Методы световой и электронной микроскопии

Методы световой и электронной микроскопии

1. Световая микроскопия световой электронный микроскоп интерференция Принцип работа светового микроскопа заключается в том, что пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект. Пройдя через него, лучи света попадают в систему линз объектива. Они выстраивают первичное изображение, которое увеличивается при помощи линз окуляра. В целом объектив и окуляр дают обратное мнимое и увеличенное изображение объекта.

Световой микроскоп может повысить разрешающую способность человеческого глаза примерно в 1000 раз. Это является «полезным» увеличением микроскопа. При использовании видимой части спектра света конченый предел разрешения светового микроскопа составляет 0,2−0,3 мкм. Далее будут рассмотрены методы световой микроскопии.

1.1 Метод темного поля (ультрамикроскопии) Метод тёмного поля в проходящем свете основан на эффекте Тиндаля, так как подобна частичкам пыли с луче света, при боковом освещениии светятся мельчайшие частицы, отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат не попадает в объектив. Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип — препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц размером до 210^-9 м. Но форму и точные размеры этих частиц с помощью этого метода определить невозможно. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

1.2 Метод светлого поля и его разновидности Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них поглощающими свет частицами и деталями. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения.

Метод косого освещения — разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения, это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов. Освещение производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

1.3 Метод фазово-контрастной микроскопии Большая часть клеточных структур мало отличается коэффициентом преломления света, поглощения лучей друг от друга и среды. Для того, чтобы изучить такие компоненты приходится изменять освещенность (с потерей четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Метод фазово-контрастной микроскопии является одним из таких. Его широко применяют при витальном изучении клеток. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе. Невидимые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости, которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. В получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Объекты могут выглядеть темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

1.4 Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) Метод интерференционного контраста сходен с предыдущим — они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Пучок параллельных световых лучей от осветителя раздваивается на два потока, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу и приобретает изменения в фазе колебания, другой — мимо минуя объект по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта.

1.5 Поляризационная микроскопия Поляризационная микроскопия — это метод наблюдения в поляризованном свете за объектами, обладающими изотропией, т. е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц. Перед конденсором поляризационного микроскопа помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Если анализатор повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

1.6 Витальное изучение клеток Методы световой микроскопии дают нам возможность наблюдать живые клетки. Для короткого наблюдения клетки обычно помещают в жидкую среду на предметное стекло. Но для более длительного времени нужны другие способы. Часто для длительного наблюдения используют специальные камеры (плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или разборные плоские камеры). Клетки изучают в специально подобранных для них средах. Обычно для простейших это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов и других простейших, служащих для объекта изучения пищей. Свободные клетки многоклеточных могут изучаться в плазме крови или в специальных синтетических средах. Для изучение клеток и тканей животных используют метод клеточных культур.

1.6.1 Метод клеточных культур Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) искусственно выращиваются в контролируемых условиях для дальнейшего изучения. Более простой вариант этого метода представляет собой то, что в камеру с питательным раствором помещается небольшой кусочек живой ткани и через некоторое время по периферии начинает идти рост и деление клеток. Второй способ получения культуры клеток это обработка кусочка ткани трипсином или хелатоном (что приведет к диссоциации клеток), а затем помещение в сосуд с питательным экстрактом, где, после опущения клеток на дно и их прикрепления, начинается рост и размножение культуры. Для культуры клеток предпочитают использовать эмбриональный материал, который обладает большей способностью к делению чем взрослый. При культуре клеток следует соблюдать специальные условия стерильности, температурного режима, pH. Таким же методом можно культивировать клетки растительного происхождения. Для этого их обрабатывают ферментами, растворяющими клеточные оболочки, а отделившееся содержимое помещают в специальную среду, где происходит их рост и деление. Вместе с культивированием клеток обычно используют микрокиносъемку и микрофотосъемку, с помощью которой регистрируются многие клеточные процессы.

1.6.2 Метод микрохирургии Метод микрохирургии применяется для исследования живых клеток. Это метод оперативного вмешательства и воздействия на клетку, в т. ч. удаление или вживление отдельных органелл. Этот метод также предусматривает пересадку органелл из клетки в клетку, введение крупных макромолекул в клетку. Обычно микроманипулятор совмещается с микроскопом, который служит для наблюдения за ходом оперативного вмешательства. Микрохирургическими инструментами являются стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые изготавливаются на «микрокузницах». При микрооперациях клетку помещают в специальную камеру, куда также вводят инструменты. В последнее время также широко используются лазерные микропучки и микропучки UV спектра. Их применяют для точечного поражения клетки в ходе исследования.

