Особенности пропионовокислого брожения: применение пропионовокислых бактерий

Министерство сельского хозяйства РФ

ФГОУ ВПО

«Оренбургский государственный аграрный университет»

Реферат по промышленной микробиологии на тему Особенности пропионовокислого брожения: применение пропионовокислых бактерий Подготовил: студент

Акжигитов Абай Сарсенгалиевич Оренбург — 2010

Содержание Введение. Общая информация о пропионовокислых бактериях

1. Пропионовокислое брожение: химизм и особенности

2. Использование пропионовокислых бактерий в промышленности Заключение Список литературы

Введение: общая информация о пропионовокислых бактериях

Пропионовокислые бактерии — неспороносные грамположительные неподвижные палочки размером 0,5—0,8 или 1,0—1,5 мкм (в молодых культурах — искривленные, слегка ветвящиеся палочки, в более старых — кокковидной формы). Образуют колонии жёлтого, оранжевого или красного цвета, растут как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

Пропионовокислые бактерии родственны по ряду свойств гетероферментативным молочнокислым бактериям Они, как и молочнокислые бактерии, не встречаются в почве или водоемах. Обитают в основном в рубце и кишечнике жвачных животных, в молочных продуктах (не в молоке). Пропионовокислые бактерии — возбудители пропионовокислого брожения, сбраживают глюкозу, лактозу и др. углеводы, а также некоторые спирты с образованием пропионовой и уксусной кислот и CO₂. После молочнокислого брожения, когда лактоза превращена в молочную кислоту, начинают размножаться.

Пропионовокислые бактерии применяют для микробиологического синтеза витамина B₁₂. Пропионовые бактерии могут синтезировать гемсодержащие белки. В их клетках обнаружены цитохромы.

Конструктивный метаболизм пропионовых бактерий претерпел дальнейшую эволюцию в сторону большей независимости от органических соединений внешней среды. Пропионовые бактерии характеризуются хорошо развитыми биосинтетическими способностями и могут расти на простой синтетической среде с аммонийным азотом в качестве единственного источника азота при добавлении к среде пантотеновой кислоты и биотина, а для некоторых видов и тиамина. У ряда пропионовых бактерий обнаружена способность к азотфиксации.

Местообитание пропионовых бактерий — кишечный тракт жвачных животных, молоко, твердые сыры, в приготовлении которых они принимают участие.

1. Пропионовокислое брожение: химизм и особенности

Основные продукты пропионовокислого брожения, вызываемого несколькими видами бактерий из рода Propionibacterium, — пропионовая (CH₃CH₂OH) и уксусная кислоты и CO₂. Химизм пропионовокислого брожения сильно изменяется в зависимости от условий. Это, по-видимому, объясняется способностью пропионовых бактерий перестраивать обмен веществ, например, в зависимости от аэрации. При доступе кислорода они ведут окислительный процесс, а в его отсутствии расщепляют гексозы путём брожения. Пропионовые бактерии способны фиксировать CO₂, при этом из пировиноградной кислоты и CO₂ образуется щавелевоуксусная кислота, превращающаяся в янтарную кислоту, из которой декарбоксилированием образуется пропионовая кислота.

Основное энергетическое значение для пропионовокислых бактерий имеют так называемые ключевые реакции пропионовокислого брожения.

Под пропионовокислым брожением подразумевают биохимический процесс превращения бактериями сахара, молочную кислоту и ее солей в пропионовую кислоту. В этом брожении, кроме пропионовой кислоты, образуются и такие продукты, как уксусная кислота, углекислый газ, янтарная кислота, ацетоин, диацетил, другие летучие ароматические соединения — диметилсульфид, ацетальдегид, пропионовый альдегид, этанол и пропанол. Химизм данного брожения подобен типичному молочнокислому брожению с той разницей, что образовавшаяся молочная кислота в этом брожении не конечный продукт, а промежуточный. От других типов брожения пропионовокислое отличается высоким выходом АТФ, участием некоторых уникальных ферментов и реакций.

Пропионовокислым бактериям свойственен бродильный тип метаболизма: они расщепляют сахара по пути Эмбдена-Мейергоффа до пропионата, ацетата, СО₂ и сукцината. Химизм пропионовокислого брожения хорошо изучен и описан.

