Гепатопротекторная активность милиацина при метотрексат-индуцированном повреждении печени (экспериментальное исследование)

Структурно-функциональные поражения печени, наряду с нефротоксич-ностыо и угнетением костно-мозгового кроветворения, являются наиболее распространенным и тяжелым осложнением противоопухолевой терапии [45- 58- 131- 241]. Данное обстоятельство служит серьезным препятствием к достижению должного лечебного эффекта, поскольку определяет необходимость увеличения интервалов между курсами химиотерапии и снижения дозировки препаратов, вплоть до их полной отмены. В связи с этим изучение механизмов медикаментозных поражений печени и разработка на этой основе подходов к предупреждению и (или) ограничению таких поражений является одной из актуальных задач, имеющих отчетливое прикладное значение [40- 72- 126- 227- 246].

Это положение в полной мере относится и к метотрексату, химиотера-певтический эффект которого обусловлен его антиметаболической активностью, тогда как гепатотоксичность цитостатика связывают с интенсификацией процессов свободно-радикального окисления [218- 219- 222]. Исходя из этих представлений, очевидно, что протекция гепатотоксического действия метотрексата может быть эффективной на основе использования средств, обладающих антиоксидантной активностью. В настоящее время арсенал таких средств достаточно широк и представлен как синтетическими, так и природными антиоксидантами [55]. Среди последних все более важное значение преобретают препараты растительного происхождения [7], доступность, безопасность и биологическая активность которых определили их широкое использование в медицинской практике, включая протекцию повреждений печени в условиях применения антибластомных лекарственных средств [39- 52].

Интерес к дальнейшему поиску гепатопротекторов не ослабевает, что связано с необходимостью повышения избирательности защиты печени от ксенобиотиков, оптимизации репаративно-регенераторных процессов в поврежденном органе и сокращения сроков восстановления его функциональной активности.

В последние годы в рамках решения этой проблемы внимание исследователей привлекают тритерпеноиды и их производные, демонстрирующие значительную антиоксидантную активность [63- 123- 151- 193- 194- 247- 248] и способность ограничивать повреждения печени при действии различных токсических факторов [31- 59- 98- 105- 161- 192], в том числе — антибластом-ных лекарственных препаратов [36- 106- 148]. К числу этих веществ относится и милиацин — пентациклический тритерпеноид растительного происхождения, защищающий гепатоциты при отравлении СС14 [99] и проявляющий мембранопротекторную активность [128- 141]. Вместе с тем вопрос о защитном влиянии милиацина в отношении гепатотоксичности метотрексата оставался открытым.

Актуальность данной работы определяется тем, что до начала ее выполнения не была проведена оценка защитного эффекта милиацина при метот-рексат — индуцированном повреждении печенине было установлено влияние тритерпеноида на фармакокинетику метотрексата и его противоопухолевую активностьне был определен механизм протективного действия милиацина, связанный с его влиянием на интенсивность окислительного стресса и экспрессию генов, контролирующих продукцию прои антиоксидантных факторов. Отсутствие ясности в этих вопросах не позволяло оценить перспективы использования милиацина в качестве гепатопротектора, что с учетом его доступности, крайне низкой токсичности (ЬО50 > 1000 мг/кг) и отсутствия побочных эффектов в широком диапазоне доз [144] могло бы иметь важное прикладное значение.

Цель и задачи исследования

.

Целью настоящей работы являлась экспериментальная оценка милиаци-на как гепатопротектора при токсическом поражении печени метотрексатом.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить влияние милиацина на структурно-функциональную реорганизацию печени и динамику восстановления органных нарушений у мышей, подвергшихся воздействию метотрексата.

2. Провести сравнительный анализ эффективности защитного действия милиацина и официального гепатопротектора — карсила.

3. Определить особенности фармакокинетики метотрексата в условиях его сочетанного применения с милиацином.

4. Оценить влияние милиацина на противоопухолевый эффект метотрексата (на модели эпидермоидной карциномы легких Льюис).

5. Установить механизм протективного действия милиацина путем изучения его влияния на интенсивность оксидативного стресса и экспрессию генов {сур 2е1 и glured), контролирующих редокс-баланс клетки, в условиях применения метотрексата.

Научная новизна исследования.

