Идентификация и изучение функциональных особенностей новой теломеразы дрожжей

2.1. Каталитическая субъединица теломеразы Н. polymorpha 51.

2.1.1. Идентификация каталитической субъединицы теломеразы Н. polymorpha (hpTERT) 51.

2.1.2. Разработка метода выделения белка hpTERT, пригодного для структурных и функциональных исследований 51.

2.1.3. Каталитическая субъединица теломеразы Н. polymorpha, экспрессированная в Е. coli, обладает ограниченной обратно-транскриптазной активностью в отсутствии теломеразной РНК 55.

2.1.4. Димеризация N-концевого домена hpTERT и белка Est3 дрожжей S. cerevisiae 57.

2.2. Теломераза Н. polymorpha 61.

2.2.1. Детекция теломеразной активности в клетках Н polymorpha 61.

2.2.2. Характеристики теломеразы Н. polymorpha 64.

2.2.2.1. Способность использовать олигонуклеотиды разной длины 64.

2.2.2.2. Процессивность 64.

2.2.2.3. Влияние температуры на теломеразную активность 66.

2.3. Теломеразная РНК Н. polymorpha 67.

2.3.1. Выявление кандидатов на роль теломеразной РНК биоинформатическими методами 67.

2.3.2. Выявление кандидатов на роль теломеразной РНК биохимическими методами 68.

2.3.3. Транскрипция гена — кандидата на роль теломеразной РНК в клетке 70.

2.3.4. Нокаут гена hp TER приводит к фенотипу укорачивающихся теломер 73.

2.3.5. Предсказание вторичной структуры гена hp TER 76.

2.3.6. Мутационный анализ матричного участка теломеразной РНК Н. polymorpha 82.

2.4. Теломераза Н. polymorpha использует дополнительный (нетеломерный) нуклеотид А170 с 5' конца матричного участка в реакции обратной транскрипции in vitro 83.

2.5.

Заключение

.

3. Материалы и методы 94.

3.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы 94.

3.2. Методики, использованные в работе 97.

3.2.1. Определение концентрации ДНК в растворе 97.

3.2.2. Клонирование гена hpTERT в вектор pUC19 из генома Н. polymorpha 98.

3.2.3. Клонирование гена hpTERT в различные экспрессионные системы 98.

3.2.4. Выделение и очистка рекомбинантного hpTERT 99.

3.2.5. Проверка функциональности очищенного hpTERT в системе in vitro 100.

3.2.6. Клонирование N-домена hpTERT в вектор рЕТЗОаТЕУ 100.

3.2.7. Получение поликлональных антител против белка hpTERT 100.

3.2.7.1. Выработка иммунного ответа у кролика 100.

3.2.7.2. Проверка специфичности и эффективности связывания антител с целевым белком методом Вестери-блот 101.

3.2.8. Выделение теломеразы из клеток Н. polymorpha 101.

3.2.8.1. Наращивание клеток и получение S100 экстракта 101.

3.2.8.2. Определение суммарной концентрации белка в экстракте с помощью измерения оптической плотности при 235 и 280 нм 103.

3.2.8.3. Хроматография 103.

3.2.9. Детекция теломеразной активности в системе in vitro 103.

3.2.10. Выделение геномной ДНК Н. polymorpha 104.

3.2.11. Клонирование области генома Н. polymorpha, содержащей ген hpTER в вектор pUC 19hpTER 105.

3.2.12. Клонирование гена hpTER в шаттл вектор рКАМ556 105.

3.2.13. Мутагенез 106.

3.2.14. Нозери-блот анализ 106.

3.2.15. Трансформация дрожжей Н. polymorpha 107.

3.2.16. Анализ фенотипа полученных штаммов методом разбавлений 108.

3.2.17. Анализ фенотипа полученных штаммов методом Саузерн блот 109.

3.2.17.1. Перенос ДНК на нитроцеллюлозную мембрану 109.

3.2.17.2. Приготовление зондов 109.

3.2.17.3. Гибридизация мембраны с радиоактивно меченным зондом 109 4. Выводы 111.

Список литературы

112.

Список сокращений.

БСА бычий сывороточный альбумин кДа Килодальтон.

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота.

ДТТ 1,4-дитио-0Ь-треитол.

DEAEдиэтиламиноэтил-сефароза сефароза.

