Ассимиляция неорганического азота при водном дефиците у разных сортов яровой пшеницы

Негативному воздействию засухи в той или иной степени подвержено большинство сельскохозяйственных угодий земного шара, следствием чего является значительная потеря урожая, голод населения целых стран и континентов. Можно напомнить о глобальных потерях в сельхозпроизводстве и о большом числе человеческих жизней, ставших жертвами сильнейших засух, которые поразили многие страны Азии и Африки в начале 70-х годов (Aspinal and Paleg, 1981). Засуха одновременно вызывает обезвоживание и перегрев растений. Поэтому засухоустойчивость включает в себя как способность переносить временное или длительное обезвоживание, так и термотолерантность организма (Генкель, 1982).

Сельскохозяйственное производство является основным потребителем воды на планете. На его долю приходится более 70% всех использованных' мировых водных ресурсов. Нехватки воды приводят к снижению производства сельскохозяйственной продукции во многих странах мира. Так, по данным FAO (1996), более 230 миллионов человек из 26 стран испытывают дефицит воды не только для сельскохозяйственного производства, но и для питьевых целей. Более 19 таких стран находятся на Африканском континенте. В 2000 г., шесть из семи стран восточной Африки и все североафриканские страны, которые граничат с Персидским заливом, были подвержены жестким периодическим засухам. Все страны, находящиеся в северной части Африки за исключение Морокко испытывают острый дефицит в зерне и вынуждены импортировать более половины своих потребностей.

Северная часть Нигерии, где сосредоточенно основное сельскохозяйственное производство (зона сахелия), также испытывает частые засухи. В этой зоне рискованного земледелия выращиваются основные.

У* зерновые сельскохозяйственные культуры, такие как пшеница, кукуруза, рис, просо и другие. Южная часть страны, где выпадает много осадков, почти не пригодна для их выращивания зерна из-за сильного распространения болезней, особенно грибковых, которые практически полностью уничтожают урожай злаков. Тем не менее, в настоящее время в Нигерии остро стоит вопрос об увеличении урожайности зерновых культур (особенно пшеницы) в зоне с недостаточным количеством осадков, поскольку страна тратит огромные деньги на импорт зерновых продуктов.

Зерновые хлеба имеют важнейшее значение для населения всего земного шара, являясь основным продуктом питания человека, концентрированным кормом для сельскохозяйственных животных и сырьём для многих отраслей промышленности. Пшеницу поистине можно назвать универсальной культурой, так как она возделывается практически повсеместно. Основной продукт, получаемый из пшеницы, — хлеб. Кроме того, пшеничную муку широко используют для приготовления различных кондитерских и макаронных изделий (Павлюков В.Г.1988). По данным FAO (1994), пшеницу выращивают на площади 216 млн. га, что составляет 29,1% посевов зерновых культур в мире. Большая часть площадей (86 833 тыс. га) размещена на Азиатском континенте, затем следуют Северная Америка (36 734 тыс. га), Европа (25 987 тыс. га), Африка (8801 тыс. га), Южная Америка (7427 тыс. га), Австралия и Океания (7036 тыс. га).

Основными производителями пшеницы в Азии являются Китай (30 501 тыс. га), Индия (24 437 тыс. га), Казахстан (12 620 тыс. га) и Турция (9600 тыс. га) — в Африке — Марокко (3050 тыс. га), Алжир (1700 тыс. га) и ЮАР (1079 тыс. га) — в Южной Америке — Аргентина (5042 тыс. га) и Бразилия (1369 тыс. га) — в Северной Америке — Соединенные Штаты Америки (24 998 тыс. га), в ЕвропеРоссия (22 146 тыс. га), Украина (4507 тыс. га) и Польша (2407 тыс. га).