Впервые определено протективное влияние милиацина в отношении ге-патотоксичности метотрексата. В экспериментах на мышах (СВА х G^B^Fi установлена способность тритерпеноида ограничивать метотрексат индуцированные дистрофические и некротические изменения гепатоцитов, ослаблять гиперферментемию (АлАТ, АсАТ, у-ГТ), снижать частоту выявления и выраженность нарушений пигментного обмена, отменять депрессию кли-ренсной функции печеночных макрофагов. Показан позитивный эффект милиацина на процесс восстановления структурных повреждений печени и нормализацию показателей пигментного обмена.

Установлено, что гепатопротекторная активность милиацииа не связана с нарушением фармакокинетики метотрексата и с ослаблением его антибла-стомной активности. Впервые показана способность милиацина повышать терапевтическую эффективность метотрексата по показателям торможения роста опухоли и увеличения продолжительности жизни животных с перевиваемой карциномой Лыоиса. Впервые определен механизм протективного влияния милиацина, реализуемый на уровне регуляции экспрессии генов сур 2е1 и фи’ей.

Теоретическое значение работы Полученные данные расширяют представления о диапазоне протективного влияния милиацина и раскрывают новые аспекты его биологического действия. Отсутствие влияния милиацина на фармакокинетику метотрексата исключает возможность рассмотрения данного механизма в реализации протективного действия тритерпеноида. Сведения о способности милиацина отменять метотрексат — индуцированную экспрессию гена прооксидантного белка сур 2е1 и восстанавливать экспрессию гена, кодирующего один из ведущих факторов антиоксидантной защиты glured, существенно углубляют знания о механизмах реализации антиоксидантного эффекта тритерпеноида.

Практическое значение работы Результаты работы определяют новые возможности ограничения побочного действия цитостатической терапии и повышения эффективности реабилитации больных после ее проведения на основе использования милиацина или его аналогов. Установленные в работе способность милиацина повышать противоопухолевую активность метотрекста и отсутствие влияния тритерпеноида на фармакокинетику химиопрепарата позволяют рассматривать три-терпеноид в качестве эффективного гепатопротектора. По материалам работы получен патент на изобретение РФ № 2 411 947 «Средство, повышающее противоопухолевый эффект метотрексата».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Тритерпеноид растительного происхождения милиацин оказывает защитный эффект при метотрексат — индуцированном поражении печени, предотвращая падение массы органа, минимизируя повреждения гепатоцитов, снижая частоту выявления и выраженность нарушений пигментного обмена, отменяя депрессию клиренсной функции печеночных макрофагов и ускоряя восстановление структуры органа.

2. Протективное влияние милиацина не связано с нарушением фармакокине-тики метотрексата и со снижением его противоопухолевой активности.

3. Милиацин повышает терапевтическую эффективность метотрексата по показателям торможения роста опухоли и продолжительности жизни животных.

4. Механизм протективного влияния милиацина обусловлен его способностью предотвращать окислительный стресс, индуцируемый метотрексатом, и нормализовать экспрессию генов сур 2е1 и %1игес{ в печени, контролирующих редокс — баланс клетки.

Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов, Оренбург, 2005, 2011; региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии», Оренбург, 2006; V и IX конференциях иммунологов Урала, Оренбург, 2006; Челябинск, 2011; IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Нижний Новгород, 2010; III Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург, 2011; XI Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2011.

Декларация личного участия автора Автором определены цель, задачи и объем исследования, сформирована и использована методическая база проведения запланированных экспериментов, самостоятельно проведен анализ литературы по профилю диссертации. Определяющим является вклад автора в выполнении всех разделов работы, включая экспериментальную реализацию поставленных задач (85%), статистическую обработку и анализ полученных результатов (100%), а также подготовку научных публикаций, в которых доля личного участия автора составляет не менее 80%.

Материалы диссертации обобщены в 14 научных работах, в том числе в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых научных журналах. Получен патент на изобретение РФ № 2 411 947 «Средство, повышающее противоопухолевый эффект метотрексата».

121 Выводы.

1. Однократное внутрибрюшинное введение метотрексата (10 мг/кг) мышам (СВАхС57В16)Р1 приводит к развитию токсического гепатита, проявляющегося снижением массы органа, формированием в нем дистрофических и некротических процессов, гиперферментемии (АлАТ, АсАТ, у-ГТ) и нарушением пигментного обмена. Токсичность метотрексата в отношении клеток Купфера проявлялась угнетением их клиренсной функции.

2. Динамика токсического поражения печени под влиянием метотрексата характеризуется постепенным нарастанием явлений дистрофии и некроза гепатоцитов с достижением их максимальной выраженности к 14 суткам после введения цитостатика. Регенераторные процессы в органе в виде возрастания числа двуядерных клеток и увеличения плоидности ядер регистрируются к концу 3 недели наблюдения. При этом нормализация активности ферментов (АлАТ, АсАТ) к указанному сроку отсутствует.

