Бутирилхолинэстераза. 
Исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений

Физиологическая функция и локализация БХЭ

Бутирилхолинэстераза (БХЭ, КФ 3.1.1.8), также называемая сывороточная холинэстераза или псевдохолинэстераза, в изобилии присутствует в плазме крови человека (3 мг/литр), ее период полужизни составляет 12 дней [125, 126]. БХЭ присутствует практически во всех тканях организма — печени, кишечнике, поджелудочной железе, плаценте, сердце, в центральной и периферической нервной системе и т. д. [127]. Сывороточная БХЭ синтезируется в печени и оттуда поступает в кровоток. В норме активность БХЭ в крови человека находится в диапазоне 0.9−12 Ед/мл (по бутирилтиохолину) [128−130].

Физиологическая роль БХЭ до сих пор до конца не ясна. В отличие от АХЭ, у БХЭ нет уникальной физиологической функции, которая не могла бы быть компенсирована другими ферментами. Люди, не имеющие активности БХЭ здоровы, фертильны и доживают до старости [131]. Эксперименты на нокаутных по гену БХЭ мышах показали также, что полное отсутствие активности БХЭ не влияет на здоровье и плодовитость животных [132].

Суммарно в организме человека и мыши БХЭ содержится в среднем в 10 раз больше, чем АХЭ [24, 131]. Наиболее высокие концентрации БХЭ обнаружены в печени, плазме крови, коже, легких, тонком кишечнике, что свидетельствует о защитной роли фермента, его участии в детоксикации ксенобиотиков, поступающих в организм с пищей и воздухом [32, 131].

БХЭ обладает более широкой субстратной специфичностью по сравнению с АХЭ. БХЭ гидролизует эфиры холина, тиохолина, ароматические и другие органические эфиры. [133], она наиболее специфична к бутирилхолину (KМ = 0.14 мМ) и значительно в меньшей степени к ацетилхолину (KМ = 1.2 мМ).

Более широкая субстратная специфичность БХЭ по сравнению с АХЭ определяется размерами и некоторыми структурными особенностями активного центра БХЭ, которые мы обсуждаем ниже.

Cпецифическим ингибитором БХЭ является этопропазин. [134, 135]. Iso-OMPA часто используется как специфический ингибитор БХЭ, но только в малых концентрациях, высокие концентрации iso-OMPA ингибируют также и КЭ [32].

Генетический полиморфизм БХЭ

Единственный ген БХЭ человека расположен на хромосоме 3 в регионе 3q26.1-q26.2 на минус-нити [136]. Уровень экспрессии гена БХЭ в 4 раза выше среднего.

Для БХЭ, в отличие от АХЭ, описано большое число случаев полиморфизма [137]. Большинство идентифицированных генетических вариантов являются «молчащими», то есть они имеют нулевую активность или менее 10% от уровня нормальной активности. Известно порядка тридцати «молчащих» мутаций [137−139]. БХЭ плазмы крови человека помимо обычной формы (U) имеет около 9 фенотипических изоформ [140, 141]. К ним относятся «атипичные» (A), «молчащие» (S), фторидрезистентные (F), а также К (Kalow).

J (James) — гомои гетерозиготные варианты БХЭ [141].

Наиболее важной с клинической точки зрения является атипичная форма БХЭ (замена Asp70Gly) [142]. Люди с атипичной БХЭ обладают ненормальной реакцией на введение мышечного релаксанта кратковременного действия сукцинилдихолина (апноэ и длительный паралич [142, 151, 152]. Сукцинилхолин относится к группе деполяризующих миорелаксантов, по структуре он напоминает ацетилхолин, и аналогичным образом действует на постсинаптическую мембрану, вызывая ее деполяризацию. В клинической практике он также известен под названиями дитилин и листенон. Сукцинилхолин не гидролизуется АХЭ в синаптической щели, но быстро гидролизуется БХЭ плазмы, что и определяет кратковременность мышечной релаксации — порядка 2−3 минут. Атипичная БХЭ (Asp70Gly) гидролизует сукцинилхолин с заметно более низкой скоростью, что приводит к существенному увеличению времени блокады нервно-мышечной проводимости и длительному параличу дыхательных мышц вплоть до летального исхода [152, 153]. Также выявлена реже встречающаяся полиморфная модификация Asp70His, приводящая к тому же эффекту при взаимодействии фермента с сукцинилхолином [154].