Средняя урожайность пшеницы в мире 2,45 т/га (ФАОД994). Максимальная урожайность получена в странах Европы (4,60 т/га) и Северной Америке (2,45 т/га), минимальная — на Африканском континенте (1,9 т/га) и в Австралии (1,2 т/га). Самый высокий урожай на единицу площади был зарегистрирован в Нидерландах (8,067 т/га), Ирландии (7,5 т/га) и.

Великобритании (7,18 т/га), самый низкий — в Эквадоре (0,67 т. га), Эфиопии (0,54 т/га) и Сомали (0,37 т/га).

Статистика FAO (1995;2000) показывает, что за последние пять лет (1995;2000) активно растут площади по производству пшеницы в Нигерии, которые составляют около 36 233 га. Для того чтобы поддерживать высокий уровень производства данной культуры в условиях дефицита воды, необходимо исследовать физиологические причины потери урожая пшеницей в засушливом климате. Таким образом, проблемы сельхозпроизводства Нигерии, как и многих других стран мира, ставят перед физиологией растений первостепенные задачи в области изучения механизмов адаптации зерновых, и в первую очередь пшеницы, к условиям засухи.

В настоящее время известно, что большинство сельскохозяйственных культур испытывают при водном дефиците острый недостаток азота, что приводит к существенной потере урожая. Однако причины «азотного голодания» растений при недостатке воды в настоящее время не исследованы. Изучение механизмов ассимиляции неорганического азота растениями пшеницы в условиях засухи имеет первостепенное значение для разработки правильной технологии азотного питания при водном дефиците, а выяснение молекулярных нарушений азотного метаболизма позволит в будущем получить стресс-толерантные высокопродуктивные трансгенные сорта пшеницы, способные давать высокие урожаи в зонах рискованного земледелия.

Исходя из выше сказанного, цель данной работы заключалась в выяснении механизмов ассимиляции неорганического азота различными по засухоустойчивости растениями пшеницы в условиях водного дефицита. Нами была высказана рабочая гипотеза, согласно которой растения испытывают «острый азотный голод» в условиях засухи из-за повреждения систем транспорта нитрата и (или) механизмов его ассимиляции. Ключевым ферментов восстановления нитратов является нитратредуктаза (HP), которая определяет скорость протекания данного процесса у растений и, в конечном счете, эффективность азотного питания. Для проверки высказанной гипотезы перед нами стояли следующие конкретные задачи:

1) Из пяти российских сортов пшеницы, выявить в условиях вегетационного опыта и водной культуры два контрастные по засухоустойчивости сорта, используя для этой цели как физиологические (ростовые параметры, прорастание семян, водный статус), так и биохимические (содержание пролина, уровни хлорофиллов, а и b и их соотношение) параметры оценки.

2) Дать физиолого-биохимическую характеристику реакции этих двух выбранных сортов на прогрессирующую почвенную засуху, а также сравнить их репарационные возможности в условиях восстановления.

3) Исследовать способность двух сравниваемых сортов ассимилировать неорганический азот в нормальных условиях и при стрессе, основываясь на концентрационной и временной зависимостях субстратной индукции нитратредуктазы — скорость-лимитирующего фермента процесса усвоения растениями нитрата.

4) В строго контролируемых условиях изучить кинетические характеристики систем транспорта нитрата у двух сравниваемых сортов пшеницы в условиях засухи и сопоставить их возможности транспортировать нитрат при водном дефиците в зависимости от уровня засухоустойчивости растений.