3. Милиацин в разовой дозе 2 мг/кг при трехкратном последовательном (на протяжении 3 дней) внутрибрюшинном введении после применении метотрексата ослабляет гепатотоксический эффект, предотвращая падение массы органа, минимизируя морфологические показатели повреждения гепатоцитов, ослабляя гиперферментемию, снижая частоту выявления и выраженность нарушений пигментного обмена, отменяя депрессию клиренсной функции печеночных макрофагов и обеспечивая восстановление структуры печени к концу 3 недели наблюдения.

4. Гепатопротекторная эффективность милиацина (2 мг/кг) превосходит гепатопротекторную эффективность карсила (6 мг/кг) по ограничению гиперферментемии (АлАТ, АсАТ) и соответствует эффективности карсила (б мг/кг) по ограничению нарушений пигментного обмена.

5. Протективное влияние милиацина не сопровождается нарушением скорости всасывания и биораспределения метотрексата в сыворотке крови, ткани печени и селезенки и, таким образом, не связано с нарушением фарма-кокинетики химиопрепарата.

6. Протективное влияние милиацина не сопровождается снижением противоопухолевой активности метотрексата. Милиацин повышает терапевтическую эффективность метотрексата: их сочетанное применение вызывает высокое торможение роста LLC в течение 12 дней после введения цитостатика (ТРО=91−84%), обеспечивает сохранение статистически значимого ТРО в течение длительного срока наблюдения (на 19 сутки ТРС)=60%) и увеличивает продолжительность жизни мышей с LLC на 36%, в то время как метотрексат в монотерапии — на 9%.

7. Механизм протективного влияния милиацина связан с его способностью предотвращать окислительный стресс, индуцированный метотрексатом, и нормализовать экспрессию генов, кодирующих изоформу сур 2е1 цитохро-ма Р — 450 и глутатионредуктазу в печени.

Заключение

.

Главное положение, вытекающее из проведенных исследований, заключается в том, что тритерпеноид растительного происхождения милиацин снижает гепатотоксичность метотрексата, не влияя при этом на фармакоки-нетику последнего и его антибластомную активность. Изучение механизма такого протективного действия милиацина позволило установить, что в его основе лежит ограничение тритерпеноидом выраженности окислительного стресса, индуцированного метотрексатом, который рассматривается как ведущее звено повреждающего действия цитостатика на печень [219- 222].

Как известно, окислительный стресс обусловливает нарушение редоксбаланса клетки, определяемого как соотношение ее прооксидантных и анти-оксидантных систем [56]. Прооксидантные системы (прооксиданты) — системы генерации активных форм кислорода (АФК), представляющих собой продукты неполного восстановления его молекул: свободные радикалы, перекиси и другие метаболиты, обладающие высокой реакционной способностью. Благодаря этой способности АФК выполняют ряд важных физиологических функций [113], включая синтез биологически активных веществ (лейкотрие-ны, простагландины), цитотоксичность в отношении патогенов и опухолевых клеток, репрограммирование процессов клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптоза. В настоящее время в клетках млекопитающих установлено более 20 т.н. «редокс-чувствительных» транскрипционных факторов [134- 224], отвечающих на изменение редокс-баланса, в том числе NF-kB, АР-1, р-53, Nrf, служащих ключевыми элементами жизнеобеспечения и клеточной функции.

Необходимость АФК для жизнедеятельности клеток связывают также с образованием при их участии электронно-возбужденных состояний биомолекул — триггеров всех последующих биоэнергетических реакций. Колебательный режим таких реакций способствует ритмичному протеканию биохимических процессов на более высоком уровне [118].

Наконец, АФК обеспечивают обновление и функциональную лабильность мембран клеток и субклеточных структур, определяя такие жизненно важные процессы, как проницаемость, ионный транспорт, энергетику, синтез белка и др. Подобное обеспечение обусловлено способностью АФК инициировать активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) при взаимодействии с входящими в состав клеточных мембран полиненасыщенными жирными кислотами. Представляя собой саморазвивающуюся цепную реакцию, ПОЛ постоянно протекает в клетке, поскольку является нормальным процессом метаболизма и служит необходимым звеном её жизнедеятельности, включая адаптационные реакции. Благодаря ПОЛ, реализуемому в клеточных мембранах, меняется их липидный состав, а тем самым — активность ли-пидзависимых мембранных ферментов. Таким образом, образование АФК и инициируемое ими свободнорадикальное окисление являются естественным физиологическим процессом, постоянно протекающим в организме.

