Характеристика новых бета-пропеллерных белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4

I.I. Актуальность проблемы.

Фибриллярный аппарат бактериофагов представляет собой уникальный объект для исследований, интерес к которому не ослабевает уже многие годы. В первую очередь, фаговые фибриллы привлекательны для исследователей простотой своего строения, которая при этом, в ряде случаев, сопряжена с бифункциональной нагрузкой. Кроме того, гены, кодирующие фибриллярный аппарат являются наиболее пластичным компонентом фаговых геномов, а потому представляют немалый интерес для иccлeдoвaния микроэволюционных событий.

Одним из наиболее исследованных на данный момент фаговых фибриллярных белков является фибритин бактериофага Т4 [Letarov A.V. et al., 2005]. Фибритин представляет собой комплекс «воротничок-бакенбарды», и кодируется геном wac. «Бакенбарды» представляют собой шесть фибрилл длиной 480 A, отходящих от шейки фаговой частицы [Coombs D.H. et al. 1977]. Эти фибриллы способны временно связываться с ДХФ и должным образом ориентировать их для присоединения к базальной пластинке при сборке фаговой частицы [Efimov V.P. et al., 1994]. Кроме того, «бакенбарды» в случае бактериофага Т4 несут функцию молекулярного сенсора, предотвращающего инфекцию в неблагоприятных условиях (например, высокая ионная сила раствора, низкий pH). Данный сенсор функционирует за счет временного связывания С-концевого домена фибритина («бакенбарды») со средним участком ДХФ, что обеспечивает удерживание последней в поднятом состоянии [Conley М.Р., et al, 1975]. Фибритин представляет собой тримерную альфа-спиральную coiled-coil структуру, фланкированную маленькими глобулярными Nи С-концевыми доменами [Efimov V.P. et al, 1994]. В то время как N-домен (50 а.о.) необходим только для прикрепления тримера к «шейке» бактериофага, С-концевой домен, состоящий из 30 а.о., несет двойственную функцию: он является затравкой фолдинга всей молекулы (фолдоном), а также играет важную роль в упомянутом выше связывании с ДХФ [Letarov A.V. et al., 1999].

Механизм инициации фолдинга фибритина бактериофага Т4 на данный момент описан весьма подробно [Meier S. et al., 2004, Guthe S., et al., 2004]. Методами рентгеноструктурной кристаллографии и ЯМР было показано, что гидрофобный кор и межмолекулярные связи внутри тримерной молекулы формируются за счет аминокислотного мотива GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL. Данный мотив (иначе называемый фолдон), как было показано в нескольких работах, является необходимым для эффективной инициации тримеризации и последующего фолдинга фибритина.

Для нативной тримерной молекулы фибритина была показана способность к ренатурации после нагревания, а также свойства ограниченной ДСН-устойчивости и ограниченной устойчивости к действию протеаз [Boudko S. et al., 2002]. Эти замечательные качества фолдона фибритина фага Т4 могут быть использованы при конструировании искусственных химер, например, как это было сделано в случае получения гибридного белка, состоящего из фолдона на N-конце, слитого с последовательностью бета-спиральной тримерной фибриллы аденовируса [Papanikolopoulou К. et al., 2004].

Современная биотехнология и практическая молекулярная биология испытывают острую необходимость в новых методах получения тримерных химерных белков. Без привнесения в аминокислотную последовательность надежных доменов, инициирующих тримеризацию, очень сильно усложняется исследование трансмембранных тримерных белков, а также отдельных доменов тримерных фибриллярных белков. Фолдон фибритина бактериофага Т4, несмотря на ряд его достоинств в качестве домена, инициирующего тримеризацию, во многих случаях не обеспечивает должной эффективности фолдинга тримерных химер. В связи с этим, в настоящий момент представляется актуальным поиск структур, альтернативных фолдону фибритина фага Т4, но способных инициировать тримеризацию более эффективно.

Помимо прикладного значения, обнаружение гомологов фолдона фибритина фага Т4 проливает новый свет на процессы горизонтального переноса генетического материала среди бактериофагов, а также позволяет сделать предположения о закономерностях фолдинга некоторых тримерных фаговых фибриллярных белков.