DEAEтеломераза, выделенная с помощью хроматографии на фракция ДЭАЭ-сефарозе н.о. нуклеотидных остатков п.о. пар оснований.

ПААГ Полиакриламидный гель.

ПМСФ фенилметилсульфонилфторид.

ПЦР полимеразная цепная реакция.

ОТ-ПЦР обратная транскрипция с последующей ПЦР.

РНК рибонуклеиновая кислота мяРНК малая ядерная РНК мяоРНК малая ядрышковая РНК.

ТЕМЕД N, N, N', N! -тетраметилэтилендиамид.

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия.

TER Теломеразная РНК.

TERT Теломеразная обратная транскриптаза.

Tris трис (гидроксиметил)аминометан.

SDS додецилсульфат натрия.

TMG триметилгуанозиновый кэп.

Теломеры — это специализированные ДНК-белковые структуры, локализованные на концах хромосом эукариотических организмових основная функция состоит в поддержании стабильности генома [1]. ДНК теломер состоит из повторяющихся последовательностей (теломерных повторов). Классический механизм репликации не в состоянии обеспечить синтез конца хромосомы, это приводит к укорочению теломер при каждом раунде деления клетки, дестабилизации генома и сенессенсу. Для предотвращения этих процессов клетка использует различные механизмы, важнейшим из которых является активация теломеразы. Данный фермент представляет сложный РНК-белковый комплекс. Основные компоненты теломеразы — теломеразная каталитическая субъединица (теломеразная обратная транскриптаза, ТЕЯТ) и теломеразная РНК (ТЯ), в составе которой присутствует небольшой матричный участок, по которому и осуществляется синтез теломерного повтора на 3' конце хромосомы [2].

Исследования в области биогенеза теломер позволяют предположить, что отсутствие или низкая активность теломеразы в соматических клетках — одна из причин старения организма [3]. Мутации в теломеразной РНК вызывают дискератоз, а также ассоциированы с некоторыми случаями апластичной анемии, миелодисплазией и диффузным интерстициальным пневмофиброзом [4,5]. Было показано, что теломераза достоверно активна в 85% опухолей, а активация теломеразы является одним из первых шагов на пути трансформации клетки в злокачественную, поэтому теломеразный комплекс является заманчивой мишенью для создания препаратов в области противоопухолевой терапии [6]. Изучение работы теломеразы и закономерностей регуляции фермента позволит понять механизм развития многих болезней и разработать новые подходы для их лечения.

1. Обзор литературы. Теломеразная РНК: структура, функции и биогенез.

выводы.

1. Идентифицированы гены каталитической субъединицы теломеразы и теломеразной РНК в дрожжах Н. polymorpha.

2. Разработан метод получения каталитической субъединицы теломеразы Н. polymorpha, пригодной для структурных и функциональных исследований. Показано, что в отсутствие полноразмерной теломеразной РНК белок обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью.

3. N-концевой домен каталитической субъединицы теломеразы Н. polymorpha и белок Est3 S. cerevisiae димеризуются in vitro.

4. Охарактеризована теломеразная активность Н. polymorpha. Теломераза Н. polymorpha использует дополнительный нуклеотид (А 170) с 5' конца матричного участка в реакции обратной транскрипции in vitro, тогда как in vivo результат обратной транскрипции А170 не детектируется.

2.5.

Заключение

.

Для того чтобы идентифицировать теломеразную PIIK И. polymorpha мы использовали сочетание биохимического и б и оинфор магического подходов. Нокаут гена-кандидата на роль теломеразной РНК (hpTER) приводил к предсказанному фенотипу укорачивающихся тело мер. тогда как трансфскция плазмиды. несущей hpTER ген обеспечивала жизнеспособность клеток и восстанавливала теломеразную активность. Мутации в участке гена bpTER. комплементарном теломере приводили к синтезу теломеразой альтернативной последовательности. В совокупности результаты эксперимента подтверждают функционирование гена hpTER в качестве теломеразной РНК Н, polymorpha.