Иная ситуация складывается при избыточном уровне АФК в живой клетке, когда они могут выступать как повреждающий фактор, нарушающий структуру и функционирование внутриклеточных компонентов (липидов, белков, ДНК), что сопровождается развитием патологии [30- 50- 75- 94]. При этом деструктивная роль АФК зачастую связана не столько с их прямым действием на клеточные структуры, сколько с избыточной активацией каскада процессов свободнорадикального окисления, сопровождающихся образованием продуктов (гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот, альдегиды, кетоны), повреждающих клеточные структуры [51]. Возможность такого развития событий предполагает необходимость существования в клетке сдерживающих механизмов (антиоксидантной системы, антиоксидантов), лимитирующих образование АФК и защищающих клетку от несвоевременной и бесконтрольной активации свободнорадикальных процессов. Т. е. антиоксидант-ная система (система антиоксидантной защиты) — «многокомпонентная система, которая позволяет поддерживать интенсивность свободнорадикальных процессов на оптимальном уровне, без угрозы их резкой активации и участия в развитии различных патологических состояний» [113]. Очевидно, что атрибутивным условием функционирования такой системы также является ограничение ее избыточности, поскольку в противном случае она будет препятствовать реализации физиологической роли АФК.

Таким образом, сбалансированное (равновесное) соотношение между прооксидантами и антиоксидантами, т. е. редокс-баланс клетки имеет основополагающее значение в ее жизнедеятельности. Изменение этого баланса служит отправной точкой в развитии различных форм патологии. Такое изменение может быть достигнуто избыточным образованием АФК, дефицитом факторов антиоксидантной защиты либо путем сочетанной реализации обоих сдвигов.

Основным источником образования АФК в клетке служат ее ферментные системы: митохондриальная цитохром-С-оксидаза, НАДФН-оксидаза фагоцитов, ксантиноксидаза и микросомальные монооксигеназы [30- 125]. Поскольку ксантиноксидаза принимает непосредственное участие в биотрансформации MTX, ее роль как механизма индукции АФК под влиянием цитостатика представляется достаточно очевидной. Используя молекулярный кислород в качестве акцептора электронов, этот фермент способствует образованию супероксид-анион-радикала (02~), перекиси водорода Н202, а также (в отдельных случаях) — гидроксильного радикала (ОН'). Роль ксантиоокси-дазы в генерации АФК может также быть обусловлена способностью этого фермента повышать уровень свободного железа путем его мобилизации из ферритина печени [195].

Вместе с тем, известно, что для печени главным источником АФК и в частности, 02~, служат микросомы [170]. Однако до проведения настоящего исследования вопрос о роли микросомальных монооксигеназ в формировании окислительного стресса под влиянием MTX оставался открытым. Такое положение в значительной степени было обусловлено хорошо известным фактом о непричастности системы цитохрома Р450 к биотрансформации MTX, а также о незначительной способности последнего модулировать экспрессию и активность различных изоформ этой системы в культуре гепато-цитов. Установленное в нашей работе стимулирующее влияние MTX на экспрессию гена важнейшей прооксидантной Цх Р450-зависимой монооксигена-зы — сур 2е1с большой вероятностью может свидетельствовать о ее вовлеченности в механизм формирования окислительного стресса под действием MTX. Есть основание полагать, что такая активация генной экспрессии носит опосредованный характер и сопряжена с изменением редокс-состояния клетки как следствия генерации АФК при участии ксантиноксидазы, и (или) с прямым действием АФК на фактор транскрипции соответствующего гена.

МТХ-опосредованная индукция прооксидантных систем (ксантиноксидазы и сур 2е1) способна приводить к избыточной генерации АФК и активации свободнорадикального окисления, регистрируемого в наших исследованиях в виде повышения содержания в ткани печени ТБК-реагирующих продуктов на 4 сутки после введения цитостатика. Негативные последствия такой активации в соответствии с существующими представлениями [173- 204- 222- 250] реализуются через окисление тиоловых (сульфгидрильных) групп белков, накопление продуктов липопероксидации и уменьшение стабильности липидного бислоя мембран. В свою очередь окисленные белки легко подвергаются деградации под влиянием протеаз, а окисление фосфолипидов увеличивает их подверженность гидролизу фосфолипазой А2 в результате возрастания сродства к ферменту. Таким образом формируется определенная последовательность включения механизмов повреждения биомембран, при которой активация ПОЛ обеспечивает действие фосфолипаз, после чего нарушения в мембранном бислое происходят уже независимо от уровня ПОЛ и даже при его подавлении [113].

