Совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных

Актуальность темы

Бешенство остается одной из важнейших проблем ветеринарии и здравоохранения во многих странах мира. Несмотря на проводимые противоэпизоотические мероприятия в Российской Федерации, ограничить распространение бешенства не удается (C.B. Грибенча, 1993; H.A. Хисматуллина и др., 2000; В. М. Авилов и др., 2002; В. В. Макаров, A.A. Воробьев, 2004; А. Е. Метлин, 2008; В. А. Ведерников, И. В. Балдина, 2010; A.M. Гулюкин, 2011).

Противоэпизоотические мероприятия при бешенстве включают диагностику болезни и профилактическую иммунизацию домашних, диких плотоядных и сельскохозяйственных животных с последующим контролем эффективности вакцинации.

Методы диагностики бешенства, рекомендуемые Комитетом экспертов ВОЗ, требуют специального оборудования и предназначены, в основном, для постмортальных исследований (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2011).

Показана возможность индикации антигена вируса бешенства в слюне животных методом иммунохроматографии (B.K. Kang, et al., 2007), в эпителиальных клетках роговицы глаза (корнеальный тест) и биоптатах кожи методом иммунофлюоресценции (H.A. Ковалев, 1965; L.G. Schneider, 1969; H.A. Ковалев, A.C. Шашенько, 1970; J. Zimmerman 1971; J. Bingham, P. Mlambo, 1995; Н. П. Мишаева и др., 2008), а также вирусного генома в слюне и спинномозговой жидкости методом ПЦР (P. Crepin, et al., 1998; Я. С. Цыбанов, 2001).

Достижения биотехнологии на современном этапе позволяют совершенствовать методы иммуноанализа на основе реагентов, визуализирующих результат реакции. В связи с этим, представляет научный и практический интерес разработка тест-систем на основе точечного анализа на нитроцеллюлозной мембране с применением конъюгата специфических антител с пероксидазой (dot-ELISA) или с коллоидным золотом для.

Введение

выявления антигена вируса бешенства в слюне животных, что необходимо для оценки риска заражения человека или животных.

Объективным методом оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства является определение в сыворотке крови уровня вируснейтрализующих антител (Э.Я. Сазанова и др., 1991; C.B. Кузнецова, 1991; J.S. Smith, 1996; F. Cliquet, et al., 1998; H.A. Хисматуллина и др., 2000; К. Н. Груздев, В. В. Недосеков, 2001).

В 2007 году Комитет экспертов ВОЗ рекомендовал непрямой вариант иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения поствакцинальных антирабических антител в сыворотке крови собак и кошек (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines, 2011).

В связи с вышеизложенным, исследования в области совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных являются актуальными и имеют научное и практическое значение. Цель и задачи исследований.

Основной целью данной работы являлось совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

— получить рибонуклеопротеин вируса бешенства и специфические к нему антитела, синтезировать на их основе конъюгаты с пероксидазой и коллоидным золотом;

— разработать тест-системы на основе dot-ELISA и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для выявления антигена вируса бешенства в слюне животных;

— получить препарат альбумина, меченного родамином, и отработать условия выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток методом контрастной иммунофлюоресценции;

— усовершенствовать тест-систему на основе непрямого ИФА для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных.

Научная новизна исследований.

Показана принципиальная возможность выявления антигена вируса в слюне методами ёо^ЕЫБА и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера и в эпителиальных клетках роговицы глаза животных методом контрастной иммунофлюоресценции.

Разработаны тест-системы на основе скЛ-ЕЫЗА и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне.

Показано, что применение альбумин-родаминового конъюгата повышает эффективность метода иммунофлюоресценции при выявлении антигена вируса бешенства.

Усовершенствована тест-система на основе непрямого ИФА для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных.

Практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

— тест-системы на основе ёо1-ЕЫ8А и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне;

— набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА;

— метод контрастной иммунофлюоресценции для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток.

