Фаговый дисплей мышиных миниантител: получение и использование

Антитела (Ig) — один из инструментов иммунной системы, медиатор гуморального иммунитета. Они продуцируются потомками В-лимфоцитов — плазматическими клетками и обладают уникальным сродством к антигену, индуцировавшему их выработку. Связывание антитела с антигеном запускает каскад реакций, приводящий к удалению антитела из организма, а именно, активацию системы комплемента, усиление фагоцитоза.

Высокоспецифичное, высокоаффинное взаимодействие антитела с антигеном позволяет использовать антитела в исследовательских, аналитических и терапевтических целях. Антитела широко используются в иммуноанализе (ИФА, РИА и проч.), позволяя детектировать и количественно определять пикомолярные концентрации вещества в сложных смесях, например в сыворотке крови. Широчайшим образом антитела используются в настоящее время для анализа субпопуляционного состава клеток крови (метод проточной цитометрии), что позволяет характеризовать иммунный статус организма. С помощью изотопно-меченных антител проводится локализация в организме очагов опухолевого роста. В терапевтических целях антитела применяются для нейтрализации токсинов. Разрабатываются подходы к использованию антител в терапии злокачественных опухолей. Антитела находят применение в научных исследованиях для выделения (иммуноаффинная хроматография) и характеристики биомолекул.

Исторически первым источником антител была сыворотка иммунных животных и человека. Получаемые таким образом антитела содержат набор иммуноглобулинов различных классов и подклассов, специфично узнающих свой антиген. Различные антитела сыворотки узнают несколько участков (эпитопов) антигена. Таким образом, сыворотка полиспецифична, что в ряде случаев является недостатком. Дальнейшим развитием способов получения антител явилось создание гибридомной технологии, которая позволяет получать антитела, продуцируемые одним клеточным клоном, узнающие один эпитоп и сохраняющие свои свойства во многих генерациях гибридной клетки. К достоинствам моноклональных антител можно отнести высокую специфичность, возможность получения их в больших количествах и одинаковой специфичности. К недостаткам можно отнести то, что технология получения моноклональных антител разработана для мыши и крысы и является трудно применимой в случае антител человека, в то время как для терапевтических нужд требуются именно человеческие иммуноглобулины. Затруднения возникают и в тех случаях, когда иммунизация животных по. какой-либо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител. В 1990 году было показано, что антиген-связывающие. фрагменты aimiTen (scFv, Fab), представленные на поверхности нитевидного фага, могут быть отобраны на иммобилизованном антигене [McCafferty, 1990]. Основной идеей метода является создание комбинаторной библиотеки, в которой вариабельные участки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов соединены случайным образом и представлены на поверхности бактериофага. Каждый бактериофаг, как и В-лимфоцит, экспрессирует антитело единственной специфичности. При достаточно большом размере библиотеки репертуар вариабельных участков будет сравним с репертуаром антител в организме. К достоинствам метода можно отнести следующие:

1. Возможность отбора антител in vitro, минуя стадии иммунизации животных.

2. Отсутствие необходимости использования лабораторных животных и поддержания: долговременных культур клеток эукариот.

3. Время получения индивидуальных клонов-продуцентов миниантител составляет 10 — 14 дней, по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии.

4. Относительная простота получения антител и их низкая себестоимость.

6.

Возможность создания гибридных молекул с маркерными белками за короткое время. Возможность получения антител к аутоантигенам и слабоиммуногенным соединениям.

С целью решения стоящих перед Институтом задач нам представлялось актуальным создание комбинаторной библиотеки миниантител мыши, в частности, получение на се основе scFv к интересующим нас антигенам — гранулоцитарному колониестимулирующему фактору человека (G-CSF) и природному фитогормону — транс-зеатину.

G-CSF — цитокин, стимулирующий рост гранулоцитов и активирующий нейтрофилы [Cteven, 1987]. Он представляет собой гликозилировапный полипептид с молекулярной массой 19 кДа. G-CSF применяется в онкологии для восстановления числа нейтрофилов при лейкопении, вызванной радиоили химиотерапией. Для анализа G-CSF в процессе производства и клинического применения необходимы тест-системы, причем наиболее удобными в настоящее время являются иммунохимические тест-системы на основе антител.