Указанные нарушения определяют утрату функциональной активности клеточных белков (ферментов, встроенных в мембрану), формирование энергетического дефицита, избыточное накопление в клетке ионов Са2+, а в конечном счете — электрический пробой мембраны, цитолиз и гибель клетки. В наших экспериментах показателем деструкции мембран гепатоцитов служило увеличение активности в сыворотке крови индикаторных ферментов (АлАТ, АсАТ, уГТ) этого процесса, а также билирубинурия и уробилино-генурия. Повреждение мембран под действием MTX затрагивало как сарколемму, так и, по-видимому, мембраны внутриклеточных структур: эндоплаз-матического ретикулума, митахондрий и микросом. На это указывает возрастание активности АсАТ (являющейся не только цитозольным, но и митохон-дриальным ферментом), обнаружение в моче прямого билирубина (образующегося в гладком эндоплазматическом ретикулуме) и уробилиногена (как проявление несостоятельности микросомального окисления мезобилиноге-на). Выявленные нарушения носили не только выраженный, но и продолжительный характер, о чем свидетельствует сохранение деструктивных изменений в органе и гиперферментемии на протяжении трех недель наблюдения.

В контексте обсуждаемой проблемы важно отметить, что липиды печени легко окисляются и имеют более высокую чувствительность к АФК-индуцированному окислению по сравнению с другими органами [113], хотя именно печень является эндогенном депо витамина Е и, следовательно, должна обладать наибольшей защитой от свободнорадикального окисления. Парадоксальность данной ситуации обусловлена тем, что гепатоциты в отличие от других клеток, хотя и запасают витамин Е в микросомальных мемеб-ранах, не используют его как антиоксидант [214], а поставляют через кровоток в другие органы для предупреждения их АФК-опосредованного повреждения [256]. Такая избирательно высокая чувствительность паренхиматозных клеток печени к липопероксидации по всей видимости определяет возможность более раннего (на 4 сутки) выявления их структурно-функциональных нарушений по сравнению с клетками Купфера, депрессия функциональной активности (поглотительной способности) которых выявлялась нами в более поздний период (на 10−14 сутки) после введения MTX. Не исключено участие в этой депрессии свободных жирных кислот, концентрация которых в условиях катаболизма глицерофосфолипидов должна закономерно возрастать. Правомерность такой оценки обоснована данными о способности жирных кислот не только подавлять хемотаксис и фагоцитарную активность макрофагов [183], но и индуцировать их гибель [176]. При этом строгого соответствия между цитотоксичностыо жирных кислот и числом двойных связей в их молекулах не обнаружено.

Что касается последствий нарушения функциональной активности печеночных макрофагов, то, как отмечалось выше (глава 3), эти нарушения могли иметь непосредственное отношение к замедлению репаративных процессов в органе, в регуляции которых клеткам Купфера отводится центральная роль [81]. Эта роль способна реализоваться в нескольких направлениях, включая продукцию и секрецию различных факторов роста: ТФР Р (трансформирующий фактор роста (3) и ИФР-I (инсулиноподобный фактор роста I) — нейтральных протеиназ (эластазы, коллагеназы), отменяющих эффект контактного торможения и повышающих чувствительность клеток-мишеней к факторам ростафибронектина — центральной адаптерной молекулы самосборки тканей [87]. С репаративной функцией печеночных макрофагов связана их способность к рекрутированию в орган и к активации лимфоцитов, оказывающих стимулирующее воздействие на пролиферацию паренхиматозных клеток печени, в том числе при действии гепатотропных токсинов [15].

Патогенез органных нарушений при избыточной активации ПОЛ мог быть связан и с запуском апоптотического каскада с участием его «митохон-дриального» механизма. Основу этого процесса составляет последовательное развитие внутриклеточных событий, включающих окислительную модификацию кардиолипина под действием продуктов ПОЛ [78], приводящую к утрате его молекулярного взаимодействия с цитохромом Свыход цитохрома С в цитозоль вследствие повышения проницаемости внешней мембраны митохондрий при участии проапоптотических белков (Вах, Bad, Bid и др.) — вовлечение цитохорома С в формирование апоптосомы — APAF-1 (апоптотический протеазо-активирующий фактор), активацию каспазы 9 и трансдукцию сигнала на терминальную каспазу 3. Не исключается также развитие апоптоза и при участии Fas/APO-1 механизма, о чем свидетельствует высокая чувствительность гепатоцитов к CD 95-опосредованному сигналу [16]. При этом существенно, что апоптоз клеток печени в ответ на воздействие различных факторов, включая мембраноактивные соединения, не является синхронным процессом. Его продолжительность может составлять до 7 суток [77], внося свой вклад в динамику структурно-функциональных нарушений органа, достигавших своего максимума на 10 — 14 сутки после введения МТХ.