Научная новизна. В условиях вегетационных и модельных опытов, основываясь на физиологических и биохимических критериях, сопоставлена засухоустойчивость 5 различных районированных в России сортов яровой пшеницы, среди которых были выделены сорта с относительно низкой (сорта Комета и Белорусская), средней (Приокская) и высокой (Саратовская 29 и ржано-пшеничный гибрид) засухоустойчивостью. Впервые обнаружены существенные различия между сортами в их репарационной способности и установлена четкая количественная зависимость между степенью воздействия засухи и уровнем содержания пролина в рассчете как на свежую, так и на сухую массу тканей листьев. Показано, что в ответ на действие засухи более устойчивые сорта меньше накапливают пролина в ответ на единицу уменьшения содержания воды (на 1%). Исследование концентрационной и временной зависимостей индукции нитратредуктазы показало, что понижение водного потенциала среды до -2,5 МПа приводит к резкому ингибированию процесса ассимиляции нитратного азота в растениях пшеницы. При этом не выявлено достоверных различий между двумя контрастными сортами по их способности усваивать неорганический азот в условиях засухи. Впервые доказаны стабильность и эффективность функционирования систем активного транспорта нитрата в условиях водного дефицита у засухоустойчивых сортов растений пшеницы, что проявляется в резком ингибировании скорости транспорта нитрата у неустойчивого сорта Приокская и, напротив, в дальнейшей стимуляции этого процесса у сорта Саратовская 29. Впервые сделан вывод, согласно которому большая засухоустойчивость сорта определяется резистентностью систем транспорта нитрата к водному дефициту, а не эффективностью его ассимиляции.

Практическая значимость. Теоретические обобщения, сделанные на основании впервые полученных в этой работе экспериментальных данных, могут быть использованы селекционерами при получении новых засухоустойчивых сортов пшеницы, обладающих способностью активно транспортировать нитрат при низком водном потенциале, а также в общих курсах лекций по физиологии растений, в спецкурсах по экологической физиологии и азотному метаболизму для студентов биологических факультетов университетов и вузов страны.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на IV Съезде Общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений — наука III тысячелетия».

Москва, 4−9 октября 1999), на выездной сессии Общества физиологов растений России и Научного совета по физиологии растений и фотосинтезу РАН (Нижний Новгород, октябрь, 2000 г), на Международной конференции по экологии растений (Сыктывкар, октябрь 2001), на конференции профессорско-преподавательского состава РУДН в 2001 г., а также на заседаниях кафедры ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии РУДН.

Публикация. По материалам диссертации было опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации

: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, рисунковбиблиография содержит 247 названий, в т. ч. 223 на иностранных языках.

107 ВЫВОД.

1. Исследование адаптации различных сортов пшеницы к засухе показало, что в условиях понижения водного потенциала почвы растения отвечали снижением накопления биомассы, падением оводненности тканей ассимилирующих органов, аккумуляцией осмолитов (в частности, пролина). Установлено значительное различие исследованных сортов яровой пшеницы по устойчивости к засухе, среди которых можно выделить сорта с относительно низкой (сорта Комета и Белорусская), средней (Приокская) и высокой (Саратовская 29 и ржано-пшеничный гибрид) резистентностью. Обнаружены существенные различия между сортами в их репарационной способности.

2. Обнаружена четкая количественная зависимость между степенью воздействия засухи и уровнем содержания пролина в расчете как на свежую, так и на сухую массу тканей. Показано, что более устойчивые сорта показывают относительно меньшее накопление пролина в ответ на единицу уменьшения содержания воды (на 1%).

3. Продемонстрировано, что остановка роста (прежде всего колеоптиля) в ответ на понижение водного дефицита является одной из наиболее быстрых стрессорных реакций. Биохимические параметры, такие как отношение содержания хлорофилла, а к хлорофиллу Ь, у устойчивого сорта Саратовская 29, практически не изменяются с понижением водного потенциала, тогда как у сорта Приокская, наоборот, наблюдается возрастание отношения хлорофилла, а к Ь, что существенно отклоняется от физиологической нормы.

4. Установлено, что растения пшеницы преимущественно ассимилируют неорганический азот в листьях, а не корнях, о чем свидетельствуют результаты изучения временныхи концентрационных зависимостей субстратной индукции активности HP.

5. Показано, что понижение водного потенциала среды до -2,5 Мпа приводит V резкому ингибированию процесса ассимиляции нитратного азота в рас1 ениях пшеницы. При этом отсутствуют достоверные различия между дву^я сортами по способности усваивать неорганический азот в условиях за^Ух*1.