В пропионовокислом брожении мы имеем дело с карбоксилированием пирувата, приводящим к возникновению нового акцептора водорода — ЩУК. Восстановление пировиноградной кислоты в пропионовую у пропионовокислых бактерий протекает следующим образом. Пировиноградная кислота карбоксилируется в реакции, катализируемой биотинзависимым ферментом, у которого биотин выполняет функцию переносчика CO₂. Донором CO₂-группы служит метилмалонил-КоА. В результате реакции транскарбоксилирования образуются ЩУК и пропионил-КоА:

Ключевую реакцию брожения — превращение а-метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА катализирует кофермент В₁₂ (Ado Cbl).

Когда сбраживаемым субстратом является лактат, он сначала окисляется в пируват. Часть пирувата далее окисляется до ацетил-КоА и СО₂, причем превращение ацетил-КоА в ацетат сопровождается образованием АТФ. Получение в процессе брожения окисленных продуктов, ацетата и СО₂ уравновешивается сопутствующим восстановлением пирувата до пропионата.

Пировиноградная кислота — обязательное промежуточное соединение в брожении.

Пируват может быть превращен в пропионат несколькими путями:

1). пируват >акрилат>пропионат;

2). пируват>лактат>пропионат;

3). пируват + С ₁ >сукцинат >метилмалонат >пропионат.

Первые две возможности у пропионовых бактерий не реализуются, и образование пропионата происходит из дикарбоновой кислоты по третьему пути.

Сначала лактат окисляется до пирувата при участии флавопротеида в качестве акцептора водорода, затем в реакции транскарбоксилирования образуется оксалоацетат. Донором СО₂ служит (S)-метилмалонил-КоА, а переносчиком СО₂ — биотин. Под действием малатдегидрогеназы и фумаразы образуется фумарат, который восстанавливается до сукцината в реакции, катализирующей фумаратредуктазой. Эта реакция сопряжена с синтезом АТР путем фосфорилирования, сопряженного с переносом электронов. Далее в КоА — трансферазной реакции образуется сукцинал-КоА. Затем под действием метилмалонил-КоА-мутазы, содержащей кофермент В₁₂, осуществляется перегруппировка, ведущая к образованию ®-метилмалонил-КоА, который, однако, не является субстратом для транскарбоксилазы. Скорее всего, (S)-стереоизомер образуется при действии специфической рацемазы. В зтом случае в реакции транскарбоксилирования синтезируется пропионил-КоА, и в результате последующего переноса КоА на сукцинат образуется пропионат.

В процессе сбраживания лактата в пропионат потребляется одна молекула NADH₂. Она образуется при окислении лактата до ацетата в соответствии с суммарным уравнением реакций брожения:

Лактат + NADH₂ + ADP + Pi > Пропионат + NAD + ATP.

Реакции, ведущие к образованию пропионовой кислоты у пропионовокислых бактерий, могут быть представлены следующей последовательностью:

1) Пируват + метилмалонил-КоА (а) -оксалоацетат+пропионил-КоА

2) Оксалоацетат+пропионил-КоА

3) Сукцинат + пропионил-КоА (+ КоА-трансфераза)-сукцинил-КоА+пропионат

4) Сукцинил-КоА -(+метилмалонилизомеразая)-метилмалонил-КоА

5) Метилмалонил-КоА (в) -(+метилмалонилрацемаза)-метилмалонил-КоА (а) Суммарно: пируват + 4H⁺> пропионат.

Превращение оксалоацетата в сукцинат происходит в результате работы ферментов ЦТК: малатдегидрогеназы, фумаразы и сукцинатдегидрогеназы. Уксусная кислота образуется в результате окислительного декарбоксилирования пирувата:

6) Пируват + HAD⁺ + КоА (+пируватдегидрогеназа)-ацетил-КоА+Н⁺ + НADH + CO₂,

7) Ацетил-КоА + Ф_н (+фосфотрансацетилаза) — ацетил-Ф + КоА, ацетил-Ф + АDФ (+ацетилкиназа)-ацетат + АТФ.