Поражение печени МТХ не носило изолированный характер и реализо-вывалось на фоне системных проявлений токсического действия цитостатика в виде снижения массы тела, редукции органов системы иммуногенеза (тимуса, селезенки), и развития анемии. Представляется, что эти нарушения могли оказывать усугубляющее действие на выраженность поражения печени, в том числе, через развитие вторичного иммунодефицита [54] и гемиче-ской гипоксии.

Как показали результаты нашего исследования, среди механизмов, индукции метотрексатом окислительного стресса и активации свободноради-кальных процессов важное место могло принадлежать способности цитостатика подавлять экспрессию гена глутатиоредуктазы (glured). Этот фермент является одним из компонентов глутатионовой антиоксидантной системы, обеспечивающей (совместно с НАДФН) поддержание в клетке должного уровня восстановленного глутатиона (GSH). Последний, будучи главным водорастворимым антиоксидантом [271], участвует в работе ряда ферментов, в том числе глутатионпероксидазы (локализована в цитозоле и матриксе митохондрий) и многофункциональных белков — глутатионтрансфераз (локализованы преимущественно в цитозоле клеток) в качестве донора протонов, переходя при этом в окисленную форму (GSSG). Коныогаты GSH с токсическими метаболитами, включая и МТХ, облегчают их MRP-1 (multidrug resistance protein — 1) — зависимый транспорт из клетки. Таким образом, в условиях ок-сидативного стресса GSH, обеспечивая инактивацию гидроперекисей и других токсических продуктов окисления путем их восстановления и глутатио-нилирования, защищает клеточные структуры и белки от повреждений [56].

Очевидно, что подавление метотрексатом экспрессии гена глутатионредукта-зы, как возможного проявления гепатотоксичности избыточного образования АФК, формирует дефицит данного фермента, способный привести к истощению внутриклеточного пула GSH и, как следствие — к ослаблению функционирования одной из важнейших внутриклеточных систем антиоксидантной защиты. Подобное развитие событий усугубляется прямым ингибирующим влиянием MTX на активность глутатионредуктазы, равно как и на активность у-глутамилцистеинсинтетазы, участвующей в клеточном синтезе самого глу-татиона [219].

Изучение влияния милиацина на гепатотоксичность MTX позволило установить что тритерпеноид обеспечивал ослабление структурных повреждений гепатоцитов, снижение выраженности гиперферментемии и нарушений пигментного обмена, а также предотвращение депрессии клиренсной функции печеночных макрофагов. Указанные сдвиги имели место на фоне ослабления и системных проявлений токсичности MTX в виде ограничения падения массы тела, гипоплазии лимфоидных органов (тимуса, селезенки) и анемии. Эти результаты могли иметь в своей основе, как минимум, два различных механизма. Во-первых, они могли являться отражением нарушения под влиянием милиацина фармакокинетики метотрексата и (или) непосредственного ингибирующего влияния тритерпеноида на биологическую активность цитостатика. В пользу этого предположения свидетельствуют данные [128- 141] о мембраностабилизирующем действии милиацина, которое могло повлиять на процессы абсорбции, биораспределения и выведения MTX из организма. Второй механизм позитивного действия милиацина мог быть связан с его ограничивающим влиянием на цитотоксичность MTX без воздействия на фармакокинетику и (или) специфическую антиметаболическую активность последнего, определяющих лечебный эффект химиопрепарата.

Как показали наши исследования, милиацин не влиял на фармакокине-тические параметры MTX, и не только не ослаблял, но, напротив, усиливал его противоопухолевую активность. Такое усиление выражалось повышением терапевтической эффективности МТХ при его совместном применении с милиацином в виде высокого торможения роста эпидермоидной карциномы Льюиса и увеличения продолжительности жизни животных. Эти результаты позволили прийти к заключению, что ограничение милиацином структурных, биохимических и функциональных нарушений, индуцируемых МТХ, демонстрирует именно протективный эффект тритерпеноида в отношении локальной (гепатопротекция) и системной токсичности цитостатика.