Траис-зсатин это один из ключевых фитогормонов, ответственных за рост и развитие растений. Несмотря на большой объем данных о роли транс-зсатина в регуляции деления и дифференцировки клеток, механизм действия этого вещества до сих пор недостаточно изучен. Использование антител, направленных против транс-зеатина, может позволить прояснить молекулярные аспекты его функционирования.

Таким образом, в задачи данного исследования входило: 1-. Создание представительной библиотеки фагового дисплея мышиных миниантител. 2. Проверка качества полученной библиотеки на примере получения фагмидпых клонов, .экспрессирующих мшшантитела к белковому антигену — G-CSF и гаптену — транс-• зеатину.

3. Получение, выделение и характеристика миниантител к G-CSF.

4. Создание на основе полученных миниантител тест-системы для количественного определения G-CSF.

5. Получение, выделение и характеристика миниантител к транс-зеатину.

ВЫВОДЫ.

1. Методом полимеразной цепной реакции получены гены вариабельных областей иммуноглобулинов мыши, и на их основе создана библиотека мышиных одноцепочечных миниантител в формате фагового дисплея представительностью 2×108 независимых рекомбинантных клонов.

2. Выделены фагмидные клоны, экспрессирующие миниантитела к гранулоцитарному колонийстимулирующему фактору человека и транс-зеатину.

3. Получена растворимая форма миниантител к названным выше антигенам. Миниантитела выделены в гомогенном виде и охарактеризованы.

4. Выявлена пара миниантител к неперекрывающимся эпитопам гранулоцитарного колонийстимулирующего фактора, и создана тест-система, позволяющая обнаруживать его в концентрации 50 пкг/мл.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Проведенное исследование показывает, что полученная библиотека scFv мыши может быть использована для получения миниантител к антигенам различной природы. Методические приемы, разработанные в ходе выполнения данной работы помогут в дальнейшем проводить эффективный поиск scFv к другим антигенам, представляющим интерес как для фундаментальной науки, так и для практического применения.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

В работе использовали ферменты фирмы «Promega» (США), кнъюгаты для иммуноферментного анализа фирмы «Bio-Rad» (США), акриламид, метилен-бис-акриламид, Трис, Твин-20, ор/яо-фенилендиамин, периодат натрия, зеатин, зеатин-рибозид фирмы «Sigma» (США), остальные реактивы — отечественного производства, квалификации ч.д.а. и о.с.ч. G-CSF был любезно предоставлен В. Г. Коробко.

3.1. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ И ПРАЙМЕРЫ.

Для амплификации и клонирования ДНК фрагментов генов вариабельных областей иммуноглобулинов мыши использовали следующие праймеры: CH1FORэквимолярная смесь: CTCAATTTTCTTGTCCACCTTGTTGC CTCGATTCTCTTGATCAACTCAGTCT TGGAATGGGCACATGCAGATCTCT CkFOR: CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC. VH1BACK: AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG Vk2BACK: GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA Vk4FOR — эквимолярная смесь: CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC CCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC.

VH1FOR-2: TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC.

VH1BACKSFI: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGAGGTSM-ARCTGCAGSAGTCWGG.

Vk4F0RN0T — эквимолярная смесь:

GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC.

GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC.

GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC.

GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC.

JH-link:

GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTTGGGCGGTGGTGGGTCG FRK-link:

TGGAGACTGGGTGAGCTCAATGTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCC.

Для создания адаптера, кодирующего антигенную детерминанту IL2 для МА LNKB2 использовали следующие праймеры:

IL-sense:GGCCGCACTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTACA IL-anti-sense:

GGCCTGTAAATTTAGCACTTCCTCCAGAGGTTTGAGTTCTTCTTCTAGTGC.

Все праймеры были синтезированы в ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН Н. С. Быстровым.

3.2. ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК.

У мышей линии BALB/C в возрасте 2 месяцев и весом 20 г извлекали селезенку и измельчали ее в гомогенизаторе со стеклянным пестиком в буфере следующего состава: 50 мМ NaH2P04/Na2HP04, 150 мМ NaCl, рН 7,6 (ФСБ). Взвесь клеток (107 клеток/мл) наслаивали на раствор фикола (d= 1,077) в соотношении суспензия клеток: фикол = 3: 1 и центрифугировали в течение 15 минут 1500 х g при комнатной температуре. Интерфазу, содержащую мононуклеарные клетки, отбирали и промывали 2 раза ФСБ [S.V. Hunt, 1987]. Для выделения РНК (ДНК) использовали лимфоциты, выделенные из селезенок трех мышей.

