Гены фактора некроза опухолей и лимфотоксинов: регуляция экспрессии и анализ биологических функций методом генетического нокаута

ФНО и ЛТ были первоначально открыты и описаны как противоопухолевые и цитостагические факторы, однако в дальнейшем выяснилось, что они представляют собой многофункциональные цитокины, медиаторы развития и функционирования иммунной системы. Регуляция биологической активности ФНО и ЛТ регулируется на многих уровнях, начиная с транскрипции, трансляции и секреции лигандов и заканчивая многочисленными внутриклеточными молекулами, тормозящими либо усиливающими запускаемые рецепторами ФНО и ЛТ сигнальные каскады. Любое внешнее вмешательство в эту сложную систему приводит к разнообразным и не всегда предсказуемым последствиям. В частности, ФНО нашел лишь очень ограниченное применение в качестве противоопухолевого препарата вследствие своей высокой системной токсичности. В то же время, было установлено, что ФНО является ключевой молекулой, участвующей в развитии воспаления, поражения тканей и других патологических явлений при различных аутоиммунных заболеваниях. Это открытие привело к созданию и внедрению в зарубежную клиническую практику препаратов, фармакологическое действие которых основано на блокировании связывания ФНО с рецепторами ФНО на поверхности клеток. Такая блокада существенно облегчает симптомы таких заболеваний, как ревматоидный артрит и болезнь Крона, однако одновременно ослабляется иммунитет пациентов, что приводит к повышению частоты В-клеточных лимфом и к увеличению вероятности реактивации латентного туберкулеза. Таким образом, понимание регуляции и биологических функций ФНО и родственных ему ЛТ-альфа и ЛТ-бега на молекулярном уровне имеет значение не только доя молекулярной биологии и иммунологии, но и для практической медицины.

Цель работы. В данной работе представлен цикл исследований, включающий в себя регуляцию генов ФНО, ЛТ-альфа и ЛТ-бега в клеточных линиях и в первичных клеточных культурах мыши и человека, получение линий мышей с генетическими нокаутами ФНО, ЛТ-альфа и ЛТ-бега поодиночке и в различных комбинациях («комбинаторные нокауты»), и анализ биологических функций ФНО и ЛТ с использованием этих линий мышей.

Основные задачи исследования. В ходе проведения исследований решались следующие задачи:

Клонирование новых нуклеотидных последовательностей локуса фактора некроза опухолей (ФНО)/лимфотоксина (ЛТ), анализ последовательностей, в том числе компьютерный, приготовление молекулярных проб, экспрессионных конструктов и конструктов с геном-репортером.

Анализ регуляториых последовательностей и факторов транскрипции, участвующих в регуляции экспрессии генов ФНО, ЛТ-альфа и ЛТ-бета генов локуса в первичных культурах клеток и в клеточных линиях.

Получение линий мышей с одиночным и комбинаторным генетическим нокаутом генов ФНО, ЛТ-альфа и ЛТ-бета в клетках зародышевого пути.

Анализ функций ФНО и ЛТ in vivo при помощи сравнительного анализа фенотипа полученных мышей в норме и в модельных патофизиологических ситуациях.

Научная новизна работы. При выполнении представленной работы были получены новые, приоритетные результаты:

Выявлены основные функциональные элементы промоторов генов ЛТ-бета и ФНО мыши и человека.

Обнаружен и охарактеризован зависимый от факторов NF-kB/Rel энхансерный элемент, расположенный после гена ФНО.

Обнаружен новый высокоаффинный участок связывания транскрипционных факторов семейства NFAT в промоторе гена JIT-альфа.

Получены уникальные панели линий мышей с инактивацией генов ФНО, ЛТ-альфа и ЛТ-бета поодиночке и в комбинации. Впервые выполнена «чистая» (с удалением селективного маркера) инактивация каждого из генов локуса при помощи технологии LoxP/Cre рекомбинации.

Установлена ключевая роль ФНО в защите организма млекопитающих от внутриклеточных бактериальных патогенов. Впервые установлено, что «чистая» инактивация гена ЛТ-альфа не влияет на уровень экспрессии гена ФНО.

Выявлен принципиальный вклад ЛТ-бета в формирование и поддержание структуры вторичных лимфоидных органов. Впервые достоверно установлена роль ФНО в формировании Пейеровых бляшек.

Впервые доказано кооперативное действие ЛТ и ФНО на процесс формирования вторичных лимфоидных органов.

Практическая ценность работы. Полученные в настоящей работе сведения о биологической роли ФНО и ЛТ могут быть использованы в медицинской практике для разработки рекомендаций по профилактике инфекционных и аутоиммунных заболеваний и для выбора способов терапии. Созданные в ходе работы репортерные конструкты находят применение в работах российских и зарубежных лабораторий, исследующих регуляцию ФНО и ЛТ сигналов в различных биологических системах. Созданные в ходе работы линии мышей представляют ценность для исследований, нуждающихся в животных моделях с четко детерминированными моногенными аномалиями в иммунном ответе и защите организма.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на различных международных и всероссийских съездах, конференциях, симпозиумах, совещаниях и семинарах, в том числе: на 5-ом Международном Конгрессе по Фактору Некроза Опухолей (Асиломар, США, 1994), 6-ом Международном Конгрессе по Фактору Некроза Опухолей (Родос, Греция, 1996), 7-м Международном Конгрессе по Фактору Некроза Опухолей (Хианнес, США, 1998), 8-м Международном Конгрессе по Фактору Некроза Опухолей и родственным молекулам (Грондхейм, Норвегия, 2000), на конференции «Суперсемейство фактора некроза опухолей 2002» (Сан-Диего, Калифорния, США, 2002), на высших курсах РЕВЙ по идентификации новых мишеней для терапии рака (Киев, Украина, 2002), на 26-й конференции Гематологического Научного Центра РАМН (Москва, 2004), на отчетных конференциях по Программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Москва, 2004,2005).

Работа выполнена в ИМБ им. В. А. Энгельгардга РАН. В работе принимали участие сотрудники Московского Государственного Университета им. М. ВЛомоносова (Москва), Национального института рака (Фредерик, Мериленд, США), Университета г. Кельн, Технического Университета г. Мюнхен (Германия). Вклад отечественных и зарубежных коллег отражен в публикациях по теме диссертации. Автор выражает благодарность всем коллегам, принимавшим участие в выполнении работы и в обсуждении ее результатов, в особенности д.б.н. С. А. Недоспасову, д.б.н. РЛ. Турецкой, к.б.н. А. НШахову, К.6.Н. И. А. Удаловой, к.б.и. М. Б. Алимжанову, к.б.н. М.А.Лагарько-вой, К.6.Н. М. С. Друцкой, к.б.к. ДЛипииыиу, к.б.н. А. В. Туманову, к.б.н. С. И. Гривенникову.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российской Академии Наук, Российского Фонда Фундаментальных Исследований, Научного совета по геному человека, Европейской Академии Наук (http://www.eurasc.org), Международного союза против рака (http://www.uicc.org).

ТЫРф.