1.6.3 Метод флуоресцентной микроскопии Метод получения увеличенного изображения с использованием свечения возбуждённых атомов и молекул образца. В флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой, а изображение получают в оптическом спектре. Изображение флуоресцентного препарата может сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Довольно часто используются вещества способные к флуоресценции или же в клетку инъецируются флуоресцентные агенты Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия — метод, позволяющий получать изображения с некоторой глубины в середине образца.

1.6.4 Метод конфокальной сканирующей световой микроскопии Конфокальный световой сканирующий микроскоп используют для получения трехмерной реконструкции объекта. С его помощью получают серию последовательных срезов клетки, взятой с различной глубины. После этого специальная компьютерная программа сводит эти изображения воедино и мы можем получить объемное, трехмерное изображение объекта.

1.7 Изучение фиксированных клеток Многие данные об устройстве и функционировании клетки были получены именно на фиксированных клетках. Фиксация — сложный процесс, направленный на убийство клетки, прекращение активности клеточных ферментов, распада компонентов, избежание потери структур и веществ, а также их приобретения, если они отсутствовали в живой клетке. Но, к сожалению, еще не существует фиксатора, который бы удовлетворял всем этим требованиям.

1.7.1 Методы цитохимического анализа Это ряд приемов окрашивания, главной целью которого является выявление специфических химических веществ клетки. Существует целый ряд приемов окрашивания, прямо выявляющие те или иные вещества. К таким цитохимическим реакциям предъявляют требования: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества. Пример такой реакции это реакция на ДНК — Фёльгена.

1.7.2 Метод цитофотометрии Данный метод позволяет количественно измерить конечный продукт цитохимической реакции. Он основывается на определении кол-ва веществ по поглощению ими света определенной волны. Интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Для этого метода используют микроскопы-цитофотометры (за их объективами расположен чувствительный фотометр). Этот метод широко используется при определении количества ДНК после реакции Фёльгена. Также можно провести количественную оценку не только поглощающих свет веществ, но и его излучающих. На этом основывается флуорометрия.

1.7.3 Метод иммунохимического исследования (иммунохимические реакции с использованием флуоресцентных антител) Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Существуют методы прямой и непрямой иммунофлуоресценции, в первом случае антиген связывается с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой (флуорохромом, например, FITС или TRITC, во втором же антиген связывается с неконъюгированным специфическим антителом (первичным антителом). Флуоресцентная метка конъюгирована со вторичным антителом, специфичным к Fc-фрагменту первичного антитела. Непрямой метод более чувствителен, чем прямой метод. По свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Но для того, чтобы меченные антитела проникли в клетку нужно сделать мембрану более проницаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран.

1.7.4 Метод радиоавтографии Данный метод используется для обнаружения локализации мест синтеза биополимеров, определения путей переноса веществ в клетке, наблюдения за миграцией или свойствами клеток. Для этого применяют регистрацию веществ, меченных изотопами. Способ повторяет метод Беккереля. В среду с клетками вводится предшественник одного из веществ, в котором один из атомов замещен, а радиоактивный изотоп. В процессе синтеза меченный атом попадет в саму молекулу и ее можно будет зарегистрировать с помощью фотоэмульсии. Точность этого метода зависит от величины зерна AgBr и от энергии частицы. Поэтому для метода радиоавтографии используют специальную мелкозернистую фотоэмульсию и изотопы с малой энергией. Радиоавтографически нельзя изучать растворимые в воде соединения, так как атомы могут потеряться.

1.7.5 Метод молекулярной гибридизации Применение предыдущего метода совместно с методом радиоавтографии дает нам возможность локализовать на хромосоме места с определенной нуклеотидной последовательностью или даже расположение определенных генов. Для этого раствор с меченой нуклеиновой кислотой наносят на препарат с денатурированной ДНК в составе хромосом или ядер. В процессе ренатурации ДНК образуется гибрид меченной нуклеиновой кислоты и комплементарным участком исходной ДНК. Место такой связи регистрируется радиоавтографически. Также метод применяется при окраске нуклеиновой кислоты флуорохромами. Это значит, что мы можем определить положение любой последовательности ДНК.