3.3. ВЫДЕЛЕНИЕ РНК.

Лимфоциты лизировали в 1 мл раствора, содержащего 4 М гуанидинроданид, 2% саркозил, 0,2 М 2-меркаптоэтанол. Лизат прогревали при 60 °C в течение 10 мин, затем добавляли равный объем фенола, рН 4,0, ХА объема 1 М СНзСООЫа, рН 4,0, Vi объема хлороформа и энергично встряхивали. Смесь охлаждали до 4 °C, затем центрифугировали при 3000 х g в течение 10 мин. Водную фазу отбирали и экстрагировали смесью фенол-хлороформ (1:1) до исчезновения интерфазы. К водной фазе добавляли 3 объема этанола и смесь выдерживали при температуре -20°С в течение 2 ч. РНК осаждали центрифугированием при 10 000 х g в течение 30 мин. Осадок промывали 70% этанолом и после центрифугирования растворяли в 100 мкл воды, не содержащей РНКаз. К раствору РНК добавляли LiCl до концентрации ЗМ. Высокомолекулярную РНК осаждали в течение ночи при 0 °C. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в 100 мкл 0,3 М ацетата натрия, рН 5,0 и разделяли на 5 равных частей. В каждую пробирку добавляли 2,5 объема этанола. Препараты РНК хранили под спиртом при -20°С вплоть до последующего использования. Для оценки качества и количества выделенной РНК использовали одну порцию препарата. РНК осаждали центрифугированием, растворяли в 100 мкл воды, для электрофореза использовали 2, 5,10 и 20 мкл полученного препарата.

3.4. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК.

Клетки селезенки суспендировали в ФСБ, охлажденном во льду, в концентрации 108 кл./мл, добавляли 10 объемов раствора, содержащего 0,5 М ЭДТА, рН 8,0, 100 мкг/мл протеиназы-К и 0,5% саркозила. Суспензию лизированных клеток помещали в водяную баню с температурой 50 °C на 3 ч, периодически перемешивая. Аккуратно, без резких встряхиваний, ДНК трижды экстрагировали равным объемом фенола. После третьей экстракции ДНК диализовали против 4 л раствора 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, несколько раз меняя буфер до тех пор, пока оптическое поглощение диализата при длине волны 270 нм не стало менее 0,05. К препарату ДНК добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М и 0,6 объема изопропанола. Высокомолекулярную ДНК собирали, наматывая ее на стеклянную палочку, промывали 70% этанолом, подсушивали на воздухе, затем в течение ночи растворяли в буфере ТЕ (ЮмМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) при 4 °C [9]. Количество выделенной ДНК определяли спектрофотометрически по величине оптического поглощения при длине волны 260 нм.

3.5. СИНТЕЗ кДНК.

Для синтеза первой цепи кДНК тяжелой цепи Ig использовали праймер CH1FOR, для синтеза первой цепи кДНК легкой цепи использовали олигонуклеотид CkFOR. Двадцать мкгРНК (одну аликвоту) растворяли в 68 мкл 1 мМ раствора ванадил-рибонуклеозидных комплексов, добавляли 5 мкл 5 мМ смеси dNTP, 5мкл 0,1 М ДТТ, 20пкмоль CH1FOR, 20пкмоль CkFOR, 10 мкл 10х буфера для ревертазы (Amersham, Англия). Смесь прогревали 5 мин при 67 °C, затем медленно охлаждали до комнатной температуры, добавляли 4 мкл RNasin (Amersham, Англия) до 0,5 ед./мкл и 4 мкл обратной транскриптазы AMV-RT (20 ед./мкл, Amersham, Англия). Смесь инкубировали 1 ч при 42 °C.

3.6. АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК ГЕНОВ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ.

