Изучение особенностей формирования и распространения устойчивости пневмококков к ß—лактамным антибактериальным препаратам в России является актуальной проблемой. S. pneumoniae — возбудитель внебольничной пневмонии, обострений хронического бронхита, отита и синусита, является одним из клинически наиболее значимых микроорганизмов, развитие резистентности среди которых связано с наибольшими социальными и медицинскими последствиями. Формирование микроорганизмами устойчивости к антибактериальным препаратам является основной причиной снижения эффективности этиотропной терапии инфекционных болезней, удлинения сроков госпитализации пациентов и увеличения летальности.
Исторически, пенициллин считался наиболее активным антипневмококковым антибиотиком. Однако бесконтрольное и неоправданное использование антибиотиков при бактериальных инфекциях привело к появлению штаммов, устойчивых к ß—лактамным антибиотикам [118].
Устойчивость пневмококков к ß—лактамным антибиотикам опосредуется достаточно сложными и не до конца понятными механизмами. К настоящему времени в развитии резистентности однозначно установлена роль модификации генов трех пенициллинсвязывающих белков (ПСБ) — pbpA, pbp2b и рЬрХ [285, 290]. Продуктами модифицированных генов являются ПСБ со сниженной аффинностью к ß—лактамным антибиотикам, что закономерно ведет к невосприимчивости бактерий к данному классу антибактериальных препаратов. В формировании устойчивого фенотипа обсуждаются также возможная роль некоторых других механизмов, в частности, мутации в генах оперона murMN, гликозилтрансферазы СроА, гистидинпротеинкиназы CiaH, серинтреонинкиназы StkP [72, 94, 111, 276].
Закономерности распространения антибактериальной резистентности среди пневмококков во многом определяются особенностями структуры популяции этих бактерий. Согласно современным представлениям в глобальной популяции пневмококков одновременно происходят процессы формирования, распространения и эволюции отдельных генетических линий (клонов или клональных комплексов), а также горизонтальный обмен генов (вирулентности, резистентности, капсульных полисахаридов) между ними. Происходит также горизонтальный обмен генами с родственными микроорганизмами (Streptococcus mitis, Streptococcus oralis и др.) — Однако многие детали этих процессов на глобальном и локальном (Российская Федерация) уровнях остаются неизученными.
Кроме того, в настоящее время актуальна проблема достоверной видовой идентификации пневмококков. Наиболее часто сложности в идентификации встречаются при исследовании образцов из респираторного тракта. Населяющие одни и те же экологические ниши S. mitis и S. oralis настолько близки к S. pneumoniae, что их дифференциальная идентификация сильно затруднена. Ошибочная идентификация S mitis и S. oralis как S. pneumoniae может приводить к искажению данных об этиологии респираторных инфекций и распространении антибиотикорезистентности.
Таким образом, разработка и адаптация методов микробиологического и молекулярного контроля над уровнем резистентности S. pneumoniae к ß—лактамным антибактериальным препаратам и распространением устойчивых изолятов представляются актуальными задачами, решение которых подразумевает фундаментальные и медицинские аспекты исследования.
Цель исследования.
Изучить динамику распространения изолятов S. pneumoniae, устойчивых к ß—лактамным антибактериальным препаратам, и их генетическое разнообразие на территории Российской Федерации (РФ) методами бактериологии и молекулярно-генетического анализа.
Задачи исследования.
1. Определить чувствительность клинических изолятов S. pneumoniae к ß—лактамным антибиотикам и охарактеризовать динамику распространения резистентности;
2. Разработать высокопроизводительный метод выявления в генах ПСБ S. pneumoniae мутаций, приводящих к формированию резистентного к ß—лактамным антибиотикам фенотипа;
3. Оценить возможность прогнозирования устойчивости S. pneumoniae к ß—лактамным антибиотикам на основании анализа генов ПСБ (pbpA, рЪр2Ъ, pbpX);
4. Оптимизировать протокол ПЦР-типирования капсульных антигенов, пригодный для установления серотипа S. pneumoniae, применительно к микробной популяции, циркулирующей на территории РФ;
5. Охарактеризовать с помощью метода ПЦР-типирования капсульных антигенов и с помощью мультилокусного сиквенс-типирования популяцион-ную структуру S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к ß—лактамным антибиотикам.
Научная новизна.
Проведена фенотипическая, а также генетическая характеристика клинических изолятов S. pneumoniae, резистентных к ß—лактамным антибиотикам, в том числе разработан высокопроизводительный метод, основанный на реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом, позволяющий быстро и эффективно выявлять мутации, приводящие к формированию резистентного фенотипа. С помощью разработанного метода проведена оценка распространенности значимых мутаций среди клинических изолятов S. pneumoniae.
Впервые охарактеризована популяционная структура изолятов S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к пенициллину, циркулирующих на территории РФ с помощью перспективного метода мультилокусного сиквенс-типирования (Multi Locus Sequence Typing, MLST), часть изолятов охарактеризована методом ПЦР-типирования капсульных антигенов, позволяющим установить принадлежность S. pneumoniae к определенному серотипу. Установлено, что среди изолятов с повышенной устойчивостью к пенициллину 39,7% относятся к трем глобально распространенным клональным комплексам (СС81, СС271 и СС315). Данные об изолятах, выделенных, на территории РФ, внесены в международную базу данных MLST (http://spneumoniae.mlst.net).
Практическая значимость.
