Экспериментальное обоснование применения иммобилизированной дезоксирибонуклеазы I типа при лечении системной красной волчанки

Несмотря на достигнутые к настоящему времени успехи, лечение больных системной красной волчанкой (СКВ) остается одной из наиболее сложных проблем клинической ревматологии, часто создавая существенные затруднения даже для высококвалифицированных специалистов. Причинами такой ситуации являются не только выраженный полиморфизм клинической картины заболевания и нередкое вовлечение в патологический процесс внутренних органов с развитием как хронической дисфункции последних, так и жизнеугрожающих ургентных состояний. При разработке тактики ведения больных СКВ весьма значительные ограничения налагает несовершенство используемых ныне методов лечения.

Основу общепринятого алгоритма лечения СКВ составляет неизбирательная медикаментозная иммуносупрессия, создаваемая с помощью глюко-кортикостероидов, цитостатических препаратов (азатиоприн, циклофосфа-мид) и производных 4-аминохинолина [23- 24]. Потенцирование эффекта иммунодепрессантов может быть достигнуто посредствомплазмафереза или некоторых других экстракорпоральных процедур [65- 215- 288]. Все перечисленные препараты и методы были введены в клиническую практику на рубеже 70-х — 80-х гг. XX века и применяются до настоящего времени, несмотря на наличие существенных недостатков. Главным изъяном глюко-кортикоидов и традиционных цитостатических иммунодепрессантов является большая частота потенциально опасных побочных эффектов, включая интеркуррентные инфекции, остеопороз, асептический некроз костных структур, гемоцитопении, возникновение неходжкинских лимфом и геморрагического цистита [205]. Крайне узкий терапевтический диапазон указанных препаратов определяется дозозависимостью как лечебного эффекта, так и риска осложненийданная закономерность справедлива и для комбинации иммунодепрессантов [204]. Вследствие этого попытки полного подавления активности СКВ с помощью традиционных методов лечения, ка^с правило, не приводят к увеличению выживаемости.

С середины 2000;х гг. наблюдается активизация поиска новых средств избирательного воздействия на механизмы аутоиммунного воспаления при СКВ. Наряду с внедрением в практику менее токсичных иммунодепрессан-тов, включая микофенолата мофетил и циклоспорин, А [290- 335], наиболее перспективными разработками в области фармакотерапии СКВ в настоящее время считаются моноклональные антитела против поверхностных маркеров В-лимфоцитов (СБ20 и СЭ22), цитокинов, элементов систем, регулирующих созревание иммунокомпетентных клеток и взаимодействие между ними [49- 195- 261]. Предложены, также ДНК-содержащий В-клеточный толероген абетимус-натрий (ЫР394) и пептид ТУ-4710, связывающий антитела к двуспиральной ДНК (анти-дсДНК) [450- 243]. Совершенствование экстракорпоральных методов лечения СКВ производится преимущественно путем создания иммуносорбционных процедур, более избирательно удаляющих из кровотока^О либо его отдельные фракции: иммунные комплексы (ИК) и анти-дсДНК [65- 249].

Как традиционные, так и инновационные методы лечения СКВ направлены в основном на снижение влияния патогенных аутоантител, которое осуществляется путем либо подавления их синтеза, либо удаления преформиро-ванных иммуноглобулинов> из кровотока. Этот подход является общим для многих аутоиммунных заболеваний, при которых преобладает активация гуморального звена, поскольку возможность влияния на второй компонент аутоиммунной реакции, аутоантигены, как правило, крайне ограничена. Однако при СКВ ведущие аутоантигены — внеклеточные дезоксирибонуклео-протеиды ядерного происхождения — являются, согласно современным представлениям, лишь продуктом распада клеток и не несут какой-либо значимой физиологической функции [346]. Данное обстоятельство предоставляет возможность альтернативного способа влияния на патогенность системы ДНКанти-дсДНК путем элиминации аутоантигена, и, тем самым, преодоления вышеупомянутых ограничений при лечении СКВ. Удобным инструментом такого воздействия может стать дезоксирибонуклеаза I типа (ДНКаза I) — фермент, одной из физиологических функций которого является разрушение ДНК и нуклеопротеидов [140- 422].