Для амплификации вариабельных областей тяжелых цепей Ig использовали пары праймеров VH1FOR-2 и VH1BACK, а для амплификации легких цепей (к) — праймеры Vk4FOR и Vk2BACK. Для амплификации тяжелых цепей брали 30 мкл (1/3 об.) смеси, полученной после синтеза первой цепи кДНК, для легких цепей — 10 мкл (1/10 об.) смеси. В случае использования в качестве исходной матрицы геномной ДНК для постановки одной реакции брали по 300 нг выделенной геномной ДНК. Амплификацию проводили в реакционной смеси следующего состава: первая цепь кДНК (или ДНК), праймеры (10 мкМ для тяжелой цепи и 30 мкМ для легкой цепи), 0,25 мМ dNTP, 50 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 50 мМ Трис-HCl, рН 9,0, 0,02% Твин-20, 5 ед. Taq-полимеразы в объеме 100 мкл. Для уменьшения неспецифической амплификации проводили 5 циклов амплификации в режиме: денатурация — 94 °C, 1 мин., отжиг — 1мин., элонгация — 74 °C, 2 мин. Стадия отжига проводилась при следующих значениях температуры: ti=65°C, t2=64°C, t3=63°C, t4=62°C, t5=61°C. Далее проводили 30 циклов амплификации при температуре отжига 60 °C и тех же временных параметрах. Продукты амплификации анализировали электрофоретически в 2% агарозном геле.

3.7. ПОЛУЧЕНИЕ ЛИНКЕРА.

Линкер для соединения фрагментов тяжелых и легких цепей получали путем отжига и достройки с использованием фрагмента Кленова двух олигонуклеотидов JH-link и FRx-link. Для отжига брали по 500 пкмоль олигонуклеотидов JH-link и FRK-link, 10 мМ Трис-HCl рН 8,0, 5 мМ MgCh, 50 мМ NaCl и 50 мМ dNTP в общем объеме 50 мкл. Смесь нагревали до 90 °C, инкубировали 5 мин, затем медленно в течение 0,5 ч температуру понижали до 50 °C, инкубировали 20 мин, после чего немедленно охлаждали, поместив пробирку в лед. К смеси добавляли 10 ед. фрагмента Кленова и инкубировали 20 мин при 37 °C. По окончании реакции в пробирку добавляли ЭДТА до конечной концентрации 0,5 мМ. Для удаления фрагмента Кленова смесь экстрагировали равным объемом фенола. Затем добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М и равный объем изопропанола. ДНК осаждали центрифугированием при 30 000 х g и температуре 4 °C. ДНК линкера очищали электрофорезом в ПААГ в неденатурирующих условиях. Разделение проводили в 10% ПААГ (29:1) в трис-боратном буфере (0,089 М трис-борат, 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА, рН=8,0). После окончания разделения гель помещали в раствор, содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия в таком же буфере. После 45 мин окрашивания пятно, соответствующее ДНК линкера, визуализировали в УФ-свете и вырезали соответствующий участок геля. Кусочек геля, содержащий ДНК, гомогенизировали в пробирке, добавляли равный объем элюирующего буфера (0,5 М ацетат аммония, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и инкубировали в течение ночи при 37 °C. Пробу центрифугировали при 10 000 х g в течение 20 мин при комнатной температуре, отбирали надосадочную жидкость, осадок еще раз экстрагировали равным объемом того же буфера. Два супернатанта объединяли и фильтровали через ватман-ЗММ. ДНК осаждали центрифугированием после добавления 2-х объемов этанола. Осадок растворяли в 400 мкл ТЕ, количество ДНК определяли по величине оптического поглощения при длине волны 260 нм [Маниатис Т. И др., 1984].

3.8. СБОРКА И АМПЛИФИКАЦИЯ ОБЪЕДИНЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ТЯЖЕЛЫХ.

И ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ IG.

Для сборки тяжелых и легких цепей Ig проводили ПЦР амплификацию в реакционной смеси, содержащей буфер для Taq полимеразы, 2,5 мМ MgCh, 30 мкМ праймеры VH1BACK и Vk4FOR, 20 нг линкера, по 100 нг амплифицированных легких и тяжелых цепей, 250 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и одну единицу Taq ДНК-полимеразы. Двадцать пять циклов амплификации проводили в следующем режиме: 94 °C — 1,5 мин, 72 °C — 2,5 мин. Продукты амплификации анализировали после электрофоретического разделения в 2% агарозном геле. Фрагмент размером 800−900 пар оснований выделяли с помощью электроэлюции. Для внесения сайтов рестрикции Sfil и Noil проводили 15 циклов ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы фрагментов ДНК, полученных на предыдущем этапе, и праймеров VH1BACKSFI и VK4FORNOT. Циклы амплификации проводили в следующем режиме: 94 °C — 1 мин, 50 °C — 1 мин, 74 °C — 1,5 мин. Амплифицированный фрагмент выделяли после электрофоретического разделения продуктов реакции в 2% агарозном геле.

3.9. КЛОНИРОВАНИЕ scFv.