Для предотвращения негативных последствий введения сукцинилхолина пациентам с атипичной БХЭ, иногда вводят «нормальную» БХЭ [155].

Установлено, что 76% людей имеют обычный генотип, а остальные 24% несут, по крайней мере, один генетически измененный аллель. В Америке и Европе частота встречаемости гомозиготного атипичного генотипа (AA) невелика — 0,04%, гетерозиготные варианты встречаются чаще — 0,4−0,5%. Вариант К более распространен: гетерозиготным носителем является 1 житель США из 4, а гомозиготный вариант несет 1 из 64 [145]. Носителями «молчащих» вариантов в Америке являются 0,8% обследованных.

Следует отметить, что в нормальных условиях при отсутствии каких-либо заболеваний и воздействия химических веществ, полиморфные мутации и даже отсутствие экспрессии БХЭ не сказывается на здоровье человека [131]. Однако, люди с низкой активностью БХЭ или с ее отсутствием обладают пониженной способностью к связыванию и детоксикации ФОС и других антихолинэстеразных соединений, таким образом они являются более восприимчивыми к токсическому действию данных соединений. Такие пациенты имеют большой риск развития как острых, так и отставленных нейротоксических эффектов, вызываемых данными соединениями [137].

Структура БХЭ

Секретируемый фермент представлен глобулярными, водорастворимыми (гидрофильными) формами G1, G2 и G4, которые состоят, соответственно, из одной (мономер), двух (димер) или четырех (тетрамер) субъединиц. Субъединица фермента является сиалогликопротеидом с молекулярной массой 85 кДа, состоящей из 574 аминокислот и 9 углеводных цепочек, на долю которых приходится 24% веса белка. Субъединицы в димере связаны дисульфидными связями остатков цистеина. 95% активности БХЭ плазмы приходится на долю тетрамеров.

Структурные особенности активного центра БХЭ

Аминокислотные последовательности АХЭ и БХЭ гомологичны на 53%, их структуры и каталитические механизмы также сходны, однако ферменты различаются по субстратной специфичности и сродству к различным ингибиторам [157, 158].

Оба фермента имеют длинный, ~20Е гидрофобный канал, содержащий активный центр. Как и в случае АХЭ, в активном центре БХЭ можно выделить эстеразный сайт, который состоит из каталитической триады Ser198, His438 и Glu325, и непосредственно участвует в катализе, б-анионный сайт (холин-связывающий сайт), который содержит ключевой остаток Trp82, участвующий в катионр взаимодействии, оксианионный сайт, который составляют Gly116, Gly117 и Ala199, участвующие в стабилизации комплекса Михаэлиса, фиксируя карбонильный кислород субстрата или ингибитора;

ацил-связывающий карман, который содержит Leu286 и Val288, и участвует в связывания ацильной группы субстрата или ингибитора, периферический анионный сайт в составе Asp70 и Tyr332, расположенный на краю каталитической щели, осуществляющий начальное связывание положительно заряженных субстратов или ингибиторов.

Шесть из 14 ароматических остатков, которые выстилают каталитическую щель активного центра АХЭ, заменены у БХЭ на меньшие по размеру алифатические аминокислоты, что делает активный центр БХЭ более объемным (500 Е) по сравнению с активным центром АХЭ (300 Е), и позволяет вмещать более широкий спектр субстратов и ингибиторов.

Так, Phe295 и Phe297, присутствующие в АХЭ, заменены на лейцин и валин, соответственно, что позволяет бутирилхолину и бутирилтиохолину помещаться в ацил-связывающем кармане.

Периферический анионный сайт БХЭ, расположенный на краю каталитической щели, включает лишь два аминокислотных остатка, Asp70 и Tyr332, и не имеет ароматического кластера подобного АХЭ (Trp286, Tyr72, Tyr124, Phe338). Замена Trp286 (у АХЭ) на Ala (у БХЭ) приводит к падению ингибирующей активности лигандов, занимающих периферический анионный сайт БХЭ [161], что объясняет слабое связывание ингибиторов АХЭ — пропидиума и фасцикулина, с БХЭ.

БХЭ, как и АХЭ, гидролизует преимущественно положительно заряженные субстраты. Asp70 периферического анионного сайта, несущий отрицательный заряд является ключевым аминокислотным остатком, отвечающим за связывание лигандов (в случае АХЭ — Asp74). Согласно кристаллографическим данным [165], Asp 70 находится в канале, ведущем от поверхности белка к активному сайту (аналогичном каналу в молекуле АХЭ) на расстоянии 12Е от поверхности белка.