2. Электронная микроскопия Поскольку вопрос повышения разрешения всегда стоял остро, ученые пришли к выводу, что в световой микроскопии повысить разрешение можно только за счет использования источника света, который испускает волны с наименьшей длинной. Таким источником может быть раскаленная нить, выбрасывающая поток электронов, который можно сфокусировать, пропуская через магнитное поле. На основе этого был создан световой микроскоп. В настоящее время различают просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ) и растровую электронную микроскопию (РЭМ). Далее будут рассмотрены методы электронной микроскопии.

2.1 Контрастирование корпускулярных объектов Существует несколько методов контрастирования. Я рассмотрю два из них: негативное контрастирование и оттенение металлами. Негативное контрастирование производят с помощью ФВК, молибденовоскислого аммония, уранилацетата. после нанесения раствора на исследуемый объект, затем нанести на пленки-подложки и высушить, то исследуемый объект будет погружен в аморфное вещество высокой плотности. Это приведет к тому, что на снимках они будут выглядеть как белые объекты на темном фоне. Растворы могут также проникать вглубь исследуемого объекта и выявлять скрытые структуры. Также существует метод позитивного контраста. В этом случае используются соли тяжелых металлов, которые повышают электронную плотность объекта, таким образом, контраст его повышается. Оттенение металлами — при термическом испарении металлов их частицы разлетаются и осаждаются на исследуемом объекте в виде слоя, чья толщина варьируется в зависимости от направления полета частиц. В местах, где экранирует пучок частиц, пространство будет темнее.

2.2 Ультрамикротомия Ультрамикротомия представляет собой совокупность приемов для получения сверхтонких срезов с помощью ультратомов, или ультрамикротомов. Ультрамикротомы — аппараты для автоматического приготовления сверхтонких срезов тканей запрограммированной толщины (5—10 нм). Это нужно, потому что пучок электронов, проходя через более толстые объекты, поглощается, вызывает нагревание и приводит к деформации препарата. Процедура их довольна схожа с аналогичной для световой микроскопии. Сначала клетки фиксируют, часто используют ГА (глутаровый альдегид), а затем OsO₄, хотя бывает и применение их по отдельности. Затем осуществляют проводку с последним этапом — погружением в ксилол. После препарат заливают эпоксидными смолами (эпон). Теперь препарат, заключенный в твердые блоки можно резать с помощью стеклянных или алмазных ножей для изготовления срезов настолько малой величины используют термическую подачу объекта. Затем идет окраска препарата, обычно уранилацетатом и нитратом свинца, которые контрастируют позитивно. Эта техника изготовления открыла огромные возможности для применения электронной микроскопии почти во всех областях биологии и медицины.

Возможно проводить исследование методом радиоавтографии с использованием сверхтонкозернистых эмульсий и огромных экспозиций. А также исследований без фиксации и заключения в эпон методом криоультрамикротомии. В этом случае объект моментально замораживают до температуры жидкого азота, вода переходит в стекловидное состояние, а процессы моментально тормозятся. Полученные таким образом срезы используют в иммунохимических исследований и т. д.

Для изучения структуры мембранных компонентов используют метод замораживания-скалывания. Метод похож на предыдущий: объект моментально охлаждается до температуры жидкого азота, а затем скалывается охлажденным ножом. Поверхность слоя покрывают слоем металла и углерода, а затем растворяют объект и получают реплику с поверхности скола. При этом можно исследовать рельеф поверхности мембран.

2.3 Метод высоковольтной микроскопии Ускоряющее напряжение такого микроскопа составляет 1−3 млн вольт. Такое напряжение позволяет рассматривать объекты большей толщины (1−10 мкм), а использую стереоскопическую съемку, мы можем получить информацию о 3D организации внутриклеточных структур с высоким разрешением.

2.4 Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии

При использовании этого метода объект покрывается тонким слоем испаренного металла, отражаясь от которого, зонд (пучок электронов) попадает в приемное устройство, откуда далее передается сигнал. При этом получается практически трехмерное изображение поверхности исследуемого объекта, благодаря очень большой глубине фокуса. Также можно получить информацию о химическом составе клеток.

3. Световой и электронный микроскопы

3.1 Строение светового микроскопа и его основные характеристики Чтобы понять принцип работы светового микроскопа, необходимо рассмотреть его строение.

Главный прибор биологии является оптической системой, которая состоит из штатива, осветительной и оптической части. В штатив входят башмак; предметный столик с держателем предметного стекла и двумя винтами, перемещающими столик в двух перпендикулярных направлениях; тубус, тубусодержатель; макрои микровинты, передвигающие тубус в вертикальном направлении.