Клонирование scFv осуществляли в клетках Е. coli штамма TG1 в составе плазмиды pHENl. Для этого проводили рестрикцию ДНК собранных scFv и ДНК pHENl по сайту Sfil в реакционной смеси, содержащей в 50 мкл ДНК (5 мкг pHENl или 1 мкг scFv), буфер для Sfil (10 мМ Трис-HCl, рН 7,9, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT), 0,1 мг/мл БСА и 20ед Sfil. Реакционные смеси инкубировали 4 ч при 56 °C, затем добавляли 39 мкл воды, 5мкл 1 М NaCl, 5мкл 10х буфера для Noll (100 мМ трис-HCl, рН 7,9, 1,5 М NaCl, 100 мМ MgCl2, 1% Triton Х-100) и 20ед Notl. После инкубации в течение 4 ч при 37 °C ДНК pHEN подвергали дефосфорилированию при помощи Shrimp Alkaline Phosphatase (USB) согласно инструкции фирмы производителя. После выполнения этих процедур гидролизованные фрагменты ДНК scFv и pHENl очищали электрофоретически в 1% агарозном геле.

Для одной реакции лигирования scFv с вектором pHENl использовали 200нг гидролизованного фрагмента scFv и 1мкг вектора pHENl, буфер для Т4 -ДНК лигазы, 1 мМ АТФ, 100 мкг/мл БСА и 20 ед (Weiss) Т4 -ДНК лигазы. Лигирование осуществляли в течение двух часов при комнатной температуре в объеме 50 мкл. После фенольной депротеинизации лигазной смеси ДНК осаждали этанолом и хранили под спиртом при -20°С до момента использования в электротрансформации клеток E.coli.

Для приготовления компетентных клеток культуру клеток E. coli штамма TG1 выращивали в среде 2xYT при 37 °C и интенсивной аэрации до концентрации, соответствующей Абоо=0,5. Культуру охлаждали во льду 30 мин, затем клетки осаждали центрифугированием при 4 °C в течение 15 мин при 3000 х g. Осадок суспендировали в охлажденном 10% глицерине, приготовленном на воде milliQ, в объеме, равном исходному объему культуральной жидкости. Процедуру повторяли два раза, после чего клетки суспендировали в 10% глицерине, в объеме равном 1/1000 объема исходной культуральной жидкости. Суспензию клеток разливали в пробирки по 50мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

Электропорацию проводили в 0,2-см кюветах с использованием 50 мкл компетентных клеток и 50−100 нг ДНК, полученной после переосаждения лигазной смеси. Немедленно после электрического импульса (2500В) в кювету добавляли 1мл среды 2xYT, содержащей 1% глюкозы и ЮмМ MgCh, клетки аккуратно суспендировали, переносили в стерильные пробирки и инкубировали в течение одного часа при 37 °C.

3.10. АМПЛИФИКАЦИЯ БИБЛИОТЕКИ scFv.

После электропорации клетками иннокулировали 200 мл среды 2xYT с 1% глюкозой и 100 мкг/мл ампициллина, отбирали аликвоту для определения титра трансформантов, а оставшуюся часть инкубировали в течение ночи при 37 °C. На следующий день отбирали аликвоту ночной культуры (2 мл) и иннокулировали ею 200 мл указанной выше среды. Клетки растили до Абоо^ОД после чего 5 мл культуры переносили в колбу с 20 мл той же среды, добавляли 0,5 — 1−10пк.о.е. М13 К07 и инкубировали в течение 1,5 ч при 37 °C. Клетки осаждали при 4000 х g в течение 10 мин, суспендировали в 10 мл среды 2xYT и добавляли к 300 мл среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Инкубацию проводили при интенсивной аэрации в течение ночи при 37 °C.

Для выделения фагмидных частиц культуру клеток E. coli, содержащую рекомбинантную pHENl и фаг М13 К07, выращенную в течение ночи, центрифугировали 10 мин при 8000 х g. К супернатанту добавляли 1/5 объема ПЭГ/NaCl (20% ПЭГ 6000, 2,5 М NaCl) и инкубировали 1 ч при 4 °C. После центрифугирования образовавшийся осадок суспендировали в 1/10 объема буфера ТЕ и еще раз осаждали ПЭГ/NaCl в аналогичных условиях. Осадок ресуспендировали в 1/100 объема буфера ТЕ, отделяли нерастворимые агрегаты центрифугированием и определяли титр фагмидных частиц после трансдукции и рассева на агаризованную среду с ампициллином.