6. Сравнитель>10е изучение динамики транспорта нитрата у различных по засухоустойчивости сортов, предварительно выращенных, в условиях пониженно?0 водного потенциала показало, что интенсивность нитратного транспорта у обоих сортов возрастала при увеличении его концентрации в среде с 0,01 до 1,0 мМ. При этом проростки сорта Приокская показывали линейное увеличение поглощения нитрата в период вреМени от 1 до 10 час, тогда как проростки сорта Саратовская 29 обнаруживали лаг-фазу продолжительностью 3 часа, после которой интенсивность поглощения нитрата резко возрастала, значительно превышая cf °Р0СТЬ поглощения нитрата у сорта Приокская.

7. Впервые пр<)ДемонстРиРована стабильность функционирования систем активного транспорта нитрата в условиях водного дефицита у засухоустой'<�ивого сорта, Саратовская 29, но не у сорта Приокская. Анализ кин^ических параметров транспорта пшеницы при водном дефиците псзволил продемонстрировать, что в контрольных условиях (А|уН2о =0 МПа) кинетические параметры у обоих сортов не имеют достоверных различий и составляют следующие величины: Км = 0,4 — 0,9 мМ и Vmax" ^>3−0,6 мкмол/час. г. св. массы. Оценка величин Км и Vmax с понижением водного потенциала культурной среды свидетельствует о том, что происходит репрессия переносчиков у проростков неустойчиво г ° сорта Приокская, тогда как у засухоустойчивого сорта.

Саратовская 29 наблюдается либо активация, либо синтез переносчиков нитрата по мере понижения Лц/шо от 0 до -2,0 Мпа.

8. Совокупность всех полученных данных позволяет заключить, что одной из причин большей засухоустойчивости сорта Саратовская-29 по сравнению с Приокской является более высокая стабильность функционирования транспортных систем в условиях низкого водного потенциала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Полученные в диссертационной работе экспериментальные данные впервые позволили понять причину развития «азотного дефицита» в растениях пшеницы в условиях почвенной засухи, следствием, которого является резкое падение урожая зерна. Для решения этой задачи необходимо было иметь контрастные по засухоустойчивости сорта. Подобные сорта Саратовская-29 (устойчивый сорт) и Приокская (неустойчивый сорт) были отобраны на основании исследования ряда наиболее существенных физиологических (скорость роста, аккумуляция биомассы, водный статус организма) и биохимических (аккумуляция пролина как стресс-протекторного соединения, изменение содержания хлорофилла) показателей ответа растений на понижение водного потенциала, а также оценки их репарционных возможностей на этапе восстановления.

Для водной культуры использовано 2 сорта, различающихся по степени засухоустойчивостиСаратовская 29 как более засухоустойчивый сорт и Приокская — менее засухоустойчивый. Данный подход использовался для оценки ответной реакции растений в начале онтогенеза.

Известно, что одной из первых реакций растений при водном дефиците является ингибирование роста клеток (Hsiao, 1973). Как следует из полученных данных, рост исследуемых сортов пшеницы при засухе был поддавлен.

Нами было показано в условиях водной культуры, что ростовые реакции корней и колеоптилей растений исследуемых сортов различны. Прежде всего, в начальной фазе развития рост корней в меньшей степени ингибировался по сравнению с ростом колеоптилей. Снижение скорости роста колеоптилей по сравнению с ростом корня может быть обусловлено нарушением градиента водного потенциала между зонами снабжения воды и роста колеоптиля (Westgate and Воуег, 1985). Сравнительная устойчивость роста корней при водном дефиците может быть объяснена наличием процесса осморегуляции, необходимого для частичного восстановления тургора и создания подходящего градиента водного потенциала для поглощения воды корнем. Кроме того, в этих условиях происходит процесс разрыхления клеточной стенки, что существенно для роста корня растяжением. Иная картина наблюдается у побега. При водном дефиците процесс осморегуляции происходит медленно, а разрыхление клеточной стенки или происходит не значительно или даже снижается. Все это ведет к торможению роста побега по сравнению с ростом корней. В разрыхлении клеточной стенки корней принимают участие белки клеточной стенки, т. е. экспансины. Кроме того, в данном процессе участвует гормоны, а именно АБК. Нужно еще обратить внимание на тот факт, что процесс транспорта воды тоже существенно влияет на реакции этих органов при водном дефиците (Hsiao and Xu, 2000).