Отрицательно заряженные субстраты, например, аспирин, БХЭ гидролизует вдвое медленнее, чем ацетилхолин [166].

Показано, что трехмерная структура БХЭ человека [159] и структуры АХЭ ската и дрозофилы очень близки. Основные цепи АХЭ и БХЭ практически совпадают, а различия в боковых цепях создают в канале БХЭ дополнительный объем по сравнению с АХЭ.

Биологическая роль БХЭ

Как мы уже отмечали, физиологическая функция БХЭ до сих пор не выяснена. Гидролизуя различные соединения и связываясь с ФОС, БХЭ выполняет в организме в первую очередь защитные функции, а также участвует в метаболизме лекарственных препаратов [163, 167].

Есть данные, что БХЭ играет также определенную роль в развитии сахарного диабета 2 типа [168, 169].

БХЭ является одной из эстераз, которая инактивирует аппетит-стимулирующий гормон октаноил-грелин, превращая его в неактивную форму (чистый пептид — грелин). Роль БХЭ в жировом обмене подтверждается в экспериментах на БХЭ (-/-) мышах, у которых развивалось ожирение при получении кормов с высоким содержанием жира в отличие от животных дикого типа [170, 171].

В работе [172] показано, что активность сывороточной БХЭ коррелирует со степенью ожирения пациентов, с липидным профилем сыворотки крови и степенью резистентности к инсулину.

Роль БХЭ в метаболизме лекарственных препаратов

В связи с отсутствием КЭ в плазме человека [173], гидролиз фармакологически важных соединений, содержащих сложноэфирную связь, в крови человека осуществляет именно БХЭ плазмы, играя таким образом важную роль в их фармакокинетике.

Так, БХЭ гидролизует целый ряд сложноэфирных предшественников лекарств (prodrugs), тем самым участвуя в процессе их метаболической активации. В частности, БХЭ превращает пролекарство бамбутерол в тербуталин — бронходилятатор длительного действия, препарат для лечения астмы [174]. Также БХЭ вместе с карбоксилэстеразой превращает пролекарство СРТ-11 (иринотекан) в активный противоопухолевый препарат SN-38 [175, 176]. Терапевтический эффект подобных лекарственных средств зависит от уровня активности БХЭ в организме.

БХЭ плазмы является также основным ферментом, гидролизующим миорелаксанты сукцинилхолин и мивакурий, обеспечивая таким образом кратковременность их действия [138, 177, 178]. Также БХЭ участвует в биотрансформации прокаина [179], ацетилсалициловой кислоты [180], героина.

Основным метаболическим путем детоксикации и выведения кокаина из организма человека является его гидролиз под действием БХЭ [182−186], продукты гидролиза — экгонин и бензойная кислота, биологически неактивны. [182, 184, 187]. Только 5% кокаина детоксицируется окислением микросомальным цитохромом P450 в печени. В связи с этим лечение передозировки кокаина при помощи препаратов на основе БХЭ является перспективным терапевтическим подходом [188, 189].

Взаимодействие с ФОС: БХЭ как биоскэвенджер и биомаркер воздействия ФОС

Сывороточная БХЭ способна осуществлять связывание многих токсичных ФОС и карбаматов, поступивших в организм извне, выступая в роли биоскэвенджера. ФОС токсиканты реагируют с БХЭ по тому же механизму, что с АХЭ, образуя ковалентный комплекс, не обладающий ферментативной активностью, с одной стороны, и инактивируя отравляющее вещество с другой. Инактивация БХЭ, которая не является первичной биомишенью ФОС, не вносит непосредственного вклада в токсический эффект. При этом БХЭ снижает токсичность ФОС, действуя как стехиометрический скэвенджер, то есть как место альтернативного фосфорилирования, снижая, тем самым, концентрацию ФОС, доступного для взаимодействия с АХЭ или другими биомишенями [1, 94]. Молекулярный полиморфизм БХЭ, определяющий ее активность и специфичность, влияет на чувствительность индивидуума к ФОС.