Оценка механизмов протективного эффекта милиацина позволила установить их связь с антиоксидантными свойствами тритерпеноида. Следует отметить, что антиоксидантная активность является одной из достаточно распространенных биологических характеристик тритерпеноидов [220- 231], которая определена у ряда из них, включая агликон глицирризина: 18р-глицирретиновую кислоту [194], каффеоловую кислоту [268], азиатскую кислоту [216], уросоловую и олеаноловую кислоты [240- 258], дипептид бету-лоновой кислоты [64] и др. Проявлением такого защитного влияния служит уменьшение степени падения внутриклеточного пула восстановленного глу-татиона и лимитирование снижения активности ферментных систем антиок-сидантной защиты: супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион-8-трансфера-зы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы [215] снижение накопления в клетке вторичных радикалов (липидных перекисей) и диеновых конъюгатов [247], уменьшение генерации и активности супероксид-анион-радикала: Ф [194- 217] и гидроксильного радикала: ОН' [193]. О потенциальной мощности антиоксидантной активности тритерпеноидов свидетельствует возможность проявления их ингибирующего действия даже в отношении АФК (Ф и Н202), индуцированных в лейкоцитах при стимуляции последних форбол-12-миристат-ацетатом [161].

Исходя из полученных в работе данных о способности милиацина восстанавливать экспрессию гена глутатионредуктазы, подавленную МТХ, нам представляется, что антиоксидантный эффект тритерпеноида мог быть связан с его активирующим воздействием на регуляторный сайт — ARE (antioxidant responsive element), под контролем которого находится функционирование этого гена. Основанием для такого предположения служат сведения об индуцирующем влиянии на ARE синтетического аналога олеановой кислотыCDDO [189- 228- 234- 235- 261]. Как известно, ARE наряду с Nf-kB и АР -1 относится к числу редокс-чувствительных элементов, но в отличие от последних, отвечающих на внешние сигналы, участвующим в поддержании внутриклеточного гомеостаза при апоптозиндуцирующих [185], канцерогенных [196] и стрессорных воздействиях. Регионы ARE выявлены в промотор-ных участках многих генов, продукты которых выполняют или непосредственно защитную роль (микросомальная гемооксигеназа, тиоредоксин, селеновая глутатионпероксидаза-2, глутатионредуктаза), или восполняют уровень расходуемых низкомолекулярных интермедиатов (цистин-глутамат-транспортная система), или обеспечивают репаративную функцию важнейших макромолекул в клетке в ситуациях с нарушением клеточного редокс-баланса. Последнее, в частности, проявляется участием системы Nrf-2 — ARE в регуляции транскрипции митохондриальной ДНК, стабилизации транскрипта и инициации репликации в условиях действия эндогенных и экзогенных повреждающих агентов [35]. Посредством индукции синтеза MRP-1 -ключевого белка АТФ-зависимого транспорта ксенобиотиков из клеток, ARE может участвовать и в регуляции множественной лекарственной резистентности [272]. Именно поэтому контролируемая сеть ARE-регулирующих генов рассматривается как универсальная система клеточной защиты в условиях окислительного стресса.

В связи с изложенным допустимо полагать, что активация ARE под влиянием милиацина могла бы служить существенным звеном в реализации его антиоксидантного эффекта. Что касается конкретных механизмов такой активации, то существующие представления о них прежде всего связаны с мобилизацией фактора транскрипции Nrf-2 (NF-E2 — related factor 2). Последняя обеспечивается индуцибильной или усиливающейся конститутивной деградацией комплекса Nrf-2 — Кеар-1, в котором Кеар-1 (Kelch-like ECH associating protein-1) отводится роль негативного регулятора (супрессора). Такой эффект установлен, в частности, для CDDO [189]. Следует однако отметить, что необходимым условием разрушения комплекса Nrf-2 — Кеар-1 в любом случае служит изменение конформации Кеар-1 в результате окислительной модификации его молекулы. Поскольку милиацин ослабляет выраженность окислительного стресса, такой механизм его влияния на высвобождение Nrf-2 представляется маловероятным. Однако это не исключает возможного индуцирующего действия милиацина на активность трансляции белка Nrf-2, установленного для других антиоксидантов [237]. Это повышает свободный (мобильный) пул данного фактора транскрипции в цитозоле, транслоци-рующегося в ядро для последующего связывания с рецепторным сайтом ARE. Другой механизм активации ARE милиацином мог быть сопряжен с его прямым индуцирующим влиянием на ARE, установленным в отношении многих ароматических или гетероциклических соединений растительного происхождения, включая тритерпеноиды [184].