Рисунок 1. Клонирование гена ЛТ-альфа кролика (старое название — ФНО-бета, ТОТ-р). Сверху показана рестрикгная карта локуса: В, ВатН1- Н, Нт (1П1- Р, РуиПЯ, ЕсоМW, Рей. Горизонтальными стрелками показаны индивидуальные реакции определения нуклеотиднон последовательности. Вертикальные стрелки на экзон-интронной структуре генов обозначают некоторые цотенциальные участки связывания транскрипционных факторов семейства М^кВ.

1.3. Стратегия полного генетического нокаута генов локуса ФНО/ЛТ. Имея в руках необходимые молекулярные инструменты и заготовки, мы, приступили к получению линий мышей с прицельной инактивацией генов локуса ФНО/ЛТ. На рисунках 4 и 5 показаны схемы получения мышей с нокаутами генов ФНО и ЛТ-альфа, соответственно. Нокаугные мыши были получены с использованием гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках мыши в комбинации и системы рекомбинации ЬохР/Сге. Классическая технология генетического нокаута основана на способности эмбриональных стволовых клеток мыши осуществлять гомологичную рекомбинацию между хромосомами и короткими экзогенными фрагментами ДНК. При определенных условиях такая рекомбинация происходит с экспериментально определяемой частотой, при этом клетки не теряют способности превращаться в жизнеспособные клетки зародышевого пути при инъекции в ранние бластоцисты. Это позволяет исследователям вносить в гены точные, заранее просчитанные модификации. По классической технологии в кодирующей области производится вставка кассеты, экспрессирукицей маркер устойчивости к антибиотику неомицину («пео-кассегы»). Вставка (либо замена) производится с таким расчетом, чтобы произошла инактивация гена («нокаут») вследствие прерывания рамки считывания.

Введение

в модифицирующий («нокаутирующий») конструкт участков рекомбинации ЬохР позволяет проводить более тонкие манипуляции. После скрещивания мышей с модифицированным целевым локусом и трансгенных мышей, экспрессирующих рекомбиназу Сге, появляется возможность получить мышей, у которых удаление целевого гена происходит в данной ткани, либо после добавления индуктора, либо при выполнении какого-то другого условия («кондиционный нокаут»). Мы использовали технологию ЬохР/Сге для удаления из локуса ФНО/ЛТ пео-кассеты. Наличие такой активной транскрипционной единицы в непосредственной близости от генов ФНО, ЛТ-альфа и ЛТ-бета могло нарушить регуляцию транскрипции этих генов (и, как выяснилось в ходе работы, в ряде случаев действительно нарушало, см. ниже).

Рисунок 4. Получение мышей с мутацией ФНО. А, схема гомологичной рекомбинации конструкта в локус ФНО/ЛТ. Сверху вниз: схема локуса дикого типагенетический конструктлокус после рекомбинациилокус после делеции при помощи системы рекомбинации ЬохР/Сге. В, Саузерн-анализ ДНК локуса геномной ДНК из мышей, содержащих мутацию локуса ФНО/ЛТ. С, Представительные результаты генетического титрования мутанта ых мышей при помощи ПЦР.

Проверка структуры локуса после рекомбинации и Сге-олосредованноЙ делеции проводилась при помощи саузерн-анализа и ПЦР. Факт отсутствия соответствующих транскриптов устанавливали при помощи ПЦР на продуктах обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) и защиты РНК-ДНК гибридов от РНКазы (RNAse protection).

TNF LT-g.

GHHHJM.

LTBDI.

CAT activity, fold induction.

— Я—Я—Л?

Egr-l/Spl X «0» C≅>LTB-EteD.

— Ht-w.

LTB-KB.

LTB-Ete «z>LTB-Egr.

Рисунок 9. Анализ активности конструктов с геном-репортером. Сверху изображена экзон-интронная схема генов локуса ФНО/ЛТ, слева в увеличенном масштабе показано расположение мутаций в промоторных конструктах ЛТ-бета Справа показано, во сколько раз РМА индуцирует активность в клетках Juifcat гена-репортера хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), находящийся под контролем того или иного мутантного варианта промотора ЛТ-бета.

2.2. Закономерности экспрессии и функция JIT-бета in vivo. Следующий вопрос, который следовало решить, была экспрессии ЛТ-бета in vivo у взрослых мышей и в эмбриогенезе. Эта задача решалась при помощи гибридизации in situ с радиоактивно меченной антисмысловой РНК JIT-бета Одновременно анализировалась экспрессия ЛТ-альфа, так как для формирования функционального поверхностного гетерогримера необходима одновременная экспрессия обоих лимфотоксинов. Была обнаружена экспрессия ЛТ-бета в тимусе и селезенке, а также в мозге и коже новорожденных мышей (рисунок 10). Эти наблюдения хорошо коррелируют с установленной впоследствии ключевой ролью лиифотоксина в поддержании микроархитектуры лимфоидных органов, в возрастной инволюции тимуса и в формировании волосяных фолликулов. Экспрессии ЛТ-бета в мозге коррелирует с обнаружением лимфотоксина при повреждениях, вызванных рассеянным склерозом.

Promoter defctun.

Рисунок 13. Проверка функциональной активности энхансерного элемента, находящегося позади гена ФНО, в комбинации с различными мутантами ФНО промотора. Репортерные конструкты были собраны на основе вектора pSVOcat, таким образом, ген хлорамфениколацетилтрансферазы (cat) в комбинации с интроном большого Т-антигека и сигналом полиаденилирования вируса SV40 представлял собой модельный ген-репортер. На нижней части рисунка показаны результаты трансфекции (индукция ЛПС) в линию клеток макрофагального происхождения ANA-1 набора модельных конструктов, содержащих полный энхансерный элемент (темные прямоугольники), содержащих его часть без NFkB сайта (частично закрашенные прямоугольники) либо не содержащих после сигнала полиаденилирования никаких дополнительных регуляторных элементов (светлые прямоугольники). димеров, обладающих высоким трансактивирующим потенциалом (рисунок 12, комплекс III). Для проверки этого потенциала был сконструирован набор векторов с геном-репортером, находящимся под контролем различных делеционных мутантов как ФНО промотора, так и консервативного участка после гена ФНО, содержащего NFkB сайт. Результаты анализа активности гена-репортера после трансфекции в мышиные макрофаги показали, что новый энхансер не требуется для максимальной активации транскрипции полным промотором (рисунок 13, делеция -665), однако способен усиливать транскрипцию, если активность промотора ослаблена, причем это усиление зависит от присутствия в конструкте NFkB сайта #4.

Интересно, что впоследствии действительно было показано, что №кВ сайг #4 играет ключевую роль в активации гена ФНО в астроцитах — клетках, в которых базовая активность промотора ФНО не так высока, как в макрофагах. Нельзя исключить и возможности того, что данный энхансер активирует в астроцитах экспрессию двух других близко расположенных генов локуса, ЛТ-альфа и ЛТ-бета. О детекции активности этих генов в мозге сообщали как мы, так и другие исследователи.

0М*1кВвй<�к.

1 #2 91а *Э.

Mouse.

Proximal sites Egrl IRS Et* API k"ppa3 TATA.

Human 1 Ж § ««.

100%.

75″ f о? о к.

— loas.

— 800 400 -400.

