При этом в составе гибридного белка оба эти компонента могут присутствовать одновременно. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности — присутствия нескольких копий целевого полипептида в гибридном белке, что позволяет существенно повысить выход целевого продукта.
В Великобритании синтезированы обе цепи человеческого инсулина с помощью E. coli, соединенные в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.
В Институте РАН с использованием генно-инженерных штаммов E. coli получен рекомбинантный инсулин. Из выращенной биомассы выделяется гибридный белок-предшественник, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо — отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ хромотографических очисток получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.
Для получения инсулина используют штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, состоящий из линейного проинсулина и фрагмента белка, А Staphylococcus aureus, присоединенного к его N-концу через остаток метионина [8, 9, 10].
Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.
Возможен и другой путь: получение в бактериальной системе экспрессии рекомбинантного белка, состоящего из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового «хвоста». Его выделяют с использованием хелатной хроматографии на колонках с Ni-агарозой и расщеплением бромцианом.
Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) высокоэффективной жидкостной хроматографией, показывают наличие дисульфидных мостиков, которые соответствуют дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.
В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получать белок, состоящий из присоединенного к N-концу проинсулина через остаток лизина лидерного пептида интерлейкина 2. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок с получением инсулина и С-пептида расщепляется трипсином [5, 8, 10].
Полученные инсулин и С-пептид очищаются ОФ ВЭЖХ. Весьма существенным при создании слитых конструкций является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином, соединяются по принципу «голова-хвост». ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.
Заключение
Радикальным, а в большинстве случаев единственным средством для поддержания жизни и трудоспособности больных сахарным диабетом до настоящего времени служит инсулин. До получения и внедрения инсулина в клиническую практику в течение одного-двух лет с начала заболевания больных сахарным диабетом I типа ждал летальный исход, несмотря на применение самых изнурительных диет. Больные сахарным диабетом I типа нуждаются в пожизненной заместительной терапии препаратами инсулина. Прекращение регулярного введения инсулина в силу тех или иных причин ведет к быстрому развитию осложнений и скорой гибели больного.
В настоящее время по распространенности сахарный диабет находится на III месте после заболеваний сердечно-сосудистой системы и злокачественных опухолей. Распространенность сахарного диабета среди взрослого населения, по данным Всемирной организации здравоохранения, в большинстве регионов мира составляет 2−5% и имеет тенденцию к увеличению каждые 15 лет количества больных почти в два раза. Численность инсулинзависимых больных, несмотря на очевидный прогресс в области здравоохранения, увеличивается с каждым годом и на текущий момент только в России составляет около 2 миллионов человек.
Наиболее перспективными методами получения инсулина являются методы генной инженерии. Генно-инженерный инсулин получают раздельным получением цепей, А и В с использованием разных штаммов-продуцентов и последующим фолдингом молекулы, с последующим разделением изоформ, и синтез в клетках E. Coli проинсулина с его расщеплением трипсином и карбоксипептидазой и получением нативный инсулина.
Создание препаратов отечественного генно-инженерного инсулина человека открывает новые возможности решения многих проблем диабетологии России для спасения жизни миллионов людей, страдающих сахарным диабетом.
Литература
Балаболкин М. И., Клебанова Е. М., Креминская В. М. Сахарный диабет: современные аспекты диагностики и лечения/ Доктор; под ред. Г. Л. Вышковского.-2005. М.: РЛС-2005, 2004. 960 с.
Гавриков, А. В. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека: дис. … канд. биол. наук — М, 2003 г.
Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А. Б., Якимов С. А., Клюшниченко В. Е., Арутунян А. М., Вульфсон А. Н. // Биоограническая Химия, 1997 — 23, № 2
Глик Б., Пастернак Дж. Контроль применения биотехнологических методов// Б. Глик, Дж. Пастернак / Молекулярная биотехнология = Molecular Biotechnology.
— М.: Мир, 2002. — С. 517−532.
— 589 с.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.
Девис Р., Ботстайн Д, Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий // Р. Девис, Д. Ботстайн, Дж. Рот / Пер. с англ.
М.: Мир.- 1984. 176 с.
Ермишин А. П. Генетически модифицированные организмы: мифы и реальность / А.П.Ермишин// Мн.: Тэхналогйя.- 2004. — 118 с.
Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т. П. Прищеп, В. С. Чучалин, К. Л. Зайков, Л. К. Михалева. — Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.
Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. // Л. И. Патрушев/ М.: Наука.- 2004.
Романчиков, А.Б. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / А. Б. Романчиков [и др.] // Биоограническая Химия. 1997. № 2. с. 23
Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии// В. Н. Рыбчин / 2-е изд, перераб. и доп.:
Учебник для вузов. СПб.: Изд-во СПбГТУ. — 2002. — 522 с.
Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия // Щелкунов С. Н. /Новосибирск: Сиб. унив. изд-во.-2008.
Щелкунов, С. Н. Генетическая инженерия: учеб-справ. пособие. — 2-е, изд., испр. и доп. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.
http://www.biotechnolog.ru/ge/ge31.htm
http://microbiologu.ru
http://www.mikrobiki.ru
www.gmo-compass.org
Приложение Рис. 1. Схема расположения дисульфидных связей в молекуле инсулина.
Рис. 2. Схема расположения аминокислотных остатков в молекуле инсулина Влияние инсулина на ключевые ферменты метаболизма Печень Мышцы Жировая ткань Активация 1. Фосфодиэстераза 1. Фосфодиэстераза 1. ЛП-липаза 2. Фосфофруктокиназа 2. Фосфофруктокиназа 2.
Фосфофруктокиназа 3. Пируваткиназа 3. Пируваткиназа 3. Пируваткиназа 4.
Пируватдегидрогеназный комплекс 4. Пируватдегидрогеназный комплекс 4. Ацетил-КоА-карбоксилаза 5. Фосфатаза гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы 5. Фосфатаза гликогенсинтазы б. Ацетил-КоА-карбоксилаза Индукция 1. Глюкокиназа 1 .
Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа 2. Цитратлиаза 2. Пальмитатсинтаза 3. Пальмитатсинтаза 4.
Пируваткиназа 5. Ацетил-КоА-карбоксилаза 6. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Репрессия Фосфоенолпируваткарбоксикиназа
Рис. 3 Схема биосинтеза инсулина в β-клетках островков Лангерганса. ЭР — эндоплазматический ретикулум. 1 — образование сигнального пептида; 2 — синтез препроинсулина; 3 — отщепление сигнального пептида; 4 — транспорт проинсулина в аппарат Гольджи; 5 — превращение проинсулина в инсулин и С-пептид и включение инсулина и С-пептида в секреторные гранулы; 6 — секреция инсулина и С-пептида.
Рис. 4. Общая схема синтеза инсулина из его предшественников Рис. 5 Синтез инсулина с помощью образования двух раздельных цепей
