Контроль возбудителей острых кишечных инфекций на основе иммунохроматографического метода

В настоящее время большой интерес представляет разработка и внедрение в практику систем экспресс-индикации возбудителей острых кишечных инфекций вирусной и бактериальной природы, использование которых возможно как в лабораторных, так и в полевых условиях. Задачей при создании таких систем является как можно более раннее выявление возбудителя заболевания в кратчайшие сроки при упрощении процедуры анализа. Перспективной с этой точки зрения являются методы на основе иммунохроматографии (1).

Метод иммунохроматографического анализа основан на течении иммунной реакции «антиген-антитело» при движении тестируемого жидкого образца по композитной мембране и визуальном учете результатов по наличию или отсутствию окрашенных зон с иммобилизованными иммунореагентами.

Иммунохроматографические индикаторные элементы (ИИХЭ) представляют собой сборку из нескольких мембран, плотно прилегающих друг к другу и обеспечивающих свободное перемещение жидкой пробы под действием капиллярных сил от подложки для нанесения исследуемого образца к подложке для впитывания образца. Принцип достижения аналитического эффекта заключался в следующем. Жидкую пробу, содержащую микроорганизмы, наносили на подложку для впитывания образца, затем пробу перемещали вдоль сборки мембран, реагируя с антителами, конъюгированными с коллоидным золотом. Образованный комплекс имел вишневую окраску. Полученный иммунный комплекс под действием капиллярных сил перемещался по нитроцеллюлозной мембране, достигает аналитической зоны, где происходило его иммобилизация на мембране за счет связывания с антителами аналитической зоны. В этой зоне образовывался ярко-окрашенный «сэндвич» коньюгата коллоидного золота, связанного с микробными клетками, и антител, иммобилизованных на мембране. В аналитической зоне наносили антитела к другим антигенным эпитопам инфекционного агента. Часть жидкой пробы продолжала перемещение по нитроцеллюлозной мембране, связываясь с антителами контрольной зоны и впитываясь в положку для сбора образца. Образование окраски в контрольной зоне подтверждает наличие связанных с золем золота антител, косвенно указывая на иммунохимическую активность конъюгата.

Неоценимое значение такие тест-системы имеют при решении широкого диапазона вопросов эпизоотического и эпидемического надзора, в том числе таких актуальных проблем, как надзор за кишечными инфекциями.

Цель работы

Адаптация методов иммунохроматографического определения возбудителей острых кишечных инфекций, в частности, бактерий рода Salmonella (группа В) в объектах окружающей среды, кормах и продуктах питания.

Материалы и методы

Исследовали пробы продовольственного сырья, пищевых продуктов, кормов для животных и объектов окружающей среды.

Индикацию бактерий рода Salmonella группы В проводили в 743 объектах окружающей среды, 51 образце кормов для животных и 175 образцов пищевых продуктов, 200 образцов продовольственного сырья.

Для выявления бактерий рода Salmonella с помощью иммунохроматографических тест-систем использовали «Набор ИИХЭ для индикации сальмонелл». сальмонелла иммунохроматографический пищевой Подтверждение результатов, полученных при иммунохроматографических исследованиях, проводили бактериологическим методом. Отбор и подготовку проб пищевых продуктов для исследований бактериологическим методом проводили в соответствии с НД на данный вид продукции. Исследования проводили в соответствии ГОСТ на определенный вид пищевых продуктов и кормов.

Исследования проводили как с искусственно контаминированными пробами, так и с нативными образцами, с одновременной постановкой необходимых контролей.

Для искусственной контаминации образов пищевых продуктов, объектов окружающей среды, кормов использовали десятикратные разведения культур микроорганизмов в концентрации от 106 до 10 м.к./мл.

При исследовании проб воздуха для концентрирования использовали импакторы (происходит принудительное осаждение микроорганизмов из прокачиваемого через прибор воздуха на плотные питательные среды) и импинджеры (микроорганизмы концентрируются при барбатации через стерильный физиологический раствор).

При использовании импакторов микроорганизмы смывали с поверхности плотных питательных сред стерильным физиологическим раствором, центрифугировали, осадок ресуспендировали в буфере для проведения иммунохроматографического анализа.

При использовании импинджеров со стерильным физиологическим раствором, концентрирование микроорганизмов проводили высокоскоростным центрифугированием с последующим ресуспендированием осадка в буфере для проведения иммунохроматографического анализа.

