P2+P3) фракция гомогената мозга уже была обработана PO. Инкубацию с МХ начинали внесением 0.125 мл препарата ЛиоНТЭ. Время инкубации — 20 мин при 370C. Реакцию ингибирования останавливали внесением избытка субстрата — эмульсии фенилвалерата (1 мл 2.8 мМ, конечная концентрация 1.4 мМ). Через 20 мин реакцию гидролиза субстрата останавливали внесением 1 мл раствора: 1% (в/об) SDS + 0.025% (в/об) 4-AAP. Через 5 минут добавляли 0.5 мл 0.4% (в/об) водного раствора K3[Fe (CN)6], в результате чего развивается окраска, интенсивность которой детектировали на микропланшетном спектрофотометре Bio-Rad Benchmark Plus при длине волны 510 нм. Все измерения проводили в трипликате. Разница между значениями оптической плотности пробы 1 и пробы 2 соответствует активности НТЭ (V0 = VPO — VPO+MX). Активность препарата ЛиоНТЭ составляла 45 ± 5 нмоль/(минЧмг белка).

Ингибирование ЛиоНТЭ исследуемыми ФОС проводили в аналогичных условиях, но вместо растворителя в пробу 1 вносили 0.02 мл раствора ингибитора соответствующей концентрации. Реакцию ингибирования начинали внесением 0.125 мл препарата ЛиоНТЭ и останавливали внесением избытка субстрата через выбранные промежутки времени для каждой концентрации ингибитора. Для максимальной концентрации ингибиторов время инкубации с препаратом ЛиоНТЭ составляло 5, 10, 15, 20 мин; для средней концентрации — 5, 10, 20, 30 мин и для минимальной концентрации ингибиторов — 10, 20, 30, 40 мин.

Величины бимолекулярных констант ингибирования эстераз исследуемыми

ФОС (ki, М-1мин-1) определяли в соответствии с классической работой В случае, если кинетика ингибирования фермента описывалась схемой полулогарифмических координатах lg (V0/Vt) = f(t) (Рис. 2.2. — 1), соответствующий константе скорости псевдопервого порядка k? = 2.303Чtgб, пропорционален концентрации ингибитора. В этом случае бимолекулярную константу ингибирования (ki, М-1 мин-1) определяли в соответствии с уравнением ki = 2.3Чlg (V0/Vt)/([I]Чt). В результате анализа графических зависимостей, построенных в полулогарифмических координатах по уравнению: lg (V0/Vt) = (ki Ч[I]/2.3) Ч t (Рис. 2.2. — 1), определяли константу скорости псевдопервого порядка для каждой концентрации ингибитора (M-1).

При данной схеме ингибирования не наблюдается пропорциональности в зависимости константы скорости псевдопервого порядка (k? = 2.303 Ч tgб) от концентрации ингибитора. Построение зависимостей в координатах [I]/2.3tgб = f[I] позволяло получить линейную зависимость (Рис. 2.2. 4) в соответствии с уравнением [I]/k? = Ka/k+2 + [I]/k+2, из которого определяли индивидуальные кинетические параметры процесса — константу Михаэлиса (Ka, M) и константу фосфорилирования (k+2, мин-1).

Анализ данных и вычисление кинетических констант (ki, M-1мин-1) проводили с использованием программы количественного анализа связи структура-ингибиторная активность и структура-ингибиторная селективность (QSAR) с построением моделей Хэнча [460]. Cвязь между структурой и антиферментативной активностью/селективностью соединений анализировали методом множественной линейной регрессии с использованием функции Регрессия программы Excel MSWin XP. Мы исп ользовали модели «гидрофобность — ингибиторная активность» типа Хэнча с включением в них стерических факторов. В качестве физико-химических дескрипторов использовали константы гидрофобности Хэнча (рCH2 = 0.5) и стерические константы заместителей Чартона (Evs) для алкильных У Evs ® и алкоксильных У Evs (RO) заместителей [460]. Значимость полученных корреляционных уравнений оценивали по величине r — коэффициента множественной корреляции, s — стандартного отклонения, F — секвенциального критерия Фишера и Р — уровня значимости критерия Фишера.

Для каждого фермента были построены следующие модели Хэнча [460] структура-ингибиторная активность и структураингибиторная селективность, из которых выбирались наилучшие уравнения в соответствии с их статистическими показателями.

lg (активность или селективность) = A + B? р

lg (активность или селективность) = A + B? р + DУ Evs (RO) lg (активность или селективность) = A + B? р + KУ Evs ® lg (активность или селективность) = A + B? р + C (Ур)2.

lg (активность или селективность) = A + B? р + C (Ур)2 + DУ Evs (RO) lg (активность или селективность) = A + B? р + C (Ур)2 + KУ Evs ®.