Итак, разобранный выше поток реакций приводит к синтезу пропионовой кислоты. Однако пропионовокислое брожение — более сложный процесс, поскольку наряду с пропионовой кислотой в качестве продуктов брожения образуются уксусная, янтарная кислоты и CO₂ (см. рис. 1):

Рис. 1. Пути образования янтарной, уксусной кислот и CO₂ пропионовыми бактериями: Ф₁ — ФЕП-карбокситрансфосфорилаза; Ф₂ — пируватдегидрогеназа; Ф₃ — фосфотрансацетилаза; Ф₄ — ацетаткиназа

Кроме основных продуктов в разных количествах в культуральной жидкости пропионовых бактерий обнаружены молочная, муравьиная, изовалериановая кислоты, этиловый и пропиловый спирты, уксусный и пропионовый альдегиды, ацетоин, диацетил. Состав конечных продуктов брожения зависит от культуры бактерий, состава среды и условий культивирования. Это касается как видов накапливаемых продуктов, так и количественных соотношений между ними.

Соотношение продуктов брожения может быть разное и в значительной степени зависит от степени окисленности источника углерода. При росте на среде с глицерином, например, отношение пропионовая: уксусная 2:1, с лактатом 1:1,5 и пируватом 1:2. С другой стороны, при культивировании пропионовокислых бактерий в строго анаэробных условиях соотношение между количествами кислот отклоняется в обратную сторону; именно в этом случае на одну молекулу уксусной всегда образуется 3 молекулы пропионовой. Также большое влияние имеет значение концентрации ионов водорода. При увеличении концентрации ионов водорода в среде изменяется соотношение основных продуктов брожения: образование уксусной кислоты увеличивается, а пропионовой заметно уменьшается. Соотношение пропионовой и уксусной кислот зависит от состава и свойств среды и внешних условий существования микроорганизмов. В сырах в период максимального развития культуры пропионовых бактерий (первая фаза) в основном образуются относительно окисленные соединения (уксусная кислота), в период спада развития — преимущественно более восстановленные (вторая фаза). Но при замедлении развития культуры P. shermanii (замена пептона аммонийными солями) уксусная кислота превалирует перед пропионовой, однако и в этом случае отношение пропионовой кислоты к уксусной возрастает. Этот пример служит доказательством связи продуцирования кислот с составом среды. Отношение пропионовой кислоты к уксусной зависит также от вида бактерий. В среде с глюкозой и дрожжевым автолизатом пропионовокислые бактерии рода P. thonii продуцируют указанные кислоты в отношении 5:1, для P. rubrum это отношение равно 3:1 и для P. shermanii — 2:1. Для культур P. shermanii (9 штаммов) отношения пропионовой кислоты к уксусной колеблется от 1,4 до 2,8.

Между количеством организмов и количеством образующихся кислот нет прямой связи. Изменение состава карбоновых кислот в питательной среде (соли молочной, пировиноградной и янтарной кислот) значительно влияет на продуцирование пропионовой и уксусной кислот культурами P. shermanii. Отношение пропионовой кислоты к уксусной изменяется, с лактатом оно равно 1,83 (17,55:9,55), с пируватом — 0,64 (8,20:12,75) и янтарной кислотой — 2,0 (3,30:1,50). В присутствии лактозы продуцирование пропионовой кислоты происходит более энергично, чем в присутствии глюкозы. При сбраживании культурами P. jensenii пировиноградной кислоты более окисленной, чем молочная, также наблюдается, что соотношение пропионовой и уксусной кислот смещается в сторону более окисленной уксусной. Соотношение кислот зависит от состава закваски. Так, при использовании закваски с двумя культурами — L. helveticum и Str. thermophilus это соотношение ниже, чем при использовании одной L.helveticum.

Таким образом, уникальность пропионовокислого брожения обусловлена: 1) участием ФЕП — карбоксилтрансфосфорилазы фермента, не обнаруженного у других организмов, синтезирующих пропионат; благодаря наличию этого фермента, брожение, осуществляемое пропионово-кислыми бактериями, работает как циклический процесс.