1.11. Цели и задачи работы.

Цель проделанной нами работы — показать широкое распространение и разнообразие белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4 и охарактеризовать некоторые из них.

Задачи исследования состояли в следующем:

1. Поиск бактериофага, имеющего фибритин с фолдоном, отличающимся по аминокислотной последовательности от фолдона фибритина бактериофага Т4.

2. Дифференциальная физико-химическая характеристика фибритина вновь обнаруженного фага и его делеционных вариантов.

3. Поиск новых белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4 методами биоинформатики.

4. Моделирование вторичных и третичных структур обнаруженных нами доменов in silico.

I.III Положения, выносимые на защиту.

1. В С-концевом домене фибритина бактериофага JS98C3 обнаружены два аминокислотных домена, гомологичных фолдону фибритина фага Т4. Данные домены, несмотря на имеющиеся отличия от последовательности фолдона фибритина бактериофага Т4, способны к автономной тримеризации.

2. С-концевой фолдон фибритина фага JS98C3 превосходит по прочности фолдон фибритина фага Т4 и может быть применен в белковой инженерии в качестве более надежного домена, инициирующего тримеризацию химерных белков.

3. Фолдон фибритина бактериофага Т4 не является уникальной структурой. Его гомологи широко распространены среди бактериофагов, относящихся к семействам Myoviridae и Siphoviridae.

I.IV. Научная новизна и практическая ценность работы.

До последнего времени фолдон фибритина бактериофага Т4 считался уникальной структурой. Впервые было продемонстрировано широкое распространение бета-пропеллерных белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина, причем большая часть выявленных гомологов данной структуры была обнаружена в последовательности белков бактериофагов, не родственных Т4. Также была показана возможность отклонения аминокислотной последовательности бета-пропеллерных доменов от «канонической» последовательности фолдона фибритина фага Т4. In silico моделирование третичной структуры одного из подобных доменов, обнаруженного в последовательности фибритина бактериофага JS98C3 показало наличие в ней дополнительного участка альфа-спирали, что делает данный фолдон более энергетически выгодным и более прочным, чем фолдон фибритина бактериофага Т4. Исследование физико-химических свойств данной структуры in vitro с высокой степенью достоверностиподтвердило результаты моделирования.

Дальнейшее исследование аминокислотного окружения, в котором были обнаружены многочисленные гомологи фолдона фибритина бактериофага Т4, в перспективе позволит получать химерные белковые конструкции с большей, чем в настоящий момент, эффективностью.

I.V. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международной конференции «1st Texas — Evergreen Phage/Virus Genomics and Ecology Meeting», а также Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии — 2005» и «Актуальные аспекты современной микробиологии — 2006».

I.VI. Публикации.

По теме диссертационной работы опубликовано и сдано в печать 8 печатных работ (4 статьи и 4 тезиса). щ.

I.VII. Место проведения работы.

Работа выполнена в лаборатории вирусов микроорганизмов Института Микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН. Спектры кругового дихроизма белков были получены в лаборатории структурной биологии Института Биоорганической Химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. f.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

II.I. Фолдинг белков и его основные закономерности.

Вопрос о механизмах, благодаря которым полипептидная цепь принимает свою нативную пространственную структуру, уже многие годы остается одним из наиболее актуальных в молекулярной биологии.

Изначально чисто фундаментальный вопрос о том, как же происходит фолдинг белка, стал в последние годы жизненно важным в познании природы самых разнообразных болезней. Такие тяжелые заболевания как боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, и муковисцидоз, как это было показано в последние годы, вызываются нарушениями в процессе фолдинга соответствующих белков [Hensley К. et al., 2006, Games D. et al., 2006, Harris D.A. et al., 2003]. Кроме того, понимание механизмов фолдинга существенно также для развития биотехнологии и биоинженерии. При экспрессии различных генов в гетерологичных системах, в следствие абберантного фолдинга, генно-инженерные белки часто накапливаются в клетках в виде нерастворимых тел включения [Lilie H. et al., 1998]. Дизайн белковых молекул de novo также ограничивается недостаточным пониманием механизмов фолдинга.