Результаты исследований представляют практическую ценность для оптимизации противоэпизоотических мероприятий по борьбе с бешенством.

Основные положения, выносимые на защиту.

— Индикация антигена вируса бешенства в слюне животных методами с! о1> ЕЫБА и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера.

— Выявление антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток методом контрастной иммунофлюоресценции.

— Определение уровня специфических антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против бешенства, методом непрямого ИФА.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

4 Выводы непрямого ИФА при исследовании проб сыворотки плотоядных относительно реакции нейтрализации составила 75%, специфичность -83,3%, проб сыворотки КРС — 77,8% и 85,7%, соответственно. 6. Показана эффективность непрямого ИФА в качестве скринирующего метода при серомониторинге антирабической вакцинации. Результаты исследований сывороток крови свидетельствуют о достаточном уровне протективного иммунитета у 93,3% КРС, 96,15% домашних плотоядных и 33,3% лисиц.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

На основании проведенных исследований предлагаются для практики:

— «Методические положения по количественному определению антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа», утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины, академиком Россельхозакадемии A.M. Смирновым 8 августа 2011 г.

— «Методические положения по выявлению антигена вируса бешенства методом контрастной иммунофлюоресценции», утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины, академиком Россельхозакадемии A.M. Смирновым 8 августа 2011 г.

— Тест-система на основе dot-ELISA для индикации антигена вируса бешенства в слюне.

— Тест-система на основе точечного анализа с применением иМмунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне.

— Набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого иммуноферментного анализа.

— НТД на «Набор реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа" — утверждена директором ВНИТИБП 5.04.2011.

— Временная инструкция по применению «Набора реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа», утверждена директором ВНИТИБП 5.04.2011.

Заключение

.

Анализ литературных данных показал, что на сегодняшний день бешенство и его возбудитель изучены достаточно хорошо. Детально описаны морфология и физико-химические свойства вируса, его геном, иммуногенные свойства, эпизоотология, патогенез, клинические признаки болезни, разработаны средства специфической профилактики, методы диагностики и оценки эффективности вакцинации. Данные по эпизоотической ситуации в РФ показали, что несмотря на проводимые противоэпизоотические мероприятия, ограничить распространение бешенствадо конца не удается, и оно остается одной из важнейших проблем здравоохранения и ветеринарии.

Своевременная диагностика бешенства обеспечивает эффективность проведения лечебно-профилактических мероприятий, однако рекомендуемые Комитетом экспертов ВОЗ методы предназначены, в основном, для постмортальной диагностики бешенства. При этом некоторыми авторами показана эффективность прижизненного обнаружения вирусных агентов в слюне, эпителиальных клетках роговицы глаза, спинномозговой жидкости, биоптатах кожи животных, но в практику методы интравитальной диагностики бешенства не внедрены.

Основным методом профилактики бешенства является вакцинация восприимчивых животных. Показателем успешной вакцинации считается наличие в сыворотке крови достаточного уровня специфических вирунейтрализующих антител (не менее 0,5 МЕ/мл), одним из методов выявления которых является непрямой вариант ИФА с использованием в качестве антигена гликопротеина вируса бешенства. В настоящее время соответствующие тест-системы производятся за рубежом, в РФ коммерческие наборы, предназначенные для оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства, не выпускаются.

Анализ литературных данных определил цель и основные направления наших исследований.

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы и методы.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Вирус бешенства. В работе использовали фиксированный вирус бешенства, штамм «Овечий», стандартный штамм «CVS», штамм «Щелково-51». Вирус бешенства инактивировали 0,025% раствором ß—пропиолактона.

Тест-система на основе dot-ELISA для индикации антигена вируса бешенства в слюне. Для оптимизации условий проведения dot-ELISA использовали пробы слюны от собак, в которые вносили суспензию очищенного мозгового вируса бешенства, штамм «CVS», с инфекционностью 3,8 lg LD50/0,03 мл [16].