Мы показали, что длина исходного транскрипта составляет 824 нуклеотида. Это достаточно скромный размер по сравнению с другими дрожжевыми теломеразными РНК, длина которых больше 1000 и достигает 1817 нуклеотидов [701. Первичная структура гена iipTER не может быть выравнена с генами теломеразных РНК других дрожжей, что объясняется низкой гомологией данного гена. Тем не менее, можно проследить элементы структуры высшего порядка, характерные для теломеразных РНК: псевдоузел, Estl — связывающую шпильку, TWJ элемент (three-way-junction или трехсторонний узел). Удивительно, но нам не удалось идентифицировать сайт связывания Sm белков, — один из наиболее консервативных элементов первичной структуры теломеразной РНК в дрожжах.

Матричный участок теломеразной РНК Н. polymorpha включает 17 нуклеотидов, полностью комплементарных теломерной последовательности. Мы показали, что нуклеотиды со 178 по 171 используются для синтеза ДНК. В эксперименте с HD1 олигонуклеотидом мы наблюдали обратную транскрипцию 181−179 нуклеотидов, однако эффективность этого процесса значительно ниже. Таким образом, участок в 9 нуклеотидов (181−177) потенциально может служить для начального позиционирования праймера. Известно, что эта область отделена псевдоузлом от остальной молекулы РНК, обычно ее длина не превышает половины теломерного повтора. Размер участка, используемого для отжига хромосомы, играет важную роль в работе теломеразы. В отличие от теломеразной РНК мыши, где длина области позиционирования теломеры составляет 2 нуклеотида, человеческая теломеразная РНК (5 нуклеотидов для отжига праймера) процессивна in vitro [12]. Так же, как и большинство других дрожжевых теломераз, теломераза Н. polymorpha не процессивна in vitro. Возможно, что такой необычно длинный участок отжига праймера обеспечивает гомогенность теломер Н. polymorpha, не характерную для других дрожжей. В данной работе мы проанализировали последовательности теломер Н. polymorpha, полученные из данных по секвенированию штамма DL1−1. Мы детектировали незначительную гетерогенность, которая может быть выражена паттерном 5'-GGGTGGCG3.5T-3', в то время как область матричного участка теломеразной РНК, ответственная за вариабельное количество гуанинов, содержит 4 цитозина. В соответствии с литературными данными этот тип гетерогенности объясняется проскальзыванием фермента по матрице и наблюдается в случае, когда матрица содержит несколько одинаковых нуклеотидов подряд [131].

Мы обнаружили различие в работе теломеразы in vitro и in vivo. Теломераза, выделенная in vitro, использует для синтеза нуклеотид Al 70, расположенный непосредственно с 5' конца от матричного участка, и эффективность этого процесса очень высока. Последовательность нуклеотидов, получаемая в результате работы теломеразы in vitro, выглядит как 5'-GGGTGGCGT-3', в то время как in vivo за паттерном 5'-GGGTGGCG-3' всегда следует «G». В теломеразе процесс обратной транскрипции ограничен с 5' конца РНК-шпилькой (TBE, template boundary element — ограничивающий элемент). Мутации, нарушающие структуру этого элемента, могут привести к обратной транскрипции нетеломерной последовательности за матричным участком теломеразной РНК, нарушениям в использовании РНК матрицы и изменениям в процессивности теломеразы [132−133]. Известно, что С-домен теломеразной обратной транскриптазы стабилизирует матричный граничный элемент, непосредственно взаимодействуя с РНК-шпилькой [133]. Делеции в С-концевом домене hTERT приводили к синтезу последовательности за пределами матричного участка. Эти данные позволяют предположить, что включение нетеломерного нуклеотида теломеразой Н. polymorpha in vitro может быть связано с положением, структурой граничного элемента, либо с его способностью связывать hpTERT. Данное предположение подтверждается анализом мутанта А170С, в котором эффективность присоединения последнего нуклеотида была значительно снижена, а предполагаемая вторичная структура граничного элемента дополнительно стабилизируется взаимодействием С170-G203.