Известна ключевая роль хлорофилла в процессе фотосинтеза. В комплексе пигментов-«сборщиков», хлорофилл, а находится в центральной части, а хлорофилл b — на периферии. Разрушение хлорофилла b в этой системе приводит к тому, что белки, находящиеся на периферии комплекса быстро деградируют. Из полученных нами данных следует, что при 15% ПЭГ в среде содержание хлорофилла b снижается в 4 раза у сорта Приокская, вследствие чего соотношение хлорофилла, а к хлорофиллу b отклоняется от физиологической нормы. У устойчивого сорта Саратовская 29 содержание хлорофилла b снижается в 2 раза, а соотношение хлорофилла, а к хлорофиллу b находится приблизительно на одном уровне. Это может означать, что устойчивость данного сорта заключается в сохранении структурной целостности комплекса пигментов-сборщиков.

Известно также и метаболитические последствия ингибирования роста растений, например, при котором наблюдается увеличение концентрации промежуточных продуктов метаболизмаконечных метаболитовионов и кофакторов, при условии, что уровень снабжения этими продуктами зоны роста не изменяется (Barlow et al., 1980; Hanson and Hitz, 1982). Аккумуляция растворенных веществ также играет большую роль при адаптации растений к условиям водного дефицита (Morgan, 1984) и засоления (Wyn Jones et al., 1977;

Greenway and Munns, 1980). Представленные нами данные показали что, у исследуемых сортов, Саратовская 29 и Приокская, накапливается большее содержание пролина в листьях, чем в корнях при наступлении водного дефицита. Причем содержание пролина значительно увеличивается с падением водного потенциала. Можно предполагать, что процесс осморегуляции и есть одна из стратегий адаптации растений к осмотическому стрессору (Wyn Jones et al., 1977; Morgan, 1984).

Исследование временной и концентрационной зависимостей активности HP в контрастных по засухоустойчивости сортах пшеницы в нормальных условиях и при стрессе дало возможность прийти к выводу, что процесс ассимиляции нитратного азота в условиях низкого водного потенциала крайне нестабилен в обоих исследованных сортах пшеницы не зависимо от уровня их засухоустойчивости. Это означало, что по способности ассимилировать азот в условиях водного дефицита два контрастные сорта принципиально не различались.

Часто лимитирующим фактором ассимиляции нитратов при различных стрессовых условиях является их доступность для тех метаболитических компартментов, которые содержат нитратредуктазу и в которых локализованы внутриклеточные процессы нитратного восстановления (Adamovicz, 1980; Токарев и Пеккер, 1983). В свою очередь поток нитратов к месту их восстановления контролируется переносчиками нитратов в плазмалемме и в тонопласте (Токарев, 1984). Данные нашей работы свидетельствуют о том, что первичный эффект возрастающего водного дефицита на восстановление нитратов связан с нарушением процесса его транспорта через мембрану.

В наших опытах мы использовали ионоселективный электрод для измерения поглощения иона нитрата. Ионоселективные электроды представляют удобный инструмент для контроля над поглощением ионов, поскольку позволяют вести непрерывные измерения в постоянном объеме раствора. Основной недостаток ионоселективных электродов связан с их низкой селективностью, что затрудняет измерения в питательных многокомпонентных растворах. Поэтому мы отказались от традиционных питательных растворов, в экспериментах использовались проростки «низкосолевого статуса», т. е выращенные на растворе CaSC>4.