Для сорбции на нитроцеллюлозной мембране и приготовления конъюгата с пероксидазой хрена получали антитела к рибонуклеопротеину (РНП) вируса бешенства, штамм «CVS». РНП выделяли из суспензии частично очищенного и концентрированного мозгового вируса, обработанной тритоном Х-100 [151], с последующим центрифугированием в градиенте сахарозы.

Сыворотку к рибонуклеопротеину вируса бешенства получали иммунизацией морских свинок препаратом РНП, активность сыворотки устанавливали в реакциях связывания комплемента по Е. Kuweit (1960) [172] и диффузионной преципитации с использованием «Набора компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации» (ТУ 9388−006−497 963−99).

IgG из анти-РНП сыворотки и нормальной сыворотки крови морской свинки выделяли методом аффинной хроматографии на коммерческом сорбенте Protein, А — Agarose CL-4B («Fluka»), согласно рекомендациям фирмы-изготовителя, и концентрировали методом диализа против 25% раствора декстрана Т-70 («Sigma»).

Конъюгат анти-РНП IgG с пероксидазой хрена Rz>3,0 (ООО «НИЦ Росбио») получали по В. Wilson, P. Nakane (1978) [267]. Молярное соотношение фермент/белок в конъюгате устанавливали методом.

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы и методы спектрометрии при 403 и 280 нм. Ферментативную активность конъюгата определяли по Д. Кэтти, Ч. Райкундалиа (1991) [39], специфическую i активность — методом прямого ИФА с сорбированным препаратом РНП вируса бешенства в лунках 96-луночного полистиролового планшета («Costar», США).

Dot-ELISA проводили по R. Hawkes, et al. (1982) [150] с использованием нитроцеллюлозной мембраны (Protran ВА 85, 20×20 см, размер пор 0,45 мкм), нарезанной на полоски размером 1×5 см. Для формирования тестируемой полоски сорбировали анти-РНП IgG, контрольной — IgG нормальной, сыворотки морской свинки.

Постановка dot-ELISA включала следующие этапы: нанесение проб слюны на тестируемую и контрольную полоскиинкубация полосок в растворе анти-РНП пероксидазного конъюгатавыявление связанного фермента субстратно-индикаторным раствором. О наличии антигена вируса бешенства в пробе судили по появлению окрашенного пятна на тестируемой полоске при отсутствии окраски на контрольной.

Для определения оптимальных условий выявления антигена вируса бешенства в слюне методом dot-ELISA в экспериментальных условиях изучали влияние различных факторов: сорбционная доза анти-РНП IgG и рабочее разведение специфического пероксидазного конъюгататемпературный режим и время инкубации компонентовсостав промывочного, блокирующего, лизирующего и субстратно-индикаторного растворов.

Тест-система на основе точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне. Коллоидное золото получали по G. Frens (1973) [143].

Конъюгат анти-РНП IgG с частицами коллоидного золота получали по G.T. Hermanson (1996) [152], рабочее разведение устанавливали титрованием в точечном иммуноанализе с постоянной дозой вируса.".

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы и методы.

Точечный анализ проводили по V.S. Dar, et al. (1994) [120] на нитроцеллюлозных полосках с сорбированными анти-РНП IgG и IgG нормальной сыворотки крови, реакцию проявляли с помощью коыъюгата анти-РНП IgG с коллоидным золотом. О наличии антигена вируса бешенства в пробе судили по появлению розовато-красного пятна на тестируемой полоске при отсутствии окраски на контрольной.

Чувствительность разработанных тест-систем устанавливали титрованием в слюне собак суспензии очищенного мозгового вируса бешенства с исходной инфекционностью 3,8 lg LD50/0,03 мл.