Отменяя MTX — индуцированную супрессию гена glured, милиацин мог способствовать возрастанию внутриклеточного пула GSH и, соответственно, повышению эффективности всей глутатионзависимой системы антиокси-дантной защиты. При этом может осуществляться еще один механизм активации ARE, определяемый соотношением окисленных и восстановленных тиолов, в поддержании баланса которых глутатиону (наряду с тиоредокси-ном и пероксиредоксином) принадлежит центральная роль [56].

Очевидно, что снижение милиацином выраженности окислительного стресса способно положительно влиять на экспрессию и других факторов ан-тиоксидантной защиты, в том числе — через ослабление генотоксического эффекта АФК с одновременным снижением АФК — индуцируемой активации экспрессии генов проапоптотических факторов, включая ген сур 2е1. Угнетение последнего могло быть обусловлено и прямым действием милиацина, установленным, как отмечалось выше (глава 5), в отношении других тритер-пеноидов.

Наряду с влиянием на экспрессию генов ведущих факторов поддержания редокс-баланса клетки, защитный эффект милиацина при активации окислительного стресса, как было показано ранее [101], опосредуется также повышением устойчивости клеточных мембран к повреждающему действию АФК и продуктов липопероксидации. Такой эффект тритерпеноида связан с его гидрофобностыо, обеспечивающей возможность встраивания в липидный бислой мембраны. Подобное встраивание способно экранировать полиненасыщенные жирные кислоты от атаки радикал-частицами и (или) укреплять прочность упаковки фосфолипидов мембран, противодействуя детергентопо-добным эффектам [141]. В результате ограничиваются нарушения фосфоли-пидного состава мембран в виде уменьшения содержания в них наиболее метаболически активной фракции фосфотидилсерина, снижения доли фосфати-дилхолина и фосфатидилэтаноламина и возрастания метаболически инертного сфингомиелина [87]. Таким образом, оказывая модифицирующее воздействие на липидные компоненты мембран, милиацин выступает и как «структурный мембранопротектор», способный в условиях генерации АФК поддерживать жидкостные характеристики мембран на уровне, обеспечивающем необходимую активность мембраносвязанных процессов.

В рамках данной работы определенный интерес представляет вопрос о влиянии милиацина и на процесс восстановления структурных, биохимических и функциональных параметров клеток печени после воздействия MTX. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование тритерпеноида обусловливало меньшую продолжительность этого процесса. При анализе такой ситуации безусловного внимания заслуживает оценка изначальной выраженности формирующихся нарушений, которые у животных, подвергавшихся воздействию MTX без последующего применения милиацина, были более глубокими, чем в условиях его применения. Соответствующий вывод заключается в том, что меньшая степень депрессии исследуемых показателей определяла в последующем и меньшую продолжительность их восстановления. Вместе с тем не исключается, что интенсивность подобной регенерации" при использовании милиацина обусловливалась и его непосредственным влиянием на восстановление клеточных популяций в органе. В основе такого прямого эффекта милиацина могла лежать известная способность тритерпеноидов к пренилированию белков (путем присоединения с помощью пренилтрансфераз к белковым молекулам пренильной группы фарнезила или геранилгеранильного остатка), обеспечивающая последним приобретение липофильных свойств, встраивание в мембрану и реализацию функциональной активности [103]. Спектр этой активности достаточно широк и включает модуляцию сигнальных систем, в том числе ответственных за рост и диференцировку клеток [157].

Полученные результаты о гепатопротекторном влиянии милиацина и об антиоксидантном механизме этого влияния поставили перед необходимостью оценки эффективности защитного действия тритерпеноида по сравнению с официальными гепатопротекторами растительного происхождения с антиоксидантными свойствами. Выполнение этого раздела работы с использованием карсила, содержащего флавоноиды расторопши, позволило установить что милиацин в используемой разовой дозе (2 мг/кг) при трехкратном внутрибрюшинном введении превосходит карсил по способности ограничивать МТХ-индуцируемую гиперферментемию. В отношении ограничения нарушений пигментного обмена эффективность милиацина соответствовала эффективности карсила в разовой дозе 6 мг/кг.

В целом, результаты работы, отражающие защитное влияние милиацина в отношении гепатотоксичности MTX, раскрывают новый аспект биологического действия тритерпеноида и определяют возможность его использования в комбинации с MTX при химиотерапии опухолей.