Для освещения объекта используют естественное рассеянное или искусственное освещение, которое осуществляется посредством стационарно вмонтированного в башмак микроскопа или соединенного через планку осветителя.

В осветительную систему также входят зеркало с плоской и вогнутой поверхностями и конденсор, расположенный под предметным столиком и состоящий из 2 линз, ирисовой диафрагмы и откидывающейся оправы для светофильтров. Оптическая часть включает наборы объективов и окуляров, которые позволяют изучать клетки на разных увеличениях.

Принцип работа светового микроскопа заключается в том, что пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект. Пройдя через него, лучи света попадают в систему линз объектива. Они выстраивают первичное изображение, которое увеличивается при помощи линз окуляра. В целом объектив и окуляр дают обратное мнимое и увеличенное изображение объекта.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст.

Разрешающая способность — это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно.

Разрешение микроскопа вычисляет по формуле

где л — длина волны света осветителя, б — угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в него,

n — коэффициент преломления среды.

Чем меньше длина волны луча, тем более мелкие детали мы сможем наблюдать через микроскоп. И чем выше нумерическая апертура объектива (n, тем выше разрешение объектива.

Световой микроскоп может повысить разрешающую способность человеческого глаза примерно в 1000 раз. Это является «полезным» увеличением микроскопа. При использовании видимой части спектра света конченый предел разрешения светового микроскопа составляет 0,2−0,3 мкм.

Однако следует отметить, что световая микроскопия позволяет нам увидеть частицы, меньшие предела разрешения. Это можно осуществить благодаря методу «Темного поля» или «Ультрамикроскопии» .

Рис. 1 Световой микроскоп: 1 — штатив; 2 — предметный столик; 3 — насадка; 4 — окуляр; 5 — тубус; 6 — устройство смены объективов; 7 — микрообъектив; 8 — конденсор; 9 — механизм перемещения конденсора; 10 — коллектор; 11 — осветительная система; 12 — механизм фокусировки микроскопа.

3.2 Строение электронного микроскопа Основная часть электронного микроскопа — полый вакуумный цилиндр (воздух откачан, чтобы исключить взаимодействие электронов с его составляющими и оксисления нити катода). Между катодом и анодом подаётся высокое напряжение, для дополнительного ускорения электронов. В конденсорной линзе (которая представляет собой электромагнит, как и все линзы электронного микроскопа) пучок электронов фокусируется и попадает на изучаемый объект. Прошедшие электроны, формируют на объективной линзе увеличенное первичное изображение, которое увеличивает проекционная линза, и проецируется на экран, который покрыт люминесцентным слоем для свечения при попадании на него электронов.

Рис. 2. Электронный микроскоп: 1 — электронная пушка; 2 — анод; 3 — катушка для юстировки пушки; 4 — клапан пушки; 5 — 1-я конденсорная линза; 6 — 2-я конденсорная линза; 7 — катушка для наклона пучка;8 — конденсор 2 диафрагмы; 9 — объективная линза; 10 — блок образца; 11 -дифракционная диафрагма; 12 — дифракционная линза; 13 — промежуточная линза; 14 — 1-я проекционная линза; 15 — 2-я проекционная линза; 16 — бинокуляр (увеличение 12); 17 — вакуумный блок колонны; 18 — камера для 35-миллиметровой катушечной пленки; 19 — экран для фокусировки; 20 — камера для пластинок; 21 — главный экран; 22 — ионный сорбционный насос.

Библиография Учебная литература

1. Ю. С. Ченцов, Введение в клеточную биологию, издание 4

Интернет сайты

2. http://dic.academic.ru/dic.nsf/dic_microbiology/2146/%D0%9C%D0%B8%D0%BA%D1%80%D0%BE%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%BF

3. http://www.vita-club.ru/micros2.htm

4. http://neobio.ru/content/view/10/12/

5. http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D1%83%D0%BB%D1%8C%D1%82%D1%83%D1%80%D0%B0_%D0%BA%D0%BB%D0%B5%D1%82%D0%BE%D0%BA

6. http://school.xvatit.com/index.php?title=%D0%9C%D0%B5%D1%82%D0%BE%D0%B4%D1%8B_%D1%86%D0%B8%D1%82%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D0%B8._%D0%9F%D0%BE%D0%BB%D0%BD%D1%8B%D0%B5_%D1%83%D1%80%D0%BE%D0%BA%D0%B8

7. http://www.oncologyray.com/ru/product/antibodies.html

8. http://immunologja.ru/267/