Distance from transcription start, nt.

Рисунок 14. Компьютерный анализ последовательности промотора ФНО. В верхней части показано расположение участков связывания транскрипционных факторов в мышином и человеческом ФНО промоторах. В нижней части показана гистограмма нуклеотадиой гомологии между промоторами генов ФНО мыши и человека. Протяженные пики в районах -750 / -550 и -200 / 0 указывают на существование функционально значимых регуляторных районов, сохранившихся в эволюция.

3.2. Существует ли принципиальная разница в закономерностях транскрипционной регуляции генов ФНО человека и мыши? Следующей важной задачей по изучению гена ФНО было аккуратное и корректное сравнение регуляторных элементов генов мыши и человека. На момент начала этой работы уже существовала обширная литература по изучению промотора ФНО, при этом результаты, полученные на разных наборах конструктов и в разных клетках, существенно различались.

Поскольку мышиный промотор ФНО существенно отличается по нуклеотидной последовательности от своего человеческого аналога и содержит в негомологичной области сайт связывания белков ОТкВ (сайт #3, рисунок 14), которого нет в человеческом промоторе, в научном сообществе бытовало мнение, что два промотора существенно различаются по своему устройству и, следовательно, регуляция экспрессии человеческого и мышиного генов ФНО осуществляется существенно по-разному. Следовало проверить, действительно ли это так.

А в г Алвилпк я ИисЬагикм* о МисМгмтс* «.

Рисунок 15. Анализ взаимодействия белков семейства №'кВ с дисгальными сайтами связывания в промоторе гена ФНО. Комплекс I — №кВ1 гомодимер, комплекс II — №кВ ?/Яе1А гетеродимер. А, индукция №РкВ комплексов ЛПС в клетках АЫА-1, олигонуклеотидные пробы из мышиного промотора ФНОВ, то же самое, пробы из человеческого промотораС, анализ композиции ОТкВ комплексов при помощи специфических антител.

Прежде всего мы обнаружили, что сайт #3 существенно отличается от других №'кВ сайтов по спектру связываемых ЫРкВ комплексов. Вероятно, это отличие связано с особенностями нуклеотидной последовательности сайта и выражается в повышенном сродстве к гомодимерам ОТкВ 1 (рисунок 15А, комплекс I). Фактор М-ТсВ 1, в отличие от других представленных в макрофагах членов семейства ОТкВ, Яе1А и с-Ке1, не имеет трансактивационного С-концевого домена и, следовательно, гомодимер №'кВ 1 не способен активировать транскрипцию, и, более того, при определенных условиях способен оказывать репрессирующее воздействие. Эту особенность сайта #3 нам удалось обнаружить за счет отработанной нами методики высокоразрешающего нуклеопрогеинового геля. Во многих опубликованных работах, в той числе посвященных гену ФНО, разрешение нуклеопротеинового геля было недостаточным, в результате чего комплексы 1 (гомодимер NFkB 1) и II (гетеродямер NFkBl: RelA) сливались вместе, создавая ложное впечатление повышенной аффинности сайта #3 к NFkB вообще.

Norrrutlzed tucrferase «ctivity.

— Proximal ¦[toe до.

Mouse.

Diltll tB «It» D яр

SOK Т" low кащмЗЛДТА.

Human.

SO* 75* 1W%.

Рисунок 16. Функциональная активность мутантов промоторов ФНО мыши и человека. Версии промоторов с мутациями в индивидуальных сайтах связывания транскрипционных факторов (отмечены крестами) были присоединены к гену люциферазы в составе вектора рСлЬЗЬавю. После трансфекции в клетки АНА-1 активность люциферазы использовалась в качестве репортерной, измерялась степень ее индукции ЛПС (горизонтальные гистограммы в правой части рисунка), результат нормировался на активность конструкции дикого типа.

Далее мы провели систематический мутагенез кВ и кВ-подобных сайтов в контексте полноразмерных мышиного и человеческого промоторов, клонированных в одинаковые вектора с геном-репортером. Оба набора конструктов были трансфецированы как в мышиные клетки макрофагальной линии АИА.-1 (рисунок 16), так и в человеческие макрофаги МопоМасб (данные не показаны). Оказалось, что сайты #2 и #2а, обладающие относительно невысоким суммарным сродством к№кВ белкам, но при этом предпочитающие связывать трансактивирующие гетеродимеры, вносят больший вклад в активность промотора, чем высокоаффинный сайт #3.

При систематическом делеционном анализе двух промоторов (данные не показаны) выяснилось, что при активации макрофагов форбояовыми эфирами задействована лишь проксимальная область промотора длиной около 200 пн, та же самая, которая необходима и достаточна для корректной работы промотора ФНО в Т-лимфоцигах. При этом как взаимное расположение регуляторных элементов, так и уровни активации, достигаемые репортерными конструктами на основе мышиного и человеческого промоторов, при параллельной трансфекции в одни и те же клетки в одном эксперименте, оказались очень сходными.

Таким образом, наши исследования позволили установить, что между мышиным и человеческим генами ФНО не существует заметной разницы в плане организации и функциональной активности регуляторных элементов. Это очень важный вывод, являющийся еще одним аргументом в споре о том, в какой степени результаты исследований, проводимых на мышах, применимы к человеку. Наши результаты позволяют утверждать, что в том, что касается продукции ФНО при воспалении, перенос мышиных данных в человеческую систему во всяком случае не является изначально некорректным.

3.3. Ожидаемые и неожиданные черты фенотипа мышей с генетическим нокаутом ФНО. Важнейшим источником информации при изучении биологической роли ФНО являются нокаутные мыши. Создав свою собственную линию мышей с нокаутом ФНО (рисунок 4), мы провели серию опытов по устойчивости к острой гепатотоксичности, индуцированной ЛПС насенситизированных мышах (это классическая модель ФНО-зависимого токсического шока), а также к экспериментальному листериозу (рисунок 17). Мы также провели детальное анатомическое обследование полученных животных.

В целом ФНО нокаутные мыши, полученные нами по LoxP/Cre технологии, оказались эквивалентны ранее опубликованным ФНО нокаутным мышам, полученным по классической технологии, за одним важным исключением: у наших мышей полностью отсутствовали Пейеровы бляшки на тонком кишечники, в то время как у нескольких «классических» ФНО нокаутаых линий они всегда присутствовали в большей или меньшей степени. Опыт по скрещиванию друг с другом разных ФНО.

Mortality.

Challenge WT TNF" «'» TNF*M.

10 ng LPS + 20 mg D-Gal ip. 4/4 0/5* 0/4″ .

100 jig LPS + 20 mg D-Gal Lp. S/5 0/6* 0/7*.

50,000 L monocytogenes i.V. 0/6 9/9* 8/8*.

1С8 L monocytogenes per es 0/5 7/8* у 6/7**.

Рисунок 17. Роль ФНО в защите организма. Была изучена устойчивость мышей двух линий, мугангных по гену ФНО, к острой ЛПС-индуцированной гепатотоксичности после сенсибилизации О-галакгозамином, и к заражению листериями внутривенно либо перорально. нокаутных мышей с последующим получением двух разных ФНО мутаций в виде гомозигот в одном помете (рисунок 18) свидетельствует о том, что данный фенотип не зависит от генетического фона и является следствием манипуляций, произведенных в ФНО/ЛГ локусе.

