Ферментативные и патогенные свойства криптококков-изолятов от больных и сапробионтов

Среди глубоких микозов особое место занимает криптококкоз. Возбудитель криптококкоза — базидиомицет Cryptococcus neoformans, выделен почти во всех регионах земного шара и считается грибом-космополитом. В последние десятилетия во всем мире регистрируется увеличение заболеваемости криптокоюсозом [44, 85, 171]. С. neoformans является одним из основных возбудителей менингита у больных СПИДом [141]. Все чаще выявляют случаи криптококковых инфекций у лиц подвергавшихся длительному лечению кортикостероидами или цитостатиками [171] Без лечения криптококковый менингит в 100% случаев имеет летальный исход.

По данным литературы от 6 до 10% ВИЧ-инфицированных пациентов, не получающих высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ) в Европе, и около 30% пациентов в Африке, заболевают криптокоюсозом. У ВИЧ-инфицированных, получавших ВААРТ, заболеваемость криптокоюсозом несколько снижается [29]. Полагают, что частота криптококковых инфекций в ближайшие годы будет расти в связи увеличением количества лиц, входящих в группы риска.

Во всем мире проводятся интенсивные исследования иммунной и эндокринной систем больных для выяснения механизмов патогенеза криптококкоза. В то же время биологические и биохимические особенности возбудителя криптококкоза, определяющие вирулентность патогена, в полной мере не изучены, и механизмы патогенеза до конца не ясны.

К основным факторам агрессии С. neoformans относят капсульные полисахариды и способность синтезировать меланин. Имеются экспериментальные данные о вкладе в вирулентность целого ряда свойств С. neoformans: биотипа, типа спаривания, гидролитических ферментов и секретируемых грибом среду продуктов [44, 85, 57, 58, 141]. Однако данные, полученные разными авторами, не всегда тождественны. Зарубежными исследователями активно изучаются морфобиологические особенности штаммов С. neoformans выделенных от больных. В нашей стране таких работ не проводили. Изучение морфобиологических свойств С. neoformans и их связи с патогенностью гриба представляется актуальным в плане более углубленного понимания механизмов патогенеза криптококкоза, а так же для оценки вирулентных свойств штаммов гриба, выделяемых из клинического материала.

Отсутствие специфических симптомов и, часто, незнание криптококкоза делает затруднительным постановку правильного диагноза. При этом бактериологические лаборатории в большинстве медицинских клинических учреждений не исследуют патологический материал на грибы рода Cryptococcus — мониторинг криптококкоза в России пока отсутствует, и все это является причиной того, что криптококкоз может быть только случайной находкой в большинстве районов нашей страны.

Цель и задачи работы:

Целью работы было провести скрининг экзоклеточных ферментов криптококков, выращиваемых на разных питательных средах и оценить их вклад в определение вирулентности патогенов.

1 Охарактеризовать по морфобиологическим признакам штаммы С. neoformans, провести их биотипирование и определить типы спаривания.

2 Оценить спектр экзоклеточных ферментов криптококков, выращиваемых в различных условиях.

3 Исследовать микоциногенную активность сапротрофных штаммов в отношении С. neoformans при различных условиях.

4 Изучить влияние низкомолекулярных монодии трикарбоновых кислот алифатического ряда и солей металлов в отношении С. neoformans.

5 Изучить влияние фенольных соединений на морфологию и ультраструктуру С. neoformans и создать дифференциально-диагностическую среду для выделения из патологического материала и одновременного определения возбудителя криптококкоза.

6 Сравнить на лабораторных животных вирулентность штаммов С. neoformans, различающихся по биохимическим признакам.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Большинство штаммов С. neoformans, как выделенных от пациентов, так и полученных из других коллекций, обладают двумя основными факторами вирулентности (капсула и фенолоксидаза), 20% исследованных штаммов обладают фосфолипазной и протеазной активностью, у трети из них выявлен хотя бы один из этих ферментов.

2. Микоцины сапротрофных криптококков обуславливают их киллерную активность в отношении патогенного криптококка. Некоторые сапротрофные криптококки (С. humicolus-1147) продуцируют микоцины с более широким спектром активности, тогда как другие обладают более узким спектром действия (С. laurentii -1133). В этой связи они могут быть рекомендованы для биотипирования С. neoformans.

3. Существование двух типов спаривания в жизненном цикле С. neoformans явилось исходным моментом для получения телеоморфной фазы, подтверждающей принадлежность криптококка к грибам базидиомицетового ряда. Среди культур, выделенных от пациентов, преобладают штаммы с типом спаривания альфа.

4. Среда с экстрактом зверобоя продырявленного {Hypericum perforatum) пригодна для применения в лабораторной практике для первичного выделения и идентификации С neoformans из патологического материала.

Научная новизна исследования:

Впервые проведены скрининговые исследования экзоклеточных ферментов штаммов С. neoformanSy выделенных от больных в России, а так же получена телеоморфная фаза жизненного цикла этого гриба. Установлено, что среди штаммов С. neoformans, выделенных от больных, встречаются штаммы обоих типов спаривания — альфа-типа (MAS) и а-типа (МАТа), причем первый тип является преобладающим. Исследовано влияние фенольных соединений на С. neoformans и разработана дифференциально-диагностическая среда для выделения C. neoformans из патологического материала и его одновременного определения. Впервые оценено воздействие низкомолекулярных алифатических карбоновых кислот на С. neoformans и установлено, что изомасляная и изовалериановая кислоты в низких концентрациях оказывают на криптококки значительный ингибирующий эффект. Проведено сравнительное изучение вирулентности штаммов С. neoformans, выделенных от пациентов и различающихся морфобиологическим признакамустановлено, что более вирулентными штаммами являются те из них, которые обладают более широким спектром факторов агрессии.