С учетом вышеуказанных обстоятельств, представляется актуальным оценить эффективность и переносимость ДНКазы I при лечении СКВ, используя изолированную кровь больных СКВ и экспериментальную модель данного заболевания на лабораторных животных. Принимая во внимание значительные фармакодинамические и фармакоэкономические преимущества [9], представляется целесообразным реализовывать эффект ДНКазы I путем экстракорпоральной перфузии крови через иммобилизированную форму фермента. С учетом отсутствия в настоящее время валидных моделей СКВ, пригодных для экстракорпоральных процедур, для достижения поставленных задач необходимо модифицировать существующие способы воспроизведения нарушений катаболизма ДНК применительно к лабораторным животным достаточного размера.

Для уменьшения высвобождения в кровоток патогенных анти-дсДНК, содержащихся в иммунных комплексах, при перфузии через иммобилизированную ДНКазу I in vivo целесообразно применение в качестве адъюванта иммобилизированного Clq-компонента комплемента. Последний, являясь лигандом агрегированных IgG и IgM, способен фиксировать содержащие анти-дсДНК промежуточные продукты энзиматической реакции — низкои среднемолекулярные ИК, а также потенцировать ферментативную активность ДНКазы I [144- 399- 455]. Важное преимущество иммобилизированной формы Clq — отсутствие активации системы комплемента, которое во многом определяется прочностью связи Clq с носителем.

Цель исследования.

Цель данного исследования — усовершенствование лечения больных системной красной волчанкой путем разработки нового метода экстракорпоральной перфузии крови через магнитоуправляемые гранулы с иммобилизи-рованной ДНКазой I.

Основные задачи исследования.

1. Иммобилизировать ДНКазу I и Clq в составе магнитоуправляемых гранул;

2. Исследовать влияние перфузии изолированной крови больных СКВ через магнитоуправляемые гранулы с иммобилизированной ДНКазойЛ на концентрацию ДИК, циркулирующих иммунных комплексов, антител к двуспираль-ной ДНК, а также форменных элементов и общего белка крови;

3. Выявить наличие статистических взаимосвязей между клиническими особенностями СКВ и выраженностью эффекта перфузии изолированной крови пациентов через ДНКаза I-содержащие магнитоуправляемые гранулы, оцениваемого посредством измерения концентраций ДНК, циркулирующих иммунных комплексов, антител к двуспиральной ДНК, а также форменных элементов и общего белка крови;

4. Адаптировать экспериментальную модель нарушения катаболизма нук-леопротеидов при СКВ для исследования экстракорпоральной перфузии крови на крысах. Охарактеризовать валидность модифицированной модели в отношении изучаемых показателей;

5. Оценить воздействие однократной экстракорпоральной перфузии крови in vivo через смесь ДНКаза Iи Clq-содержащих магнитоуправляемых гранул на интенсивность фиксации антител к двуспиральной ДНК в почках, плазменную концентрацию ДНК, циркулирующих иммунных комплексов и антител к двуспиральной ДНК по результатам рандомизированного плацебо-контролируемого исследования на экспериментальной модели СКВ;

6. Изучить безопасность рассматриваемого метода лечения в асйекте острой гепато-, нефрои гематологической токсичности в рамках рандомизированного плацебо-контролируемого исследования на экспериментальной модели СКВ.

Научная и практическая новизна.

Впервые продемонстрирована вариабельность эффекта иммобилизиро-ванной ДНКазы I на циркулирующие нуклеопротеиды в зависимости от клинических особенностей СКВ.

Впервые разработана и валидирована экспериментальная модель нарушений катаболизма ДНК при системной красной волчанке, пригодная для изучения экстракорпоральных методов лечения.

Впервые выполнена доклиническая оценка эффективности и переносимости экстракорпоральной перфузии крови in vivo через смесь ДНКаза Iи С lq-coдержащих магнитоуправляемых гранул в соответствии с требованиями доказательной медицины.

Впервые на экспериментальной модели показана эффективность однократной экстракорпоральной перфузии крови крыс in vivo через смесь ДНКаза Iи Clq-содержащих магнитоуправляемых гранул для предупреждения фиксации в почках антител к двуспиральной ДНК, а также4-уменьшения концентрации циркулирующих нуклеопротеидов. Кроме того, при использовании данного метода лечения не выявлено признаков острой гепато-, нефро-и гематологической токсичности.