Мы не зафиксировали ни одного случая присутствия тимина после паттерна 5'-GGGTGGCG-3' в теломерах Н. polymorpha, однако, удлинение теломер в штамме, мутантном по теломеразной РНК в позиции А170С позволяет говорить о важности присоединения теломеразой нетеломерного нуклеотида in vivo. Невозможность зафиксировать тимин в искомой позиции может являться следствием действия нуклеазной активности, которая ассоциирована с теломеразой [134]. В таком случае, нуклеазная активность может обеспечивать корректирующую активность и удалять нетеломерный нуклеотид, ее эффективность может быть нарушена в процессе выделения теломеразы. Другое возможное объяснение заключается в том, что включение тимина — это особенность именно непроцессивной формы теломеразы Н. polymorpha. Находясь в процессивном состоянии, теломераза реплицирует теломерную ДНК без включения нетеломерного нуклеотида. Но для того чтобы диссоциировать с теломеры, теломераза переключается в непроцессивное состояние, возможно, что этот процесс сопряжен со структурными изменениями комплекса. В таком случае обратная транскрипция аденина 170 будет происходить только на самом конце теломеры, а детекция этого события может быть затруднена вследствие клеточных процессов или в результате выделения геномной ДНК. В рамках этой гипотезы можно предположить, что добавление нетеломерного нуклеотида служит маркером теломеры, которая только что подверглась удлинению ферментом. В таком случае, теломераза не сможет использовать в качестве субстрата олигонуклеотид, заканчивающийся нетеломерной последовательностью 5'-GGGTGGCGT-3', что мы и наблюдали в эксперименте in vitro.

3. Материалы и методы.

3.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы.

В работе были использованы следующие реактивы и препараты:

— NaCl, NaOAc, Na2HP04, КН2Р04, KCl, КОАс, MgCl2, Mg (OAc)2, СаС12, MnCl2, Tris, NaOH, КОН, ЭДТА, H3B03, HEPES, персульфат аммония, бромфеноловый синий, кеиленцианол, бромистый этидий, глицерин фирм Merk, Германия и Helicon, Россия;

— SDS, акриламид, ]Ч, 1Ч'-метиленбисакриамид, 1,4-дитиотреитол (DTT), Кумасси R-250 фирмы Serva, Германия;

— Д-глюкоза, 2-меркаптоэтанол, К, Ы, К',>Г-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), РНазин, насыщенный ТЕ фенол, рибонуклеаза, А фирмы Helicon, Россия.

— уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изоамиловый спирт, ацетон фирмы Химмед, Россия;

— водонасыщенный фенол, Triton Х-100 фирмы Roth, Германия;

— этанол фирмы Ферейн, Россия;

— аминокислоты: лейцин, триптофан, гистидин, треонин, аргинин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, тирозин, валинсахара: глюкоза, галактоза, арабиноза, сахароза, LiOAc, БСА, ДТТ, ПМСФ, ДНК спермы лосося, спермидин, формальдегид, формамид, 2-меркаптоэтанол, ампициллин, генетицин, протеиназа К, РНКаза, А фирмы Sigma, Германия;

— полиэтиленгликоль 4000, Tween 20 фирмы Fluka, Германия;

— бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, YNB (Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids), мочевина фирмы Difco, США;

— легкоплавкая агароза для электрофореза фирмы Life Technologies, Шотландия;

— [a-32P]dGTP, [у-32Р]АТР фирмы Amersham Biosciences Part of GE Healthcare, США;

— олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы фирмой Синтол и ДНК синтез, Россия;

— Литиказа фирмы Seikagatu, Япония;

— стрептавидин-сефароза (Streptavidin Sepharose High Performance) фирмы GE Healthcare, США;

— диэтиламиноэтил целлюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) (DE-52) фирмы Whatman BioSystems Ltd, США;

— Ni-NTA агароза, набор реагентов для выделения плазмидной ДНК и набор реагентов для выделения ДНК из агарозного геля фирмы Qiagen, Еермания;

— мембрана PVDF, ECL Western Blotting Detection Kit, фирмы Amersham-Pharmacia Biotech, США;

— набор ингибиторов протеаз в таблетках фирмы Roche, Еермания;

— фильтровальная бумага Whatman ЗММ фирмы Whatman Biomerta, Еермания;

— 20 мл центриконы фирмы Sartorius, США;

— ДНКаза I (DNase I, RNase-free), Т4 ДНК-лигаза, Taq-полимераза, полинуклеотид киназа Т4, эндонуклеазы рестрикции и фирменные буферные растворы к ним фирм MBI Fermentas, Литва и Roche, Франция;

— штамм Н. polymorphe DL 1−1 был любезно предоставлен Михаилом Агафоновым (Москва);

— плазмида pET30aTEV была любезно предоставлена Даниелой Родэс, Кэмридж, Великобритания.