Практическая значимость работы:

Предложенная дифференциально-диагностическая среда может быть использована в практике микробиологических и микологических лабораторий для выделения С neoformans из патологического материала и его одновременного определения. Полученные данные о связи морфобиологических свойств и вирулентности С. neoformans могут бьггь использованы для характеристики штаммов гриба, выделяемых из клинического материала, для окончательной постановки диагноза и выбора средств лечения больных. Результаты скрещивания различных штаммов С. neoformans и микоциногенной активности сапротрофных криптококков в отношении патогенного С. neoformans могут быть использованы при составлении определителей и ключей для характеристики таксонов.

Результаты работы в целом могут служить основой для написания методических пособий по морфобиологической характеристике и биотипированию криптококков, выделенных от больных, с последующим использованием микробиологами и микологами в лабораториях лечебно-профилактических учреждений, а также в учебном процессе медицинских вузовони могут быть включены в спецкурсы по медицинской микологии.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены на ежегодных научно-практических конференциях по медицинской микологии «Кашкинские чтения» (г. Санкт-Петербург, Россия, 2000, 2001 и 2002), на 6-м конгрессе Европейской конфедерации по медицинской микологии в 2000 (г. Барселона, Испания) а так же на международной конференции «Cryptococcus and Cryprococcosis» в 1999 г (г. Лондон, Великобритания), в 2001 г (Родос, Греция) и 2002 г (г. Аделаида, Австралия).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи, 3 доклада и 5 тезисов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Биология и таксономическая характеристика Cryptococcus neoformans.

ВЫВОДЫ.

1. Нами впервые осуществлена комплексная характеристика 20 штаммов Cryptococcus neoformans, выделенных от больных в России, и 34 штаммов С. neoformans, полученных из других коллекций. Установлено, что все пггаммы-изоляты от пациентов в России, относятся к биотипу С. neoformans var. neoformans, и большинство из них обладает высокой фенолоксидазной активностью при умеренной или высокой продукции капсульных полисахаридов.

2. Исследовано 19 растительных экстрактов, содержащих полифенолы, на предмет выявления фенолоксидазы у криптококков. В результате предложена высокоэффективная дифференциально-диагностическая среда с экстрактом зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum) — для выделения С. neoformans из патологического материала и его дифференциации по образованию пигмента от других патогенных дрожжей.

3. Установлено, что высокие значения LD-50 характерны для маловирулентных штаммов с низким уровнем меланогенеза. Предложен вариант модели экспериментального криптококкоза на белых беспородных мышах при внутривенном введении патогена, с предварительным выращиванием его на среде Харада. Показано, что пассирование С. neoformans через организм мышей вызывает изменения продукции капсульных полисахаридов — она возрастает только у культур, выделенных из мозга животных, что имеет определенное значение в патогенезе экспериментального криптококкоза.

4. Установлено, что штаммы С. neoformans у обладающие двумя основными факторами агрессии умеренной активности (капсула и фенолоксидаза) более вирулентны, чем штаммы с одним сильно выраженным признаком (или капсула, или фенолоксидаза).

5. Нами воспроизведена телеоморфная стадия развития С. neoformans при экспериментальном скрещивании штаммов этого патогена. Впервые установлено, что среди штаммов выделенных в России, преобладает тип спаривания МАТа.

6. Изучена микоциногенная активность сапротрофных криптококков C. humicolus, С. podsolicus и С. laurentii в отношении С. neoformans, и впервые показана пригодность использования теста на чувствительность к микоцинам С. humicolus ВКПГУ-1147 и С. laurentii ВКПГУ-1133 для биотипирования Cryptococcus neoformans.

7. Изучено in vitro действие на криптококки алифатических карбоновых кислот, нитрата серебра и хлорохина. Изовалериановая и изомасляная кислоты, нитрат серебра оказывали цидное действие на С. neoformans, хлорохин действовал статически. Первые три вещества могут быть использованы в качестве дезинфектантовхлорохин, нарушающий меланогенез, при профилактическом оральном введении повышает выживаемость и снижает гибель зараженных криптококком белых мышей.

Практические рекомендации.

Материалы диссертации, посвященные исследованию морфобиологических свойств штаммов С. neoformans, выделенных от пациентов, и изучению жизненного цикла и телеоморфной стадии С. neoformans, используются в лекционных курсах по медицинской микологии НИИ Медицинской микологии им. П. Н. Кашкина СПб МАЛО.

Для первичной изоляции С. neoformans из патологического материала и идентификации в практике микробиологических лабораторий рекомендуется использовать дифференциально-диагностическую среду с экстрактом зверобоя продырявленного {Hypericum perforatum).

Прогностическое значение имеют морфобиологические свойства штаммов С. neoformans, выделенных от пациентов: высокой вирулентностью обладают штаммы с высокой активностью меланогенеза, повышенной продукцией капсульных полисахаридов, секретирующие экзоферментыфосфолипазу и протеазу.

Использование тестов на чувствительность к киллерным токсинам сапротрофных криптококков С. humicolus-1147 и С. laurentii —1133 позволяет дифференцировать разновидности С. neoformans.