В работе [137] показано, что БХЭ связывает низкие дозы фосфорорганических и карбаматных пестицидов и таким образом защищает человека от токсического действия этих ингибиторов эстераз. Подтверждением этому является пониженная активность БХЭ без клинических признаков отравления у людей, работающих с пестицидами. Показана корреляция между связыванием ФОС с БХЭ и снижением острой токсичности данных соединений для мышей. [190]. В экспериментах на обезьянах и грызунах показано, что у животных с молчащей БХЭ резко возрастает риск антихолинэстеразного отравления при любом контакте с ингибиторами холинэстераз [137].

Профилактическое введение сывороточной БХЭ человека или рекомбинантной БХЭ человека грызунам, морским свинкам и нечеловекообразным приматам защищает их от смертельных доз зарина, зомана VХ-газов [167, 191−194]. В связи с этим перспективным является создание препаратов на основе БХЭ для защиты человека от токсического воздействия ФОС [163, 167, 195, 196]. Некоторые из таких препаратов (сывороточная БХЭ человека и рекомбинантная форма фермента, полученная из молока трансгенных коз) прошли I фазу клинических испытаний [196−198]. Однако, основным ограничением биоскэвенджеров первого поколения является стехиометрический механизм взаимодействия между ферментом и молекулой ФОС (1:1).

Определение активности БХЭ в цельной крови (или плазме) обычно используют в качестве чувствительного биомаркера воздействия ФОС [199]. Оценка активностей обеих холинэстераз, АХЭ и БХЭ, является необходимым условием правильного подбора антидота для людей, подвергшихся воздействию боевых отравляющих веществ. [200, 201]. Правильное и своевременное установление уровня активности холинэстераз позволяет выбрать оптимальный антидот и его количество, что предотвращает развитие тяжелых последствий отравления.

Ингибиторы БХЭ в терапии болезни Альцгеймера

Помимо плазмы, БХЭ широко представлена в нервной системе, что указывает на ее роль в нейрональных функциях. В человеческом мозге, как АХЭ, так и БХЭ находятся в нейронах и в клетках глии, а также в нейритных бляшках и нейрофибриллярных клубках у пациентов с БА [202, 203]. Есть свидетельства важной роли БХЭ в холинергической нейротрансмиссии и участия в развитии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера [56−58, 169].

В здоровом мозге человека, активность АХЭ выше, чем активность БХЭ. При развитии БА активность АХЭ постепенно снижается, в то время как активность БХЭ возрастает [204]. По мере прогрессирования болезни, баланс между ферментами смещается в пользу БХЭ, увеличивая ее функциональное значение в регулировании уровня ацетилхолина [47]. В связи с этим использование ингибиторов БХЭ на поздних стадиях БА имеет важное значение для поддержания когнитивных функций и качества жизни пациентов [55, 203]. В экспериментах на грызунах было показано, что селективные ингибиторы БХЭ, улучшают когнитивные функции у старых животных за счет увеличения уровня ацетилхолина в мозге и тем самым могут быть полезны в лечении БА [59, 204−206].

В настоящее время ведется активный поиск селективных обратимых ингибиторов БХЭ для терапии БА [207].

В последние годы предложено большое количество ингибиторов БХЭ как потенциальных терапевтических агентов для лечения БА как из природных источников, так и синтетического происхождения [208]. Многие из этих соединений были синтезированы на основе химических структур классических ингибиторов АХЭ — физостигмина, такрина, галантамина и донепезила.

Другие ингибиторы, действующие избирательно на БХЭ, включают бензофураны [211] и производные изосорбида [212−214], причем последняя группа включает в себя наиболее мощные и селективные ингибиторы БХЭ.

Производные фенотиазина — еще один химический класс ингибиторов БХЭ [215−218], которые, как известно, обладают также антипсихотическими и антигистаминными свойствами. В последнее время получены и охарактеризованы диарилимидазолы (diarylimidazoles) как гибридные ингибиторы гидролазной активности БХЭ и формирования фибрилл в-амилоида [208], а также тиенотиазины (thienothiazine), сходные по структуре с фенотиазинами [219].

В качестве эффективных селективных ингибиторов АХЭ и БХЭ представляют интерес также природные алкалоиды из растений рода Peganum — в-карболины и хинолины.

Таким образом, холинэстеразы (АХЭ и БХЭ) играют важнейшую роль в организме человека. На данный момент накоплен огромный объем информации относительно их структуры и свойств, вместе с тем множество вопросов остается открытым. Ведутся активные исследования функционирования холинэстераз, как в здоровом организме, так и при нарушениях различной этиологии, проводится активная разработка фармацевтических препаратов на основе холинэстераз и их селективных ингибиторов.