Со времен классической работы Анфинсена, в которой он показал, что рибонуклеаза, А способна складываться в нативную структуру без внешнего воздействия, прошло уже более сорока лет [Anfinsen C.B. et al, 1961]. За это время молекулярная биология накопила уже довольно большой багаж знаний, который существенно расширил наше понимание механизмов фолдинга.

Еще в ранних исследованиях in vitro было показано, что процесс фолдинга происходит, как правило, во временном интервале от миллисекунд до секунд. Этот промежуток времени на порядки меньше, чем-то время, которое потратила бы молекула белка, если бы в процессе фолдинга она принимала все возможные конформации. Основываясь на этом наблюдении, Левинталь сделал вывод, что в момент фолдинга не происходит случайного поиска конформации, и белки укладываются в соответствии с особыми «путями фолдинга» [Levinthal С., 1966]. В соответствии с этими путями, молекула белка проходит в процессе фолдинга через несколько строго определенных промежуточных частично структурированных состояний, которые часто называют «расплавленной глобулой». Естественно, что для коротких белков, состоящих из одного домена, нет необходимости в прохождении нескольких стадий фолдинга, и их укладка в нативное состояние происходит без интермедиатов [Jackson S.E. et al., 1991].

В настоящий момент основной теорией, описывающей закономерности фолдинга, является модель нуклеации-конденсации [Abkevich V.I. et al., 1994, Fersht A.R., 1997, Shakhnovich E.I., 1997]. В соответствии с этой моделью, для инициации фолдинга необходимо образование связей между небольшим количеством аминокислотных остатков с возникновением так называемого «ядра фолдинга» или фолдона. Сразу же после образования фолдона, белок быстро переходит в нативное состояние. Кооперативность процесса фолдинга белка аналогична кооперативности, показанной для реакций фазового перехода первого рода, которые протекают по механизму нуклеации и роста [Lifshits Е.М., 1981].

Модель нуклеации-конденсации основывается на данных, полученных in vitro и in silico, однако фолдинг белков in vivo часто происходит под влиянием двух важных факторов, которые тяжело рассчитать и учесть в эксперименте. Во-первых, фолдинг белков в клетке обычно осуществляется с участием молекулярной машинерии, например, шаперонов, причем зачастую в нем принимают участие мелкие молекулярные кофакторы. Молекулярные шапероны, такие, как, например, белок теплового шока Hsp70 и шаперонины, частично облегчают фолдинг, изолируя белки от основного объема цитозоля, а также препятствуя их неправильному сворачиванию и агрегации [Frydman J. et al., 1996, Martin J. et al., 1997]. Мелкие молекулярные кофакторы способны стабилизировать нативный фолд многих белков, а также ускорять их фолдинг [Wittung-Stafshede Р., 2002, Leckner J. et al., 1997]. Во-вторых, большое влияние на скорость фолдинга белков оказывает их концентрация, которая в клетках может достигать сотен граммов на литр [Luby-Phelps К., 2000].

II.II. Бактериофаг Т4. Семейство Т4-подобных бактериофагов.

Бактериофаги, вирусы бактерий, — наиболее распространенные биологические объекты на нашей планете. По некоторым оценкам их количество превосходит количество бактерий в 5−25 раз [Baiter M., 2000, Fuhrman J.A., 1999], и в масштабах всей биосферы достигает лл.

10JU [Brussow H. et al., 2002]. Только в океане бактериофаги ежедневно лизируют порядка 20% бактериальной биомассы (22% от тотальной океанической биомассы) [Suttle С.А., 2006].

Т4-подобные бактериофаги — это широко распространенная группа литических бактериофагов, имеющих генетические гомологии и морфологическое сходство с хорошо изученным фагом Е. coli Т4. Впервые Т4 и очень близкие к нему бактериофаги Т2 и Т6 были описаны в 1945 году, в классической работе Демерек иФано [Demerec M. et al., 1945]. Последующие работы Р. Эдгара и Д. Эпштайна показали максимальное удобство данного объекта для генетических исследований среди всех существовавших на то время моделей и сделали Т4 «рабочей лошадкой» зарождавшейся тогда молекулярной биологии.