Для характеристики транспортной активности корневой системы использовали кинетические параметры Vmax и Км. Нужно отметить, что кинетические параметры нетто-поглощения не являются характеристиками каких-либо транспортных белок, поскольку объектом исследования служат интактные растения. Неттопоглощение представляет сумму притока ионов в клетку и оттока в окружающий раствор. Приток нитрата включает как активный, и так пассивный компоненты.

Анализ имеющихся в литературе данных предполагает существование нескольких путей регуляции нетто-поглощения нитрата в зависимости от концентрации М)" з в среде и содержания ионов в органах растения: а) индукция/репрессия синтеза транспортных белковб) модификация активности транспортной системы.

В оптимальных условиях произрастания растений может наблюдаться повышение максимальной скорости поглощения нитратов, что отражает синтез переносчиков в процессе индукции. Снижение Км свидетельствует о возрастании сродства транспортной системы к М)~з, причиной которого может быть новообразование переносчиков с высоким сродством к субстрату. Это предполагает существование разных транспортных белков, представляющих, конститутивный и индуцибельный компоненты активного транспорта нитрата. Конститутивные переносчики нитрата изучены очень слабо, а вопрос об их идентичности индуцибельным белкам остается открытым.

Совокупность представленных экспериментальных данных свидетельствует также о большей эффективности функционирования систем мембранного транспорта нитратов у растений засухоустойчивого сорта пшеницы, по сравнению с неустойчивыми формами. Существенно, что это различие обнаруживается лишь при стрессе, а не при оптимальных условиях произрастания. Как следует из полученных данных, понижение водного потенциала среды выращивания растений (до -2,0 МПа) приводит к резкому ингибированию скорости транспорта нитрата у сорта Приокская и, напротив, к дальнейшей стимуляции этого процесса у сорта Саратовская 29 (рис. 23). Это позволяет сделать вывод о большей стресс-толерантности систем транспорта нитрата у засухоустойчивых растений пшеницы, по сравнению с неустойчивыми. Различия между двумя сортами обнаруживаются также на уровне кинетических параметров функционирования процесса транспорта нитрата при водном дефиците. Помимо этого, у неустойчивого сорта наблюдается функционирование механизма прямого отрицательного воздействия уменьшения водного потенциала на транспорт нитратов, тогда как у засухоустойчивого сорта водный дефицит оказывает на поглощение нитратов более сложный эффект. В течение первых 3-х час действия осмотика проростки сорта Саратовская 29 не способны транспортировать нитрат. После этого лаг-периода скорость поглощения NCV проростками этого сорта многократно возрастает. Одновременно возрастает и устойчивость переносчиков нитрата к водному стрессу. Для объяснения этих данных следует допустить, что понижение водного потенциала в засухоустойчивом сорте пшеницы инициирует модификацию конформационного состояния нитратного переносчика и (или) индуцирует синтез качественно новых макромолекул, участвующих в поглощении нитрата, следствием чего и является повышение стабильности и эффективности функционирования нитрат-транспортирующих систем при стрессе.

Таким образом, в данной работе впервые показано, что растения с высоким уровнем засухоустойчивости, в отличие от незасухоустойчивых форм, характеризуются системами мембранного транспорта нитрата, способными эффективно функционировать в условиях низкого водного потенциала. Эти различия в функционировании переносчиков нитрата проявляются лишь при стрессе и основываются на изменениях кинетических параметров транспортных процессов, что, в свою очередь, является следствием их стресс-зависимой модификации и (или) стресс-зависимого синтеза.

106 качественно новых макромолекул, обладающих транспортными или регуляторными свойствами. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на проблему реализации адаптационного потенциала растений в связи с функционированием систем транспорта неорганического азота в стрессорных условиях.