Дальнейшие исследования проводили с помощью ИИХЭ, непосредственно исследуя сконцентрированные микроорганизмы (экспресс-анализ), а также проводили обогащение материала в соответствующих питательных средах для повышения чувствительности иммунохроматографического метода.

Пробы почвы отбирали в стерильные колбы. Из общей пробы отбирали навеску для исследований массой (25±1) г, разводили 1:5 — 1:9 стерильным физиологическим раствором, фильтровали через бумажный фильтр. Надосадочную жидкость использовали для дальнейших исследований. Для концентрирования микроорганизмов использовали высокоскоростное центрифугирование или фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм. Осадок ресуспендировали в буфере для проведения иммунохроматографического анализа, встряхивая на вортексе. Затем исследования проводили с помощью ИИХЭ, непосредственно исследуя сконцентрированные микроорганизмы (экспресс-анализ), а также проводили обогащение материала в соответствующих питательных средах.

При исследовании воды в стерильную колбу, отбирали не менее 500 мл пробы (две параллельные пробы) и фильтровали с помощью вакуумной установки через мембранные фильтры («Millipor») с диаметром пор 0,45 мкм. При исследовании воды из открытых водоемов в случае присутствия в образце значительного количества механических примесей, пробу предварительно фильтровали через бумажный фильтр. Для исследований использовали 2 фильтра. Далее проводили элюирование осадка с первого фильтра, помещая фильтр в стерильный физиологический раствор в объеме 5 мл (при дальнейшем исследовании ИИХЭ). Второй фильтр использовали для дальнейших исследований методом ИИХЭ после обогащения в соответствующей питательной среде. Для проведения процедуры обогащения использовали мясопептонный бульон или сердечно-мозговой бульон. Исследуемые образцы инкубировали при температуре 37 °C в течение 6- 12 часов.

Смывы с объектов брали с поверхности, размером 10×10 см стерильным тампоном, закрепленном на зонде, смоченном стерильным физиологическим раствором. Отобранную тампоном пробу быстро вносили в пробирку, не доводя до дна 5 мм. Обламывали конец ручки тампона и закрывали крышкой.

При исследовании образцов продовольственного сырья и пищевых продуктов твердые образцы измельчали в гомогенизаторе.

Для проведения экспресс-анализа без обогащения, образцы после гомогенизирования в физиологическом растворе, подвергали низкоскоростному центрифугированию, отбирали надосадочную жидкость, центрифугировали высокоскоростным центрифугированием, осадок ресуспендировали в 300 мкл физиологического раствора. Затем, добавляли 300 мкл буфера для проведения иммунохроматографических исследований. Переносили 120−150 мкл этого раствора по каплям в лунку для внесения образца на иммунохроматографический индикаторный элемент, согласно инструкции по применению ИИХЭ.

При проведении анализа с процедурой обогащения проводили следующую процедуру пробоподготовки.

Из общей пробы отбирают навеску анализируемого образца массой (25±0,1) г или объемом (25±0,1) мл для исследований.

Навеску анализируемого образца массой (25±0,1) г или объемом (25±0,1) мл вносили в стерильную колбу и добавляли 225 мл одной из следующих питательных сред: трипказо-соевый бульон, сердечно-мозговой бульон, забуференная пептонная вода. При необходимости анализа других масс (объемов) образца, проводили их посев в перечисленные жидкие питательные среды, в соотношении 1:9 по объему. рН поддерживали в диапазоне? 7,2 — 7,6. С целью выравнивания рН питательных сред использовали 0,1 М фосфатно-солевой буферный раствор.

Образцы масла сливочного расплавляли на водяной бане при температуре 35єС — 40єС.

Образцы кондитерских изделий с шоколадом после стадии гомогенизации подвергали фильтрованию через бумажный фильтр до получения прозрачного аналита.

Исследования молочных продуктов (молоко, кисломолочные продукты) не проводили.

Инкубировали пробы в термостате при температуре 37єС в течение 6−12 часов при постоянном перемешивании. Из жидкой питательной среды на различных этапах инкубирования (через 6 и 12 часов) отбирали по 2 мл жидкой фракции, подвергали высокоскоростному центрифугированию, осадок ресуспендировали в 300 мкл физиологического раствора. Экспериментальным путем установлено, что оптимальное время инкубирования при проведении этапа обогащения составляло 12 часов при температуре 37 °C. Затем, добавляли 300 мкл буфера для проведения иммунохроматографических исследований. Переносили 120−150 мкл этого раствора по каплям в лунку для внесения образца на иммунохроматографический индикаторный элемент, согласно инструкции по применению ИИХЭ.