На настоящий момент, бактериофаг Т4 является одним из наиболее подробно исследованных биологических объектов. Появившиеся вскоре после первых исследований фагов, методы электронной микроскопии [Ruska, H., 1940] позволили визуализировать фаговые частицы, и подразделить их на основе морфологического строения на семейства. Фаг Т4, в соответствии с его морфологией, был отнесен к семейству Myoviridae — бактериофаги с сократимым хвостовым отростком. Геном бактериофага Т4, картированный условно летальными мутациями еще в 1960;е годы, к настоящему моменту полностью секвенирован, и составляет без концевой избыточности 168 903 п.о. В данном геноме обнаружено 278 открытых рамок считывания, из них всего 62 являются необходимыми для нормальной репликации фага в лабораторных условиях [Miller, E.S. et al., 2003]. Экспрессия генов фага Т4 регулируется при помощи трех типов промоторов: ранних, средних и поздних [Mosig G. et al., 1994]. Несмотря на то, что фаг Т4 уже давно является объектом самого пристального внимания исследователей, функции 127 открытых рамок считывания в его геноме до сих пор остаются неизвестными.

Вирион фага Т4 состоит из головки, хвостового отростка с сократимым чехлом и стрежнем, базальной пластинки, а также длинных и коротких хвостовых фибрилл (Рис. 1). В районе «шейки» фаговой частицы, отделяющей головку от хвостового отростка располагается комплекс «воротничок-бакенбарды».

Головка бактериофага состоит из основного головочного белка (пг23), пг24, формирующего углы икосаэдра, а также инкрустирующих белков Нос и Soc [Fokine A. et al., 2004]. Через портальный' белок (пг20) и продукты генов 3, 13, 14 и 15 головка присоединяется к стержню хвостового отростка (пг19), окруженному сократимым чехлом (пг18). Оканчивается хвостовой отросток базальной пластинкой, состоящей из комплекса продуктов генов 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 и 12 [Ко81уисЬепко У.А. еГа1., 2005].

Рис. 1. Схема строения бактериофага Т4.

Пг 12 (короткие хвостовые фибриллы), а также присоединенные к базальной пластинке изогнутые длинные хвостовые фибриллы (ДХФ), сформированные из продуктов генов 34, 35, 36, и 37 являются.

Головка.

Длинные хвостовые фибриллы.

Хвостовой отросток.

Короткие хвостовые фибриллы.

Базальная пластинка структурами, необходимыми бактериофагу для адсорбции на поверхность клетки-хозяина.

Комплекс «воротничок-бакенбарды», состоящий из гетероолигомера продуктов генов 13 и 14 («воротничок») [АкМег Т. et а1, 2007], а также шести тримерных молекул фибритина («бакенбарды») отделяет головку фаговой частицы от ее хвоста. Подробнее о структуре и функциях этого комплекса рассказывается в главе «Фибритины Т4-подобных бактериофагов: особенности структуры, функции и эволюции» данного обзора.

К концу 1990;х годов коллекция изолированных бактериофагов с морфологией близкой к Т4 выросла до такой степени, что назрела необходимость в четкой системе, позволяющей определить филогенетическое положение того или иного фага. Подобная система была создана в 2000 году Г. Криш и соавторами [Тё1аг1 Б. а а1., 2000]. В основу классификации помимо чисто морфологических признаков, таких как размеры головки фаговой частицы, легла степень гомологии нуклеотидной последовательности геномов бактериофагов, в частности — гомологий в генах основного структурного белка головки (ген 23), а также генах, кодирующих структурные белки хвостового отростка: стрежня (ген 19) и сократимого чехла (ген 18). В соответствии с данными признаками, Т4-подобные бактериофаги были подразделены на 4 группы (рис. 2).

Наиболее близко родственные Т4 бактериофаги относятся к группе истинно Т-чётных. Эти фаги имеют морфологию частицы, практически идентичную Т4 и отличаются друг от друга по нуклеотидной последовательности не более, чем на 5% Lodiyzsi Б. et а1., 1991, МсРЬее1егБ Б.Б. et а1., 1988, Мопос! С. et а1, 1997, БеНск Н.Е. а/., 1993, ТИетег С.А. а1., 1998]. К этому семейству относятся такие бактериофаги, как Т2, Т4 и Т6.