Выявление антигена вируса бешенства методом контрастной иммунофлюоресценции. Оптимальные условия приготовления конъюгата альбумина (Albumin from bovine serum, «Fluka») с родамином (Rhodamine В isothiocyanate, «Fluka») определяли путем подбора соотношения флюорохром/белок, времени конъюгирования и температурного режима. Непрореагировавший краситель удаляли методом гель-хроматографии на колонке 1,5×40, заполненной сефадексом G-50 в ЮмМ фосфатном буфере, pH 7,4−7,6. Соотношение родамин/альбумин в конъюгате устанавливали методом спектрометрии при 573 нм и 280 нм.

Рабочее разведение конъюгата альбумина с родамином устанавливали при одновременной его инкубации с глобулином флюоресцирующим (ТУ 9388−03−497 963−97) и отпечатками роговицы глаза клинически здоровых мышей и баранов, а также мазками ткани мозга мышей, павших после заражения вирусом бешенства, штамм «CVS», и баранов, павших после заражения вирусом бешенства, штамм «Овечий», при 37 °C в течение 30 минут.

Метод контрастной иммунофлюоресценции апробировали при выявлении антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, ткани мозга, в культуре клеток ВНК-21. Реакцию прямой иммунофлюоресценции и биопробу проводили по ГОСТ 26 075–84 [16].

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы и методы Набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА. В качестве антигена для непрямого варианта ИФА использовали гликопротеин вируса бешенства, который выделяли из культуральной суспензии вируса, штамм «Щелково-51», по методу В. Dietzschold, et al. (1978) [164].

В качестве референс-антирабической сыворотки использовали отраслевой стандартный образец антирабической сыворотки крупного рогатого скота (КРС), серия NCA-03, с активностью 20 ME/мл (ВНИТИБП), и сыворотку крови собаки, иммунизированной вакциной антирабической инактивированной сухой культуральной из штамма «Щелково-51» (Рабикан). Вируснейтрализующую активность сыворотки собак определяли в реакции нейтрализации (РН) на мышах согласно «Методам лабораторных исследований по бешенству» [45] в сравнении с отраслевым стандартным образцом.

В качестве контроля использовали сыворотку крови от клинически здоровых собак и КРС, отрицательно реагирующую в PH in vivo.

Конъюгат протеина A St. aureus («Sigma») с пероксидазой хрена Rz>3,0 (ООО «НИЦ Росбио») получали по В. Wilson, P. Nakane (1978) [267]. Соотношение фермент/белок в конъюгате устанавливали методом спектрометрии при 403 и 280 нм, ферментативную активность — согласно Д. Кэтти, Ч. Райкундалиа (1991) [39].

Для исследования сыворотки крови КРС использовали «Иммуноглобулины диагностические против IgG (H+L) быка, меченные пероксидазой» (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея).

Рабочее разведение конъюгатов устанавливали методом «шахматного» титрования в прямом варианте ИФА с использованием 96-луночного полистиролового планшета («Costar», США), сенсибилизированного сывороткой крови животных (собака, кошка, лисица, енотовидная собака, песец, КРС).

2 Собственные исследования. 2.1 Материалы ъе. метапы.

Методика непрямого ИФА включала следующие этапы: инкубация контрольной отрицательной, референс-антирабической и исследуемых сывороток в разведении 1:100 в лунках полистироловых планшетов (стрипов) с сорбированным гликопротеином вируса бешенстваинкубация пероксидазного конъюгатавыявление связанного фермента субстратно-индикаторным раствором.

Результаты непрямого ИФА учитывали по величине оптической плотности при длине волны 492 нм на спектрофотометре фирмы «Sigma». Уровень специфических антител в исследуемых пробах устанавливали по ОП492 в исследуемых пробах в сравнении с ОП492 референс-антирабической сыворотки.

С использованием предложенного набора реагентов исследовали 250 проб сыворотки крови домашних, диких плотоядных и сельскохозяйственных животных.

Содержание общего белка определяли О.Н. Lowry, et al. (1951) [210].

Статистическая обработка результатов. При анализе и статистической обработке результатов использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office, 2007». Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами по Г. Ф. Лакин (1990) [40].

2 Собственные исследования. 2.2 Результаты исследований.