3.11. БИОТИНИЛИРОВАНИЕ G-CSF.

К раствору рекомбинантного человеческого G-CSF (0,3 мг/мл) в 0,1 М Na-карбонат/бикарбонатном буфере, рН 9,5, добавляли 70 мМ N-оксисукцинимидный эфир биотина в диметилформамиде в молярном соотношении белок: эфир биотина «1:3 и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 1 М NH4CI (20 мкл NH4CI на 1 мг белка). Реакционную смесь диализовали против 1000 объемов ФСБ.

3.12. СЕЛЕКЦИЯ G-CSF-СПЕЦИФИЧНЫХ КЛОНОВ.

Для поиска клонов, специфичных к нативному G-CSF, вначале в лунки 96-луночного планшета для ИФА вносили по 100 мкл раствора стрептавидина в 0,1 М Na-карбонат/бикарбонатном буфере, рН 9,5, (10 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 4 °C, затем в лунки вносили по 100 мкл смеси, содержащей 1% БСА и 5% лошадиной сыворотки в ФСБ и инкубировали еще 2 ч при 4 °C. Между стадиями планшет промывали 5 раз ФСБ, затем 5 раз ФСБ с 0,1%Твин -20. 1012 к.о.е. фагмидной библиотеки в объеме 100 мкл инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с биотинилированным G-CSF (био-G-CSF) в концентрации 2 мкг/мл для первого раунда, 200 нг/мл, 100 нг/мл и 10 нг/мл для второго, третьего и четвертого, соответственно. Смесь, содержащую прединкубированные с био-G-CSF scFv-фагмидные частицы, вносили в лунки планшета с иммобилизованным стрептавидином и оставляли при комнатной температуре на 1 ч при умеренном перемешивании на орбитальном шейкере. С целью удаления неспецифически сорбировавшихся фагмидных частиц после инкубации планшет промывали как описано выше. Для диссоциации комплекса стрептавидин / био-G-CSF / scFv в лунки добавляли по.

100 мкл 0,2 М глицин-HCl буфера, рН 2,0, инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, после чего содержимое лунок переносили в пробирку и немедленно нейтрализовали добавлением 1/12 объема 1 М Триса. К полученному элюату добавляли 400 мкл суспензии клеток E. coli TGI, находящихся в экспоненциальной фазе роста. Смесь инкубировали 1 ч при 37 °C, после чего ею иннокулировали 200 мл среды 2хУТ с 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Культуру растили в течение ночи при 37 °C и интенсивной аэрации. После этого выделяли фагмидные частицы, которые использовали для последующих циклов аффинной селекции.

Для поиска клонов, специфичных к линейным эпитопам G-CSF, антиген (G-CSF) предварительно денатурировали нагреванием в присутствии 1% SDS и ЮмМ меркаптоэтанола, затем разбавляли в 10 раз и иммобилизовывали на нитроцеллюлозном диске. Места неспецифической сорбции блокировали 1% БСА. Инкубацию с библиотекой scFv и все дальнейшие процедуры проводили так же, как для нативного GCSF.

3.13. ПЕРВИЧНЫЙ АНАЛИЗ СЕЛЕКТИРОВАННОЙ БИБЛИОТЕКИ МЕТОДОМ.

ИММУНОСКРИНИНГА НА ЧАШКАХ.

Вариант 1: Клетки E. coli, инфицированные фагмидными частицами, выделенными после четвертого раунда иммуноселекции, высевали на чашки Петри с агаризованной средой 2xYT, содержащей 100мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, и инкубировали в течение ночи при 30 °C. После подсчета числа выросших колоний с чашек снимали реплики на нитроцеллюлозные фильтры. Фильтры перекладывали на поверхность среды 2xYT, содержащей 1 мМ IPTG, и инкубировали 2 ч при 30 °C. Фильтры-реплики отмывали от клеток E. coli 5 раз буфером ТСБ-Т (20мМ Трис-НС1 рН=7,5, 150 мМ NaCl, 0,1%Твин-20), затем помещали на 30 мин в раствор, содержащий 1% БСА и 5% лошадиной сыворотки в буфере ТСБ-Т. После этого фильтры инкубировали 15 мин при комнатной температуре в ТСБ-Т с биотинилированным антигеном (20 нг/мл).