Genotype Number of mice PP per mouse.

TNFR1V" 5 0*.

TNF7″ «13 4−5.

TNpVA 8 4−5.

XNpA/A 11 о.

Рисунок 18. Роль ФНО в формировании Пейеровых бляшек. Мыши двух линий с нокаутом гена ФНО, сделанным при помощи замены части гена на кассету устойчивости к неомицину (TNF") либо при помощи LoxP/Cie технологии (TNF4) были скрещены друг с другом, после чего было проведено скрещивание гетерозигот по локусу ФНО (TNF" A) друг с другом. В результате в составе одного помета были получены мыши TNF" '" и TNF474. Далее был проведен анатомический анализ полученных мышей на предмет наличия Пейеровых бляшек. Мыши, нокаутные по рецептору ФНО первого типа (TNFR.r'~), использовались в качестве контроля.

Достоверно известно, что для формирования Пейеровых бляшек критически важен лимфотоксин, экспрессируемьгй так называемыми индукторными клетками лимфоидной ткани. Вопрос же о роли ФНО в этом процессе крайне запутан, интерпретация имеющихся данных осложнена целым рядом обстоятельств, связанных с вырожденностью лиганд-рецепторных взаимодействий в системе ФНО/ЛГ и со сцепленносгью генов, кодирующих лиганды и рецепторы. На настоящий момент мы рассматриваем два основных объяснения наблюдаемому фенотипу: либо в классическом нокауте активно транскрибируемая кассета устойчивости к неомицину аномально повышает уровень экспрессии ЛТ-альфа, либо в нашем нокауте понижена экспрессия ЛТ-бета вследствие удаления вместе с геном ФНО ЛТ-бета специфического энхансера.

Таким образом, мы охарактеризовали несколько новых №кВ-зависимых энхансеров в рехуляторных областях гена ФНО, впервые достоверно установили сходство закономерностей транскрипционной регуляции генов ФНО мыши и человека, и обнаружили новую роль ФНО в формировании Пейеровых бляшек у мышей.

Глава 4. ЛТ-альфа. ВЫСОКОАФФИННЫЙ УЧАСТОК СВЯЗЫВАНИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ СЕМЕЙСТВА №АТ В ПРОМОТОРЕ. АНОМАЛИИ РАЗВИТИЯ ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНАХ И НОРМАЛЬНАЯ ПРОДУКЦИЯ ФНО У МЫШЕЙ С «ЧИСТЫМ» ГЕНЕТИЧЕСКИМ НОКАУТОМ.

4.1. Анализ транскрипционной регуляции гена ЛТ-альфа в периферических мононуклеарах человека. Подобно генам ФНО и ЛТ-бета, анализ гена ЛТ-альфа также начался с компьютерного анализа выравнивания промоторных областей (рисунок 19). -МО ,.

Rabbit TCCCAG. C CCACGGTTCC CCTGACCCCA СТССССТТСС CAGAACTCAA TCGCCCSAGC.

Ншвп TCCCTGCGSC CCACAGTTCC CCCGACCCGA СТСССГТТСС CAGAACGCAG TACTCTAAGC.

Mouse TCCCAS. C CC1CGATTCC «XTGACCCGA CTCCCHTCC CAGAACTCAG TCCCCTGMC.

Салюте тох-е-т-с пас—ттсс cc-gaccc-a стс-с-ттсс casaac-caт-е-с—а-с ' -1S0 ¦

Babbit CCCCAGCCTG TSGTTGCC1C CTAGfiCCCCA GCCITTCCT6 CCTTCGACIG АААСАбСАК.

Имя" cctiascctc соеттстстс адввссссд ссстгтсстс ccttcgmtg aaacagcam.

Hunan CCCCAGCCTG 7ВСТТСГС1С CTAGGCCTCA GCCTrTCCTG CCTTTCMTG AAACAGCAGT Consensus CC—ASCCTGЙвТТС-СТС CTAfiGCC-CA GCCTTTCCTG CCTT-GWTS AAACASCAG.

— 120.

Rabbit AICTTCTCAQ CCCTGCCCfiC TTCCCCGGSC CCCASCCCtG AGCCTA6AAC CCSCCCCCCG Hunn ATCTTCTAAG CCCTCCSCfiC TTCCCCAACCCCCAGCCCCS A. CCTAGAAC CCCCCC6CTG House ATCTTCTAAG CCCTCfeteC netecSGFEcCAGCCCCS A. CCTAGAAC CC6CCCCCTG CcnMrtsus ATCjrCT-AS COCTCGGGGC TTCCCC—GC CCCAUCCCC6 A-CCTAGAAC CCGCCCCC-G.

——> AP-ZSpl;

— 60 CAP-«It» (¦*)}*.

Rabbit CCTGCCACGC T"CC6CTGCt ACTGCCGCTT CCTCTATAAA CGGACCCAAC C6TCC0CGCC.

House CCTGCCACAC ГСССССТТСС .C.CCTCTATAAA OCGACCCGAC CGCCACCGCC.

Hunan CCTGCCACaC T"CCAC!GCt 6C. ТГ CCTCTATAAA GGGACCTGAC C6TCCCGGCC.

Consensus GCCTGCOUX TGCC-CT-CCC——-— CCTCTATAAA GG6ACC—AC CC-C-C-GCC.

ТАГА" box.

Рисунок 19. Выравнивание промоторных областей генов JIT-альфа кролика, мыши и человека. Подчеркнуты высоко консервативные участки связывания транскрипционных факторов.

Довольно долго мы не могли достичь существенного прогресса в изучении гена ЛТ-альфа, поскольку не удавалось подобрать клетки, при трансфекции в которые репортерные конструкты отвечали бы на активационные стимулы, что позволило бы начать мутагенез промотора с целью выявления важных регуляторных участков на уровне ДНК, и впоследствии сформулировать гипотезу о ключевых транскрипционных факторах на основании последовательностей белок-связывакмцих элементов промотора Прорыв наступил, когда выяснилось, что экспрессия ЛТ-альфа может быть активирована в мононуклеарах периферической крови человека, а затем подавлена иммуносуппресантом циклоспорином, А (рисунок 20). Было известно, что первичной мишенью циклоспорина, А является фосфатаза кальцинеурин, которая в свою очередь регулирует транскрипционные факторы семейства KFAT. Основываясь на этой информации, мы приступили к прицельному компьютерному поиску потенциальных WAT сайтов в последовательности промотора JIT-альфа человека и идентифицировали 5 кандидатных последовательностей (рисунок 21).

Oh.

5b.

9h аСЮ28 — — -+ ++ + + + «CD3 —++¦-.-++ + + CsA -±¦±+— +.

— LTct <-28S.

12 3 4 5 4 7 «9 10.

Рисунок 20. Чувствительность уровня РНК ЛТ-альфа к иммуносуппресанту циклоспорину А. Мононуклеары периферической крови человека активировались антителами к € 1)3 («аСБЗ») и С028 («аСП28»), адсорбированными на пластике, в течение 5 либо 9 часов, в присутствии либо в отсутствие циклоспорина, А («СвА»). Показаны результаты нозерн-анализа суммарной РНК. ттстаадмттсгятопамиисти^^.