Полученные данные о динамике распространения изолятов S. pneumoniae, резистентных к ß—лактамным антибиотикам в различных регионах РФ могут быть использованы для оптимизации антибактериальной терапии респираторных инфекций. Так, данные полученные в ходе исследования, позволяют прогнозировать высокую эффективность бензилпенициллина, амокси-циллина и цефотаксима при респираторных пневмококковых инфекциях.
Разработанный метод выявления мутаций в генах ПСБ может быть положен в основу создания диагностических тест-систем, направленных на обнаружение устойчивости S. pneumoniae к ß—лактамным антибиотикам, в том числе непосредственно в клиническом материале больного.
Результаты исследования также имеют значение для понимания механизмов распространения, циркуляции и эволюции изолятов S. pneumoniae. Так, установлено, что устойчивость к пенициллину клинических изолятов S. pneumoniae, циркулирующих на территории РФ, связана, преимущественно, с распространением глобальных, множественно-устойчивых клональных комплексов этих бактерийтакже установлено, что большинство таких изолятов относятся к «вакцинным», что говорит о перспективности антипневмококковой вакцинации как пути сдерживания распространения антибактериальной резистентности среди этих бактерий.
Результаты диссертационной работы были систематизированы и внедрены в педагогическую практику кафедры микробиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России. В' приложении представлены копии документов, подтверждающих практическую значимость работы («Акт внедрения результатов диссертационной работы в практику кафедры микробиологии РМАПО»),.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. На территории РФ наблюдается тенденция к росту устойчивости пневмококков к ß—лактамным антибиотикам на фоне выраженных колебаний этого показателя в отдельных регионах;
2. Отобраны специфичные мутации в генах ПСБ (pbpA, pbp2b, pbpX), обнаружение которых позволяет прогнозировать устойчивость S. pneumoniae к ß—лактамным антибиотикам;
3. Популяция S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к ß—лактамным антибиотикам, циркулирующая на территории РФ, характеризуется выраженной клональностью и представлена в основном серотипами пневмококка, входящими в состав 13-валентной пневмококковой вакцины.
Апробация работы.
Результаты исследований по теме диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (США, 2006), Европейского конгресса по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Германия, 2007; Финляндия, 2009), II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (Россия, 2010), одобрены на заседаниях кафедры микробиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России в 2007 — 2010 гг.
Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры микробиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России 24 мая 2010 года.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с соискателем Боровской А.Д.
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 работы опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Выводы.
1. Частота распространения изолятов S. pneumoniae, устойчивых к ß—лактамным антибиотикам, варьирует в пределах от 3,1% до 23,8% в зависимости от региона и периода выделения изолята, что позволяет прогнозировать высокую эффективность эмпирической терапии пневмококковых инфекций дыхательных путей ß—лактамными антибиотиками;
2. Показана достоверная ассоциация высокой устойчивости клинических изолятов S. pneumoniae к пенициллину (МПК > 2 мкг/мл) с устойчивостью к макролидным антибиотикам, линкозамидам, ко-тримоксазолу и тетрациклину;
3. Обнаружение мутаций в генах ПСБ (pbpA, pbp2b, pbpX) разработанным методом минисеквенирования с последующей масс-спектрометрической детекцией продуктов амплификации позволяет прогнозировать устойчивость клинических изолятов S. pneumoniae к ß—лактамным антибиотикам;
4. Оптимизирован протокол мультипраймерной ПЦР, позволяющий установить серотип клинических изолятов S. pneumoniae, персистирующих на территории РФ, на основании вариабельности генов, кодирующих поли-сахаридную капсулу;
5. Около 72% изолятов, устойчивых к ß—лактамным антибиотикам относятся к серотипам, против которых направлена 13-валентная пневмококковая вакцина, что позволяет рассматривать вакцинацию как действенное средство сдерживания распространения резистентных изолятов;
6. Циркулирующая на территории России популяция S. pneumoniae с повышенной устойчивостью к ß—лактамным антибиотикам характеризуется выраженной клональностью- 39,7% таких изолятов относятся к трем кло-нальным комплексам (СС81, СС271 и СС315), имеющим мировое распространение.
Заключение
.
Широкое распространение резистентности к антимикробным препаратам среди пневмококков является основной причиной снижения эффективности этиотропной терапии инфекционных болезней. Изучение распространения и молекулярных механизмов резистентности S. pneumoniae к ß—лактамным антибиотикам на территории Российской Федерации, является актуальной задачей.
Полученные в настоящем исследовании данные о динамике распространения изолятов S. pneumoniae, устойчивых к ß—лактамным антибиотикам, в различных регионах России позволяют прогнозировать высокую эффективность бензилпенициллина, амоксициллина и цефотаксима при респираторных пневмококковых инфекциях и могут быть использованы для оптимизации антибактериальной терапии.
Для исследования резистентных изолятов в клинической практике используются традиционные микробиологические методы, зачастую высокозатратные и мало информативные. В связи с этим задачи, связанные с разработкой и адаптацией новых эффективных молекулярно-генетических средств характеристики и типирования пневмококков, выглядят актуальными и своевременными.
В настоящей работе представлен разработанный метод минисеквени-рования, позволяющий быстро и эффективно выявлять мутации в ПСБ, приводящие к формированию резистентного фенотипа, и прогнозировать устойчивость клинических изолятов S. pneumoniae к ß—лактамным антибиотикам.
В ходе исследования была показана выраженная клональность циркулирующих на территории России пенициллинустойчивых пневмококков с помощью перспективного метода мультилокусного сиквенс-типирования. С помощью метода ПЦР-типирования капсульных антигенов, адаптированного применительно к циркулирующей на территории РФ популяции, был охарактеризован серотиповый состав выборки пневмококков и показана перспективность антипневмококковой вакцинации.