Положения, выносимые на защиту.

Иммобилизированная на магнитоуправляемых гранулах ДНКаза I способна разрушать циркулирующую ДНК в крови как больных СКВ, так и экспериментальных моделей, воспроизводящих основные нарушения катаболизма нуклеопротеидов при данном заболевании.

Экстракорпоральная перфузия крови крыс in vivo через смесь ДНКаза I-и Clq-содержащих магнитоуправляемых гранул в рамках острого эксперимента позволяет уменьшить как содержание циркулирующей ДНК, так и выраженность нефритогенного эффекта антител к двуспиральной ДНК, введённых животным.

При экстракорпоральной перфузии крови крыс in vivo через смесь ДНКаза Iи Clq-содержащих магнитоуправляемых гранул не выявлено признаков острой токсичности, связанных с данной процедурой.

Соответствие диссертации паспорту специальности.

Цель данной диссертации, определенная как усовершенстёование лечения больных системной красной волчанкой путем разработки нового метода экстракорпоральной перфузии крови через магнитоуправляемые гранулы с иммобилизированной ДНКазой I, соответствует формуле и области исследования специальности «ревматология» в аспекте разработки новых методов иммуносупрессивной и иммуномодулирующей терапии СКВ, а также создания комплексного подхода к коррекции иммунопатологических нарушений с использованием патогенетической терапии. Основные результаты диссертационного исследования, имеющие научную и практическую новизну, отвечают пунктам 2 и 4 паспорта специальности «ревматология».

Внедрение в практику Результаты диссертационного исследования внедрены в практику работы НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН (г. Волгоград). Информация, полученная в ходе данной работы, была использована при получении патента РФ на изобретение № 2 356 585 (приложение 5).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из которых 6 — в центральной печати и 5 — в местной печати.

Апробация диссертации Основные положения диссертации были представлены на итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (2007 — 2010 г г), 80-й конференции студенческого научного общества Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И. И. Мечникова «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2007 г), III Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2008 г), XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010 г). Первичная экспертиза диссертации была проведена на совместном заседании Ученого совета НИИ КиЭР РАМН и кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет"20года (протокол.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением использованных методов исследования, клинической характеристики пациентов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Работа иллюстрирована 37 рисунками и 27 таблицами. Библиографический указатель включает 460 источников, в том числе 75 — на русском языке и 385 — на иностранных языках. Диссертация дополнена 7 приложениями.

Выводы.

1. Иммобилизированная на магнитоуправляемых гранулах ДНКаза I способна разрушать ДНК, находящуюся в свободном и связанном с иммуноглобулинами состоянии в изолированной крови пациентов с системной красной волчанкой. Степень снижения обеих, фракций циркулирующей ДНК увеличивается при высокой активности заболевания, наличии поражения центральной нервной системы и почек;

2. Моделирование нарушений катаболизма ДНК при системной красной волчанке путем интраперитонеального введения крысам хроматинсодержа-щего экстракта с последующей внутривенной инъекцией антител к двуспи-ральной ДНК может быть использовано для доклинической оценки эффективности и безопасности экстракорпоральных методов ле чения с истемной красной волчанки. Особенностью данной модели является значительное увеличение концентрации лейкоцитов крови;

3. При использованиимодели нарушений катаболизма ДНК при системной красной волчанке в ходе рандомизированного контролируемого исследования, в группе крыс, подвергшихся однократной экстракорпоральной перфузии кровиЛп vivo через смесь ДНКаза Iи Glq-содержащих магнитоуправляемых гранул, выявлено снижение средних концентраций ДНК, циркулирующих иммунных комплексов и креатинина в крови, а также уменьшение количества, фиксированных в почках антител к двуспиральной ДНК по сравнению с плацебо;

4. Изучение безопасности экстракорпоральной перфузии крови крыс in vivo через смесь ДНКаза Iи Clq-содержащих магнитоуправляемых гранул в рамках острого эксперимента не выявило значительного снижения содержания форменных элементов и не благоприятных изменений сверт ываемости крови, а также признаков гепатотоксичности. Нарастание концентрации креатинина крови, существенно более выраженное в группе плацебо, вероятно, отражало нарушение функции* почек вследствие выполнения моделирующих процедур.