КГАТ5.

ИКХККЗАЯССАТТААТЛТТТТСАССТС^С^^ тетоатахачддсстегаслтадо^^.

ГАГ".

В-НКАГ тгслеоэллосэвассгссАйста^^ стайесстеассссастссстовссхтоса^^.

НРЛТЗ.

ЛАСССССа0ССГ<�Ж"ТТСТСТСХЖАВКЯЖЗ"0"Ж^ л-лгмг.

ЬТАКВ ТЛТА сскзмкзггссооссссАоскостссасхсм^.

Рисунок 21. Результаты компьютерного поиска консенсусных последовательностей участка связывания белков семейства ЫРАТ в промоторе гена ЛТ-альфа человека. Подчеркнут также участок связывания белков №кВ. ТАТА-бокс отмечен подписью снизу.

Таким образом, мы нашли новый высокоаффинный сайг связывания NFAT в промоторе гена JIT-альфа человека. Изучение функциональной роли этого сайта сдерживается отсутствием подходящей клеточной системы, т.к. мононуклеары периферической крови крайне трудно поддаются трансфекции. Поскольку ЛТ-альфа имеет непосредственное отношению к поддержанию структуры лимфоидных органов и другим аспектам иммунитета, вопрос о влиянии циклоспорина, А и NFAT на экспрессию ЛТ-альфа является крайне актуальным. Было бы интересно в будущем сделать нокаутную линию мышей с интактным геном ЛТ-альфа, но с мутацией сайта NFAT4.

4.2. Выявление ФНО компонента в фенотипе классического JIT-альфа нокаута. Получив мышь с полным нокаутом гена ЛТ-альфа по LoxP/Cre технологии, мы измерили уровень ФНО в сыворотке этих мышей после инъекции ЛПС, и обнаружили, что он находится на уровне дикого типа (рисунок 23). Этот результат находится в резком контрасте с наблюдением на классическом нокауте ЛТ-альфа (Де Тогни и соавт., 1994, Science, 264:703), в котором продукция ФНО снижена в несколько раз. Аналогичное наблюдение было сделано и с использованием основных клеточных популяций, являющихся источником системного ФНО (рисунок 24). Наши данные показывают, что, вероятнее всего, биологическая роль ЛТ была переоценена на основании анализа фенотипа классического ЛТ-альфа нокаута На самом деле часть функций, которые приписывали ЛТ (в частности,.

Рисунок 23- Нормальная продукция ФНО в мышах с нокаутом ЛТ-альфа, не содержащих пео-кассегу в локусе ФНО/ЛТ. Сравнивалась продукция ФНО в сыворотке крови после инъекции ЛПС в мышах с классическим нокаутом гена ЛТ-альфа, сделанном при помощи замены на пео-кассегу (LTcfи нокаута, полученного при помощи LoxP/Cre технологии (ЬТал, л). некоторые аспекты организации Ги В-клеточных зон в селезенке, защиту организма в ряде вирусных и паразитарных моделей) исполняет ФНО. Кроме того, наши данные определенно показывают, что если при нокаутировании ЛТ-альфа не нарушена регуляция транскрипции гена ФНО, то никакого дополнительного вторичного действия на экспрессию ФНО ЛТ-альфа не оказывает. Таким образом, наши результаты существенным образом изменили представления о биологической роли ЛТ-альфа. С одной стороны, мы обнаружили, что ЛТ-альфа является одной из мишеней иммуносуппрессора циклоспорина А, который, вероятно, действует через сайт связывания №кВ в ЛТ-альфа промоторе. С другой стороны, наши данные ставят под серьезное сомнение часть ранее опубликованных выводов о роли ЛТ-альфа в защите организма.

Глава 5. АНАЛИЗ ВЫРОЖДЕННЫХ И КООПЕРАТИВНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ ФНО ИЛТНА МЫШАХ С КОМБИНАТОРНЫМИ ГЕНЕТИЧЕСКИМИ НОКАУТАМИ ФНО, ЛТ-бега и ЛТ-альфа.

Локус ФНО/ЛТ сложно устроен и сложно регулируется. На рисунке 25 изображена схема, суммирующая наши результаты по регуляции транскрипции.

Рисунок 25. Сводная схема регуляторных элементов локуса ФНО/ЛТ. (1) Промотор гена ЛТ-альфа. Демонстрирует наиболее тканеспецифичную картину экспрессии. (2) Дальний промотор гена ФНО. Содержит сайты связывания, ответственные за полную активацию промотора в макрофагах в ответ на ЛПС. Зависит от №кВ. (3) Проксимальный ФНО промотор, достаточен для промежуточного уровня активности. Содержит все элементы, необходимые и достаточные для корректной работы в Г-клетках. (4) Третий ингрон гена ФНО. Содержит участки гшерчувсгвигельности к ДНКазе 1 и участки связывания транскрипционных факторов. Способен действовать как конститутивный и-как— ЛПС-завишмый энханссрГ (5) М’кВ — зависимый энхансер. Способен модулировать транскрипционную активность гена ФНО в макрофагах. Является основным энхансером ФНО в астроцигах. (€) Промотор ЛТ-бета. Интегрирует сигналы от нескольких семейств транскрипционных факторов, включая №кВ.

Поскольку ФНО и ЛТ-альфа тример взаимодействуют с одними и теми же рецепторами, интересно было посмотреть, не возникнет ли кооперативного эффекта при нокауте двух или трех генов одновременно. Поскольку все гены находятся в одном локусе, получить комбинаторный нокаут скрещиванием было невозможно, и пришлось для каждой комбинации проводить отдельную процедуру нокаутирования. Мы использовали единственный генетический конструкт, содержавший множественные сайты рекомбинации 1лхР. В зависимости от того, между какими сайтами происходила рекомбинация, получался аллель ФНО/ЛТ локуса с удалением либо двух генов ФНО и ЛТ-бета (рисунок 26), либо аллель с удалением всех трех генов локуса (рисунок 27).

1 кЬ мну игр нокауте неупорядочена в той же степени, что и в тройном нокауте. Очевидно, это является следствием дефекта продукции ФИО, т.к. микроструктура селезенки в нашем ЛТ-альфа нокауте, производящем нормальные уровни ФНО, похожа уже на более упорядоченную структуру в нокауте ЛТ-бета.

Архитектура селезенки.

Маргинальная зона Т/В клеточные зоны Гермика-тивные центры Пейеровы бляшки Лимфоузлы tnf* аномальная раздельные нет отсутствуют есть все lt.

Itb^tnf* отсутствует смешанные нет отсутствуют только мезентери-альные ltbAatnf>/AltaA/a отсутствует сильно смешанные нет отсутствуют нет.

Рисунок 28. Сводная таблица фенотипов лимфондяых органов мышей, нокаутных по генам ФНО и ЛТ.