После пятикратной отмывки буфером ТСБ-Т по 15 мин фильтры инкубировали в ТСБ-Т со стрептавидин-фосфатазным конъюгатом (Amersham, Англия, рабочее разведение 1:3000) 30 мин при комнатной температуре. Последующие обработки велись согласно инструкции фирмы производителя. Колонии, дающие наиболее выраженный сигнал, были отобраны для дальнейшего анализа.

Вариант 2: Отличается от варианта 1 тем, что нитроцеллюлозные фильтры, прежде чем накладывать на чашки с колониями Е. coli сенсибилизировали MA 9Е10, реагирующими с тус-последовательностыо, расположенной в С-концевой области scFv, и блокировали свободные участки инертным белком (БСА или желатином). Детекцию в этом случае осуществляли при помощи биотинилированного антигена и стрептавидин-фосфатазного конъюгата, как и в первом варианте.

3.14. КЛОНИРОВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ АНТИГЕННУЮ ДЕТЕРМИНАНТУ IL2 ДЛЯ АНТИТЕЛ ЛНКБ-2.

Адаптор IL2 получали в результате гибридизации праймеров IL-sense и IL-anti-sense при температуре 55 °C в течение 10 мин. Фагмиды, отобранные после первичного анализа, были гидролизованы с помощью Notl и лигированы с адаптером IL2. Полученной ДНК трансформировали клетки E. coli BL21 и отбирали по 10 клонов для дальнейшего анализа. Каждой из 10 колоний иннокулировали 1 мл среды 2xYT и растили при 30 °C в присутствии 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ IPTG в течение 16 ч. Клетки осаждали центрифугированием, а супернатант использовали для ИФА с антителами ЛНКБ-2.

3.15. СИНТЕЗ КОНЪЮГАТА БИОТИНА С ТРАНС-ЗЕАТИНОМ.

Зеатинрибозид окисляли периодатом натриядля этого навеску транс-зеатинрибозида (0,8 г) растворяли в 200мкл 0,1 М водного раствора NaI04 и через 2 ч добавляли 15 мкл этиленгликоля. К раствору окисленного зеатинрибозида добавляли 15 мкл 1 М раствора карбоната натрия (рН 9.0) и 2.4 мг биотингидразида (3 эквивалента по отношению к исходному зеатинрибозиду). Реакционную смесь оставляли на 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляли 300 мкл 0,4 М раствора NaBH4 для восстановления продукта конденсации биотингидразида и зеатинрибозида. Восстановление вели в течение 4 ч при комнатной температуре, после чего добавляли 60 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 5,0), а еще через 10 минут рН реакционной смеси доводили до 7,0 добавлением 1 М раствора аммиака. После этого реакционную смесь упаривали в роторном испарителе до маслообразного состояния и анализировали с помощью ТСХ на пластинках Kieselgel 60 F254 в системе метанол-.хлороформ (20:80). Оптимальное соотношение растворителей подбирали опытным путем. Конечный продукт конденсации и восстановления имел Rf = 0,43 в системе метанол: хлороформ (20:80). Продукт конденсации (биотин-зеатинрибозид) выделяли после разделения компонентов реакционной смеси препаративной ТСХ в системе метанол: хлороформ (20:80) путем соскабливания носителя в зоне, соответствующей Rf = 0,43 и многократной экстракции смесью метанол-хлороформ (1:1), а затем этанолом. Все фракции объединяли и высушивали. Для дальнейшего использования готовили маточный раствор в 50% этаноле с концентрацией 10 мг/мл.

3.16. СИНТЕЗ КОНЪЮГАТОВ ЗЕАТИНРИБОЗИДА С BSA, ОВАЛЬБУМИНОМ И.

АМИНОГЕКСИЛСЕФАРОЗОЙ.

Окисление зеатинрибозида периодатом натрия проводили так же, как и в предыдущей методике. 1,7 мкмоль БСА (115 мг) или овальбумина (60 мг) растворяли в 5 мл НгО, рН раствора доводили до 9,0 добавлением 5% раствора К2СО3 (120ц1). К полученному раствору белка добавляли 5 мл 3 мМ раствора окисленного зеатинрибозида и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляли боргидрид натрия.

100 мкл 0,4 М раствора) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Полученный конъюгат диализовали против ФСБ, затем к нему добавляли глицерин до конечной концентрации 20% и хранили при -20°С. Для получения конъюгата зеатинрибозида с аминогексилсефарозой 5 г аминогексилсефарозоы (Pharmacia) суспендировали в 5 мл НгО, далее синтез конъюгата проводили так же, как описано выше.