Образцы исследовали на месте или отправляли в лабораторию. Транспортирование образцов к месту проведения исследований осуществляли в как можно более сжатые сроки в термоизолирующих плотно закрывающихся контейнерах, приспособленных для транспортирования биологического материала. В лабораторных условиях отобранные образцы извлекали и подготавливали для дальнейших исследований.

Подготовка проб для исследований и проведение исследований представлена на схеме (рисунок 1).

Объем пробы, необходимой для анализа с помощью ИИХЭ составлял 100−150 мкл. На пластину ИИХЭ в окошко для внесения пробы по каплям (20 мкл) вносили исследуемый аналит. Время экспозиции составляло 20−30 мин.

Результаты исследований оценивали визуально по наличию 2-х окрашенных полос на мембране ИИХЭ. Четкое появление двух окрашенных полос указывает на наличие в пробе искомых микроорганизмов.

Полученные результаты показывают, что чувствительность аналитических систем на основе иммунохроматографии с использованием коллоидного золота составляла 105…1×106 м.к./мл. Объем пробы для анализа с помощью ИИХЭ не превышал 100−150 мкл, а время 20−30 мин. Таким образом, 105…1×106 микробных клеток нанесенных на ИИХЭ приводил к аналитическому эффекту.

При отсутствии в пробе определяемого антигена меченые антитела доходят до участка полоски с иммобилизованным антигеном. Далее иммунный комплекс продвигается до участка полоски с иммобилизованными антивидовыми антителами. На этом месте начнет формироваться антивидовой иммунный комплекс, который приведет к образованию окрашенной контрольной зоны. Окраска в контрольной зоне должна образовываться всегда и служить контролем сохранности тест-полоски для использования. Отсутствие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что иммунореагенты на тест-полоске неактивны и, следовательно, результаты анализа оценить нельзя.

При проведении исследований на модельных системах различных микроорганизмов положительная реакция наблюдалась только в гомологичных системах. Перекрестных реакций с гетерологичными бактериями, включая близкородственные виды, не наблюдалось.

Результаты изучения специфичности иммунохроматографического метода представлены в таблице 1.

Результаты исследований, полученные иммунохроматографическим методом, были специфичны с гомологичными и гетерологичными культурами микроорганизмов.

Таблица 1.

Изучение специфичности иммунохроматографического метода при исследовании объектов внешней среды.

" +" - положительный результат реакции.

" -" - отрицательный результат реакции Проверку чувствительности метода индикации с помощью ИИХЭ проводили с десятикратными разведениями культур микроорганизмов. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты индикации сальмонелл группы В при искусственной контаминации.

С помощью указанной методики, проводили мониторинговые исследования различных объектов на присутствие сальмонелл группы В. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты исследований объектов внешней среды при анализе нативных образцов на наличие бактерий рода Salmonella.

• 1 — всего исследовано 144 пробы воздуха
• 2 — всего исследовано 205 проб воды
• 3 — всего исследовано 144 пробы почвы
• 4 — всего исследовано 250 смывов

Заключение

Проведена адаптация иммунохроматографических индикаторных элементов для выявления бактерий рода Salmonella группы В в объектах окружающей среды, продовольственном сырье, пищевых продуктах и кормах для животных. Разработаны схемы индикации бактерий в конкретных объектах. Полученные на основе проведенных исследований результаты позволяют рекомендовать данный метод для проведения экспресс-анализов как в лабораторных, так и в полевых условиях.

• 1. Ярков С. П., Третьяков С. И., Башарова Л. А., Злобин В. Н. Индикация возбудителей особо опасных заболеваний с помощью иммунохроматографии и видеоцифрового анализа.- Вестник Российской АМН.- № 12. 2007. С. 22−26.
• 2. Ярков С. П., Скопинская С. Н., Шиленко И. В., Злобин В. Н. /Люминесцентный иммунохроматографический анализ антигенов микроорганизмов// Вестник Российской Академии Медицинских Наук.-М.-2009. № 3.-С. 17−25.