Рисунок 29. Графическое отображение представлений о пересекающихся и уникальных функциях ФНО и ЛТ. Рисунок из статьи Купраш и соавт., Mol Cell Biol, 2002, 22:8626−8634. Согласно последним данным (Cui et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2006,103:9142−9147) ЛТ-бета, возможно, играет самостоятельную роль в формировании волосяных фолликул. Пониженная продукция ФНО в классическом ЛТ-альфа нокауте (Liepinsh et al, Mol Cell Biol 2006,26:42 144 225) ставит под сомнение роль ЛТ-альфа в иммунитете к патогенам.

Ряд опубликованных работ, содержащих утверждения о важной роли ЛТ-альфа в защите организма, использовали мышей с классическим ЛТ-альфа нокаутом, и, вероятнее всего, наблюдавшиеся в этих работах эффекты были связаны с недостаточной продукцией ФНО, а не с передачей сигнала через ЛТ. В 2002 году (рисунок 29) считалось, что ЛТ-альфа играет самостоятельную роль в иммунитете к ряду патогенов, однако сейчас следует признать, что, вероятнее всего, это не так, во всяком случае, этот вывод требует дополнительной проверки. Однако вывод о независимой роли ЛТ-альфа в развитии мукозальных лимфоузлов, по-видимому, соответствует действительности. выводы.

1. Впервые клонирован гены фактора некроза опухолей (ФНО) и лимфотоксина-бета (ЛТ-бета) кролика, выявлены новые и уточнены ранее известные регуляторные последовательности, управляющие транскрипцией гена ФНО в макрофагах.

2. Впервые охарактеризованы основные регуляторные последовательности промотора ЛТ-бета мыши, отвечающие за активацию транскрипции гена ЛТ-бета в Т-лимфоцитах.

3. Установлена ключевая роль белков семейства ОТкВЛ1е1 в транскрипции генов ФНО и ЛТ-бета. Обнаружены новые, эволюционно консервативные участки связывания факторов №'кВ/Т1е1 в локусе ФНО/ЛТ и показано их функционирование в качестве энхалсеров транскрипции.

4. Впервые обнаружен и функционально охарактеризован новый высокоаффинный участок связывания транскрипционных факторов семейства ОТАТ в промоторе гена ЛТ-альфа.

5. Создана панель линий мышей с полным нокаутом генов ФНО, ЛТ-альфа и ЛТ-бета. Подтверждена ключевая роль ЛТ-альфа в формировании вторичных лимфоидных органов. Впервые показана уникальная роль ФНО и кооперация между ФНО и ЛТ сигналами в формировании и поддержании структуры вторичных лимфоидных органов.

6. Установлена ключевая роль ФНО в защите организма млекопитающих от внутриклеточных бактериальных патогенов. Впервые установлено, что «чистая» инактивация гена ЛТ-альфа не влияет на уровень экспрессии гена ФНО.

7. Установлена ключевая роль ЛТ-бета в формировании и поддержании структуры вторичных лимфоидных органов. Впервые достоверно установлена роль ФНО в формировании Пейеровых бляшек.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Шахов АН, Купраш ДВ, Турецкая РЛ, Азизов ММ, Андреева АВ, Недоспасов С А, Клонирование и структурный анализ генов фактора некроза опухолей и лимфотоксика кролика. Молекулярная биология. 1989;23:1743−1750.

2. Shakhov AN, Kuprash DV, Azizov MM, Jongeneel CV, Nedospasov SA, Structural analysis of the rabbit TNF locus, containing the genes encoding TNF-beta (lymphotoxin) and TNF-alpha (tumor necrosis factor). Gene 1990;95:215−221.

3. Турецкая РЛ, Купраш ДВ, Удалова ИА, Азизов ММ, Недоспасов СА, Клонирование и характеристика хромосомной копии гена рецептора фактора некроза опухолей человека. ДАН СССР 1990;315:1475−1478.

4. Nedospasov SA, Udalova LA, Kuprash D" V, Turetskaya RL, DNA sequence polymorphism at the human tumor necrosis factor (TNF) locus. Numerous TNF/iymphotoxin alleles tagged by two closely linked microsatellites in the upstream region of the lymphotoxin (TNF-beta) gene. J.Immunol. 1991;147:1053−1059.

5. Турецкая РЛ, Удалова ИА, Купраш ДВ, Терских АВ, Недоспасов СА, Клонирование и характеристика локуса генома человека, содержащего ген рецептора фактора некроза опухолей второго типа. ДАН СССР 1991;320:1258−1261.

6. Udalova IA, Kuprash DV, Turetskaya RL, Nedospasov SA, An STS in the human TNF locus located at 6p21.3. Nucleic Acids Res. 1991;19:4784.

7. Азизов MM, Ульянов АВ, Купраш ДВ, Шахов АН, Гавин ИМ, Недоспасов СА, Получение и характеристика клонотеки мононуклеосомной ДНК из хроматина клеток человека и ее использование для изучения сродства нуклеосомной ДНК к гисгоиам. ДАН СССР 1992;322:415−420.

8. Купраш ДВ, Недоспасов СА, Взаимодействие транскрипционных факторов семейства NFkB/Rel с ДНК приводит к ее значительному изгибу в участке связывания. ДАН СССР 1992;322:421−426.

9. Недоспасов СА, УдаловаИА, Смирнова ЮБ, Купраш ДВ, Жарков ВГ, Турецкая РЛ, Генетический полиморфизм локуса генома человека, содержащего ген фактора некроза опухолей: этнические различия в распределении частот встречаемости аллелей. Докл. Росс. Акад. Наук 1993;331:504−508.

10. АлимжановМБ, Купрашг ДВ, Турецкая РЛ, Осипович OA, Бородулина OP, Осовская ВС, Чумаков ПМ, Недоспасов СА, Клонирование и характеристика гена мыши, кодирующего аналог GADD45 человека — белка, индуцируемого в ответ на повреждения ДНК. Докл. Росс. Акад. Наук 1994;333:788−791.

11. Купраш ДВ, Алимжанов МБ, Похолок ДК, Козлов СВ, Новобранцева ТИ, Турецкая РЛ, Недоспасов С А, Характеристика локуса хромосомы 17 мыши, содержащего три гена семейства фактора некроза опухолей, включая ген трансмембранной субъединицы лимфотоксина (ЛТ-бета). Докл. Росс. Акад. Наук 1994;337:683−686.

12. Kuprash DV, Udalova IA, Tuietskaya RL, Rice NR, Nedospasov SA, Conserved kappa В element located downstream of the tumor necrosis factor alpha gene: distinct NF-kappa В binding pattern and enhancer activity in LPS activated murine macrophages. Oncogene 1995;11:97−106.

13. Kuprash DV, Rice NR, Nedospasov SA, Homodimer of p50 (NF kappaBl) does not introduce a substantial directed bend into DNA according to three different experimental assays. Nucleic Acids Res. 1995;23:427−433.

14.PokholokDK, Maroulakou IG, KuprashDV, Alimzhanov MB, Kozlov SV, NovobrantsevaTT, Turetskaya RL, Green JE, Nedospasov SA. Cloning and expression analysis of the murine lymphotoxin beta gene. Proc Natl Acad Sei U S A 1995;92:674−678.