3.17. СЕЛЕКЦИЯ КЛОНОВ СПЕЦИФИЧНЫХ К ТРАНС-ЗЕАТИНУ.

Селекцию осуществляли так же, как для поиска миниантител к G-CSF. В качестве антигена на разных этапах селекции использовали конъюгаты зеатинрибозида с БСА, овальбумином или сефарозой. Инкубацию библиотеки scFv с антигеном в форме конъюгатов с различными носителями всегда проводили в присутствии БСА (1 мг/мл) и овальбумина (1 мг/мл). В качестве антигена для тестирования клонов использовали зеатин-рибозид-овальбумин.

3.18. ВЫДЕЛЕНИЕ СЕКРЕТИРУЕМЫХ МИНИАНТИТЕЛ МЕТОДОМ ИММУНОАФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

Для выделения антител, секретируемых клетками в культуральную среду, отобранными фагмидными частицами инфицировали штамм E. coli BL21, который не несет мутации supE. Трансформированные клетки выращивали в 100 мл среды 2xYT в течение ночи при 30 °C в присутствии 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ IPTG, осаждали центрифугированием, а супернатанты концентрировали в 10 раз при помощи концентрирующей ячейки Amicon с использованием мембраны YM 10. Дальнейшую очистку проводили путем иммуноаффинной хроматографии на Sepharose 4B-CL с иммобилизованными антителами 9Е10 либо ЛНКБ2. Иммуноаффинный сорбент готовили по стандартной методике, включающей стадию активации сефарозы BrCN [Дин, 1988]. Емкость синтезированного аффинного сорбента была 2 мг Ig (9Е10 или ЛНКБ-2)/мл.

Сконцентрированный культуральный супернатант пропускали через колонку, содержащую 2 мл аффинного сорбента. Для удаления неспецифически сорбировавшихся белков колонку промывали 1 М NaCl. Элюцию миниантител с аффинной колонки осуществляли 8 М мочевиной.

3.19. ВЫДЕЛЕНИЕ СЕКРЕТИРУЕМЫХ МИНИАНТИТЕЛ МЕТОДОМ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

Альтернативный способ выделения миниантител включал ионообменную хроматографию на колонке MonoQ с использованием FPLC. При этом сконцентрированный культуральный супернатант предварительно диализовали против буфера, А (20 мМ натрий-фосфатный буфер или 20 мМ MOPS, рН 6,5). Элюцию миниантител с колонки осуществляли градиентом концентрации NaCl от 0 до 1 М. Степень очистки миниантител оценивали по результатам электрофореза и Western-blot-анализа, которые проводили с использованием MA 9Е10 по общепринятой методике [Beisiegel, 1986].

3.20. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ АФФИННОСТИ МИНИАНТИТЕЛ.

Константы аффинности определяли по методу, предложенному Beatty [Beatty, 1987] с использованием непрямого ИФА. Иммуноферментный анализ проводили по следующей схеме. Периплазменный экстракт, содержащий секретируемые миниантитела, вносили в лунки иммунопланшета по 100 мкл в концентрациях 10 мкг/мл суммарного белка, 5 мкг/мл и 2,5 мкг/мл, при этом по данным электрофоретического анализа содержание миниантител в экстракте составляло примерно 20% от общего количества белка. Планшеты инкубировали в течение ночи при 4 °C. Затем, для блокирования свободных участков связывания, в лунки вносили 1% раствор БСА, приготовленный на ФСБ, и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После этого в лунки вносили в двоичных разведениях биотинилированный антиген. Между стадиями лунки отмывали пять раз ФСБ-Т. Количественную оценку связавшегося антигена проводили после взаимодействия со стрептавидин-пероксидазным конъюгатом по данным фотометрического анализа образования окрашенного продукта окисления OPD. Для вычисления констант аффинности строили графики титрования, где по оси абсцисс откладывали значения -^гСразведения биотинилированного антигена), а по оси ординат величину оптической плотности при Х=492нм. Расчет проводили по формуле: Ка=1/(2[Лг']-[Лг]), где [Аг] - концентрация антигена, соответствующая точке перегиба на кривой титрования при концентрации антител Со, [Аг'] - концентрация антигена, соответствующая точке перегиба на кривой титрования при концентрации антител Со/2.