2) особым способом образования пропионата, которое сопряжено с восстановлением фумарата до сукцината и окислением пирувата до ацетата и СО₂; транспорт электронов, сопровождающий эти реакции, сопряжен с окислительным фосфорилированием и синтезом АТФ;

3) высокий выход АТФ, превышающий выход АТФ в других известных брожениях. 1,5 М глюкозы могут дать пропионовокислым бактериям около 6 М АТФ.

Энергетическая эффективность пропионовокислого брожения связана также с выработкой пропионовыми бактериями новых метаболических способностей: реакций транскарбоксилирования и перегруппировки, участия в процессе КоА-производных. Образование дикарбоновой кислоты из пировиноградной с использованием механизма транскарбоксилирования вместо прямого карбоксилирования пирувата позволяет избежать дополнительных энергетических затрат на этом этапе брожения. Все это вместе взятое позволяет рассматривать пропионовокислое брожение как более совершенный из рассмотренных до сих пор способов получения энергии в анаэробных условиях.

2. Использование пропионовокислых бактерий в промышленности

Сыроделие — наиболее древняя биотехнология, использующая биохимическую активность пропионовых бактерий. Первые исследования пропионовокислых бактерий были связаны с изучением их роли в созревании сыров. Наиболее высокими органолептическими свойствами и длительными сроками хранения обладают твердые сычужные сыры с высокой температурой второго нагревания, при изготовлении которых принимают участие пропионовокислые бактерии. Общее правило, касающееся использования этих бактерий в созревании сыров, гласит: вреден как недостаток, так и избыток пропионовокислых бактерий, но без их участия сыр нужного качества изготовить невозможно; могут получаться «слепые», т. е. сыры без «глазков» или с другими дефектами. Многие пороки лучших сыров вызваны отсутствием или слабым ростом пропионовокислых бактерий.

Основная роль пропионовокислых бактерий в созревании сыров состоит в использовании лактатов, образованных молочнокислыми бактериями при сбраживании лактозы молока, при этом лактаты превращаются в пропионовую, уксусную кислоты и СО₂. Кислоты обеспечивают острый вкус сыров и участвуют в консервации молочного белка казеина; гидролитическое расщепление липидов с образованием жирных кислот важно для развития органолептических свойств сыра; образование пролина и других аминокислот, а также летучих веществ: ацетоина, диацетила, диметилсуль-фида, ацетальдегида, участвующих в формировании аромата сыра; образование углекислоты в процессе пропионово-кислого брожения лактата и декарбоксилирования аминокислот (главным образом); СО₂ участвует в создании рисунка сыра — «глазков», образовании витаминов и в первую очередь витамина В₁₂.

Созревание сыра — сложный биохимический процесс, протекающий при участии сычужного фермента, ферментов молока, молочнокислых и пропионовых бактерий. Происходят энзиматические изменения в белках, жире, аминокислотах; формируется аромат, внешний вид, консистенция сыра.

Пропионовокислые бактерии размножаются в сыре в значительном количестве в период выдерживания его в бродильном подвале, рост их продолжается в течение всего периода созревания. В результате пропионовокислого брожения образуются специфический вкус и запах, а также характерный рисунок «Швейцарского» сыра".

Пропионовокислые бактерии также применяют в хлебопечении. Их наряду с молочнокислыми бактериями и дрожжами вводят в некоторые закваски для теста с целью образования в процессе ферментации, помимо молочной и уксусной кислот, еще и пропионовой. При внесении в тесто такой закваски хлеб содержит 0,1% уксусной, 0,2% молочной, 0,1% пропионовой кислоты (по отношению к весу муки). Такого количества пропионовой кислоты достаточно для проявления фунгицидного действия, без заметного влияния на вкус и аромат выпекаемого хлеба.

Использование пропионовокислых бактерий нашло себя, хотя и незначительно, в кисломолочном производстве.

С целью обогащения витамином В₁₂ в кефир и другие молочнокислые продукты вносили пропионовокислые бактерии, повышая, таким образом, питательные свойства и лечебную ценность этих продуктов. Готовый продукт имеет однородную сметанообразную гомогенную консистенцию молочно-белого цвета, кисломолочный освежающий, слегка острый вкус. Количество клеток пропионовокислых бактерий в 1 см³ 10 единиц, молочнокислых стрептококков 10⁷.