15. Stuber F, Udalova LA, Book M, Drutskaya LN, Kuprash DV, Turetskaya RL, Schade FU, Nedospasov SA. -308 tumor necrosis factor (TNF) polymorphism is not associated with survival in severe sepsis and is unrelated to lipopolysaccharide inducibility of the human TNF promoter. J.Inflamm. 1995;46:42−50.

16. Удалова ИА, Турецкая РЛ, Кулраш ДВ, Недоспасов CA, Две ступени активации транскрипции гена фактора некроза опухолей человека в макрофагах. Роль белков семейства NF-kappaB/Rel при действии липополисахарида. Докл. Росс. Акад. Наук 1995;342:413−417.

17. Турецкая РЛ, Варфоломеев ЕЕ, Лопухина АА, Удалова ИА, Кулраш ДВ, Красильников АН, Чаплин ДД, Недоспасов CA, Полиморфные маркеры гена р75 рецептора фактора некроза опухолей: использование для анализа связи с болезнями. Докл. Росс. Акад. Наук 1996;3 51:558−560.

18. Kuprash DV, Osipovich OA, Pokholok DK, Alimzhanov MB, Biragyn A, Turetskaya RL, Nedospasov SA. Functional analysis of the lymphotoxin-beta promoter. Sequence requirements for PMA activation. J.Immunol. 1996; 156:24 652 472.

19. Alimzhanov MB, Kuprash DV, Kosco-Vilbois MH, Luz A, Turetskaya RL, Tarakhovsky A, Rajewsky K, Nedospasov SA, Pfeffer К, Abnormal development of secondary lymphoid tissues in lymphotoxin betadeficient mice. Proc Natl Acad Sei U S A 1997;94:9302−9307.

20. Kuprash DV, Udalova IA, Turetskaya RL, Kwiatkowski D, RiceNR, Nedospasov SA, Similarities and differences between human and murine TNF promoters in their response to lipopolysaccharide. J Immunol 1999;162:4045−4052.

21.Kuprash DV, Alimzhanov MB, Tumanov A, Anderson AO, Pfeffer K, Nedospasov SA, TNF and Lymphotoxin beta cooperate in the maintenance of secondary lymphoid tissue microarchitecture but not in the development of lymph nodes. J Immunol 1999;163:6575−6580.

22.Коробко ВГ, Бойченко BE, Купраш ДВ, Турецкая РЛ, Недоспасов СА, Гетерологичная экспрессия лимфотоксинов мыши в Escherichia coli и приготовление антител. Биоорганическая химия 1999, 25(4):270−274.

23. Wedel A, Frankenberger М, Sulski G, Petersmann I, Kuprash D, Nedospasov S, Ziegler-Heitbrock HW. Role of p52 (NF-kappaB2) in LPS tolerance in a human В cell line. Biol Chem. 1999;380:1193−1199.

24.Boitchenko VE, Korobko VG, Prasolov VS, Kravchenko VY, Kuimov AN, Turetskaya RL, Kuprash DV, «Nedospasov SA, Immunodetection of murine Iymphotoxins in eukaiyotic cells. Russian J Immunol 2000;5:259−266.

25.Eskdale J, Turetskaya RL, Armstrong C, Kuprash DV, Nedospasov SA, Gallagher G, A polymorphic niicrosatellite marker in the human p55 TNF receptor, CD 120a. Genes Immun 2000;1:228−230.

26.ДризеНИ, Друцкая MC, Герасимова ЛП, МанаковаТЕ, Чертков ИЛ, Турецкая РЛ, Купраш ДВ, Недоспасов СА, Изменения в гемагопоэтической системе мышей, дефицитных по фактору некроза опухолей или лимфотоксину-альфа. Бюлл. эксп. биол. мед. 2000; 130:676−678.

27.Бойченко BE, Алимжанов МБ, Турецкая РЛ, Рюльман А, Нордхайм А, Купраш ДВ, Недоспасов С А, Сравнительная характеристика транскрипции генов субьединиц альфа и бега лимфотоксина в линиях Ти В-лимфоцитов, в периферических лимфоцитах и в нормальных тканях человека. Молекулярная биология 2001;35:115−121.

28. Kuimov AN, Kuprash DV, Petrov VN, Ydovichenko KK, Scanlan MJ, Jongeneel CV, Lagarkova MA, Nedospasov SA, Cloning and characterization of TNKL, a member of tankyrase gene family. Genes Immun 2001;2:52−55.

29.Boitchenko VE, Kuprash DV, Nordheim A, Ruhimann A, Nedospasov SA, Cyclosporin A blocks PMA and lonomycin activated lymphotoxin expression in a human T-cell line. Russian J Immunol 2001;6:9.

30. Друцкая MC, Купраш ДВ, Недоспасов CA, Чертков ИЛ, Дризе НИ, Кроветворение у мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли: аномалии, выявляемые в длительной культуре костного мозга. Бюлл. эксп. биол. мед.2001;131(2):150−152.

31. Shakhov AN, Leufgen Н, Drutskaya LN, Kuprash DV and Nedospasov SA. Transcriptional regulation of the gene encoding p40, a component ofIL12 and IL23, in murine macrophages. Russian Journal of Immunology, 2001, 6:357−366.

32.Kuprash DV, Boitchenko VE, Yarovinsky FO, Rice NR, Nordheim A, Ruhimann A, Nedospasov SA. Cyclosporin A blocks the expression of lymphotoxin alpha, but not lymphotoxin beta, in human peripheral blood mononuclear cells. Blood. 2002 Sep 1−100(5): 1721−1727.

33.Soloviev A, Schwarz EM, Kuprash DV, Nedospasov SA, Puzas JE, Rosier RN, O’Keefe RJ. The role of pl05 protein in NPkappaB activation in ANA-1 murine macrophages following stimulation with titanium particles. J Orthop Res. 2002 Jul-20(4):714−22.

34. Tumanov AV, Kuprash DV, Lagarkova MA, Griveimikov SI, Abe K, Shakhov AN, Drutskaya LN, Stewart CL, Chervonsky AV and Nedospasov SA. Distinct Role of Surface Lymphotoxin Expressed by В Cells in the Organization of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity 2002 17(3):239−250.

35. Kuprash DV, Alimzhanov MB, Tumanov AV, Grivennikov SI, Shakhov AN, Drutskaya LN, Marino MW, Turetskaya RL, Anderson AO, Rajewsky K, Pfeffer.

К, Nedospasov SA. Redundancy in tumor necrosis factor (TNF) and lymphotoxin (LT) signaling in vivo: mice with? motivation of the entire TNF/LT locus versus single-knockout mice. Mol. Cell. Biol, 2002,22:8626−8634.

36. Abe K, Yarovinsky FO, Murakami T, Shakhov AN, Tumanov AV, Ito D, Drutskaya LN, Pfeffer К, Kuprash DV, Komschlies KL, Nedospasov SA. Distinct contributions of TNF and LT cytokines to the development of dendritic cells in vitro and their recruitment in vivo. Blood, 2003, 101:1477−1483.

37. Tumanov AY, KupTash DV, Nedospasov SA. The role of lymphotoxin in development and maintenance of secondary lymphoid tissues. Cytokine Growth Factor Rev, 2003, 14:275−288.

38. Lagarkova MA, Koroleva EP, Kuprash DV, Boitchenko VE, Kashkarova UA, Nedospasov SA, Shebzukhov YuV, Evaluation of humoral response to tumor antigens using recombinant expression-based serological mini-arrays (SMARTA). Immunology Letters, 2003, 85(l):71−74.

39. Tumanov AV, Griveraikov SI, Shakhov AN, Rybtsov SA, Koroleva EP, Takeda J, Nedospasov SA, Kuprash DV. Dissecting the role of lymphotoxin in lymphoid organs by conditional targeting. Immunol Rev, 2003, 195:106−116.

40. Shakhov AN, Rybtsov S, Tumanov AV, Shulenin S, Dean M, Kuprash DV, Nedospasov SA. SMUCKLER/TIM4 is a distinct member of TIM family expressed by stromal cells of secondary lymphoid tissues and associated with lymphotoxin signaling. Eur J Immunol, 2004 Feb-34(2):494−503.

41. Королёва ЕП, Лагарысова MA, Хлгатян CB, Шебзухов ЮВ, Мещеряков АА, Личиницер MP, Недоспасов CA, Купраш ДВ. Серологическое исследование репертуара раковых антигенов и аутоаягигенов человека. Молекулярная биология, 2004, 38:1−6.

42. Tumanov AV, Kuprash DV, Mach JA, Nedospasov SA and Chervonsky AV Lymphotoxin and TNF produced by В cells are dispensable for maintenance of the follicle-associated epithelium but are required for development of lymphoid follicles in the Peyer’s patches. J Immunol, 2004 Jul 1−173(1):86−91.

43. Grivennikov SI, Tumanov AV, Liepinsh DJ, Kruglov A A, Marakusha BI, Shakhov AN, Murakami T, Drutskaya LN, Forster I, Clausen BE, Tessarollo L, RyfFel B, Kuprash DV, Nedospasov SA. Distinct and non-redundant in vivo functions of TNF produced by T cells and macrophages/neutrophils: protective and deleterious effects. Immunity 2005,22:93−104.

44. Kuprash DV, Tumanov AV, Liepinsh DJ, Korole-va EP, Drutskaya MS, Kruglov AA, Shakhov AN, Southon E, Murphy WJ, Tessarollo L, Grivennikov SI, and Nedospasov SA. Novel tumor necrosis factor-knockout mice that lack Peyer’s patches. Eur J Immunol. 2005, 35:1592−1600.

45. Komarova EA, Krivokrysenko V, Wang K, Neznanov N, Chernov MV, Komarov PG, Brernan M-L, Golovkina TV, Rokhlin O, Kuprash DV, Nedospasov SA, Hazen SR, Feinstein E, and Gudkov AV. p53 is a suppressor of inflammatory response in mice. FASEB J. 2005, 19:1030−1032.

46. Drutskaya MS.

Inhibitory effects of tumor necrosis factor on hematopoiesis seen in vitro are translated to Increased numbers of both committed and multipotent progenitors in TNF-deficient mice. Exp Hematol, 2005, 33:1348−56.

47. Welniak LA, Kuprash DV, Tumanov AV, Panoskaltsis-Mortari A, Blazar BR, Sun K, Nedospasov SA, Murphy WJ. Peyer’s patches are not required for acute graft-versus-host disease after myeloablative conditioning and murine allogeneic bone marrow transplantation. Blood. 2006,107:410−412.

48. Liepinsh DJ, Grivennikov SI, Klarmaim KD, Lagarkova MA, Drutskaya MS, Lockett SJ, Tessarollo L, McAuliffe M, Keller JR, Kuprash DV, Nedospasov SA. Novel lymphotoxin alpha (LTalpha) knockout mice with unperturbed tumor necrosis factor expression: reassessing LTalpha biological functions. Mol Cell Biol 2006,26:4214−4225.

49. Junt T, Tumanov AV, Harris N, Heikenwalder M, Zeller «N, Kuprash DV, Aguzzi A, Ludewig B, Nedospasov SA, Zinkernagel RM. Expression of lymphotoxin beta governs immunity at two distinct levels. Eur J Immunol. 2006, 36:2061;2075.

50. Grivennikov SI, Kuprash DV, Liu Z-G, Nedospasov SA. Intracellular signals and events activated by cytokines of the TNF superfamily: from simple paradigms to complex mechanisms. International Review of Cytology, 2006, in press.

Главы в книгах и монографиях:

51. Nedospasov SA, Shakhov AN, Kuprash DV, Udalova IA, Azizov MM, Seregina TM, Mekshenkov MI, Turetskaya RL, Genes encoding tumor necrosis factors: genomic organization, polymorphism, and expression. In: Haematology and Blood Transfusion v.35, pp 175−184, R. Neth et al (Eds.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992.

52. Kuprash DV, Turetskaya RL, Boldin MP, Udalova IA, Kistanova E, Smirnova J, Nedospasov SA. Structure and regulation of tumor necrosis factor genes at genomic loci. In: Fiers W, Buurman WA, eds. Tumor necrosis factor and related cytokines: molecular and cellular biology and clinical relevance. Karger: Basel, 1993:19−26.

53. Nedospasov SA, Grivennikov SI, Kuprash DV, Physiologic roles of members of the TNF and TNF receptor families as revealed by knockout models. In: «Contemporary immunology: Cytokine Knockouts» 2nd edition, Giamila Fantuzzi, Ed. 2003, Humana Press, Inc., Totowa, NJ. PP 439−460.

54. Недоспасов CA, Купраш ДВ. Цитокияы, их рецепторы и передача внутриклеточных сигналов. В «Канцерогенез» под ред. Д. Г. Заридее, изд-во «Медицина» (г.Москва), 2004 г. Стр. 158−168.

Избранные тезисы конференций:

55. Nedospasov SA, Pokholok DK, TuretskayaRL, Alimzhanov MB, Kozlov SV, Novobrantseva TI, Osipovich OA, Maroulakou IG, Green JE, Kuprash DV. Mouse LT-beta gene: cloning, expression and comparison to human LT-beta. Eur Cytokine Netw (1994) 5:94.

56. Pokholok DK, Turetskaya RL, Kuprash DV, Osipovich OA, Biragyn A, Conlon K, Taub D, Nedospasov SA. Transcription of LT-beta gene in primary T cells andT cell lines. Eur Cytokine Netw (1994)5:152.

57.Udalova IA, Kuprash DV, Turetskaya RL, Rice NR, Nedospasov SA. Analysis of regulatory elements of human TNF gene in ANA-1 cells. Eur Cytokine Netw (1994)5:158.

58. Alimzhanov MB, Kuprash DV, Tarakhovsky A, Rajewsky K, Nedospasov SA, PfefferK, Initial characterization of LT-alpha/LT-beta double deficient mice. Eur Cytokine Netw (1996) 7:228.

59.Tumanov AV, Kuprash DV, Nedospasov SA, Turetskaya RL. Chromatin structure oTTNT/LT locus. Search tor new regulatory elements. J Interferon Cytokine Res (1998) 18: A-33.

•.