Разбавление молока творожной сывороткой приводит к экономии молока, но вместе с тем и к разбавлению его, вследствие чего содержание в продукте сухих веществ, витаминов, белка снижается. Эти неизбежные потери компенсируются использованием в составе закваски пропионовокислых бактерий, синтезирующих белки, витамины, внеклеточные полисахариды, увеличивающие вязкость продукта.

При изготовлении сметаны применение закваски, содержащей продуценты витаминов группы В, позволяет вести процесс ее производства в одних условиях независимо от жирности сырья, при этом сквашивание ведут при 30- 32⁰С, что ускоряет процесс и позволяет получить продукт с высокими питательными свойствами. Полученный продукт богат витаминами группы В (В₁, В₂, В₁₂), фолиевой кислотой, микроэлементами, в том числе и железом, а также другими продуктами метаболизма в легкоусвояемой форме, которые обладают лечебными свойствами.

Пропионовокислые бактерии используют в основном в сыроделии при производстве сыров с высокой температурой второго нагревания и незначительно — при производстве кисломолочных продуктов. При выработке кисломолочных продуктов в качестве закваски используют пропионовокислые бактерии в комбинации с молочнокислыми бактериями.

Интенсивный путь развития молочной промышленности требует новых нетрадиционных подходов к разработке технологии молочных продуктов. Одним из важнейших направлений развития технического прогресса в области переработки молока является развитие биотехнологии, в частности применение ферментных препаратов для производства молочных продуктов. Среди ферментных препаратов, рекомендованных для пищевой промышленности, важная роль принадлежит в-галактозидазе, использование которой при переработке молочного сырья позволяет ускорить процесс молочнокислого брожения, повысить лечебные свойства и качество молочных продуктов.

Пропионовокислые бактерии также применяют для микробиологического синтеза витамина B₁₂. У пропионовокислых бактерий обнаружена способность к активному синтезу витамина B₁₂, который накапливается внутри клеток. Эта особенность используется для промышленного получения витамина B₁₂ на отходах производства (молочной сыворотке и др.) с добавлением кукурузного экстракта в качестве источника витаминов.

Заключение

Таким образом, можно сказать о том, что пропионовокислое брожение имеет ряд отличий от других типов брожения, имеет высокую продуктивность и широко применяется в микробиологической промышленности для синтеза пропионовой, уксусной кислот, цианкобаламина и других метаболитов. Для этого в производстве используют пропионовокислые бактерии. Немаловажна роль явления пропионовокислого брожения в пищевой промышленности в производстве сыров, в хлебопечении, а также при приготовлении некоторых кисломолочных продуктов.

1. Аркадьева З. А. Промышленная микробиология / З. А. Аркадьева, А. М. Безбородов, И. Н. Блохина и др. — М.: Высшая школа, 1989. — 688 с.

2. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. — М.: Мир, 1987.-567 с.

3. Лысак В. В. Микробиология / В. В. Лысак. — Мн.: БГУ, 2005. — 261 с.

4. Егоров Н. С. Биотехнология: проблемы и перспективы / Н. С. Егоров, В. Д. Самуилов. — М.: Высшая школа, 1987. — 159 с.

5. Быков В. А. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов / В. А. Быков, И. А. Крылов, М. Н. Манаков и др. — М.: Высшая школа, 1987. — 143 с.

6. Елинов Н. П. Основы биотехнологии / Н. П. Елинов. — СПб: Наука, 1995. — 600 с.

7. Беккер М. Е.

Введение

в биотехнологию / М. Е. Беккер. — Рига: 1978. — 231 с.

8. Хиггинс И. Биотехнология. Принципы и применение / И. Хиггинс, Д. Бест, Дж. Джонс. — М.: Мир, 1988. — 480 с.

9. Виестур У. Э. Биотехнология: биологические агенты, технология, аппаратура / У. Э. Виестур, И. А. Шмите, А. В. Жилевич. — Рига, 1987. — 263 с.

10. Волова Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. — Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. — 252 с.