Рис. 2. Филогенетическое дерево семейства Т4-подобных бактериофагов по Г. Крит и соавторам (Tetart et al., 2004).

К группе исевдо-Т-четных относятся эволюционно удаленные от Т4 бактериофаги, такие как RB42, RB43, RB49 и 44RR. Несмотря на то, что их морфология очень напоминает Т4, только 10% их ДНК гибридизуется с ДНК фага Т4 при жестких условиях. Нуклеотидные последовательности наиболее консервативного гена Т4-подобных бактериофагов, кодирующего основную структурную единицу головки (ген 23), у фагов этой группы имеют отличия от гена 23 фага Т4 до 30%. Для наиболее хорошо изученного бактериофага, относящегося к данной группе, RB49, показано еще одно яркое отличие от представителей истинно Т-четной группы, а именно — отсутствие средних промоторов.

Между истиннои псевдо-Т-чётными фагами находится промежуточная группа, представленная RB69, Tula, SV40, JS98 и прочими фагами — химерами. Несмотря на последовательность гена 23, типичную для истинно Т-четных фагов, эти бактериофаги по свойствам своего генома близки к псевдо-Т-четным [Yeh L.S. et al., 1998]. Наличие данной группы говорит о наличии постоянного генетического обмена между истиннои псевдо-Т-четными бактериофагами.

Третья группа Т4-подобных бактериофагов — шизо-Т-четные. К этой группе относят бактериофаги, изолированные на хозяевах, филогенетически удаленных от Е. coli, таких как представители родов Aeromonas и Vibrio. Подавляющее большинство фагов этого семейства имеет головку большего размера, чем у Т4 (137 нм вместо 111 нм). Соответственно, и их геном превосходит размерами геном фага Т4 (230−250 тыс. п.о. вместо 169 тыс. п.о. у Т4) [Matsuzaki S. et al., 1998]. Отличия в нуклеотидной последовательности геномов этих бактериофагов от истинно Т-четных бактериофагов еще больше, чем у псевдо-Т-четных, что можно объяснить не только их большими размерами, но и иным спектром хозяйской специфичности. Стоит отметить, что еще в 1987 году для Т4 были получены точечные мутации в гене 23, приводящие к увеличению длины головки фаговой частицы [Doermann А. Н. et al., 1987]. Возможность подобных преобразований говорит о том, что эволюционные трансформации от истиннои псевдо-Т-четных фагов к шизо-Т-четным. могут происходить без особых препятствий.

Наиболее филогенетически и морфологически удаленной группой Т4-подобных фагов являются экзо-Т-четные бактериофаги. Для представителей данной группы характерна головка, имеющая форму изометрического икосаэдра (85 нм), а также более длинный, чем у Т4 хвостовой отросток (180 нм вместо 113 нм) [Hambly Е. et al., 2001]. Несмотря на столь явные отличия в морфологии, гомологии в нуклеотидных последовательностях генов 23, 18 и 19 позволяют отнести этих фагов к семейству Т4-подобных. Экзо-Т-четные бактериофаги были изолированы на цианобактериях родов Synechococcus и Prochlorococcus,.

В настоящее время работы по секвенированию и систематизации геномов Т4-подобных бактериофагов активно продолжаются при поддержке Национального Фонда Науки США в лабораториях Г. Криш и Д. Карам. Вся собранная в результате этих исследований информация депонируется на Интернет-сайте http://phage.bioc.tulane.edu. Предполагается, что дальнейшее изучение геномов бактериофагов, имеющих морфологию, близкую к Т-чётным, позволит обнаружить фагов, еще более филогенетически удаленных от Т4, чем известные ныне шизои экзо-Т-четные. Исследования в этом направлении со временем, несомненно, смогут позволить нам реконструировать эволюционную историю Т4-подобных бактериофагов, а также расширить наше понимание биологии этих замечательных вирусов.

II.III. Современная теория эволюции Т4-подобных бактериофагов.

За последние годы в нескольких лабораториях был проведен ряд сравнительных исследований геномов Т4-подобных бактериофагов [Mann N.H. et al, 2005, Miller E.S. et al., 2003, Nolan J. et al., 2006, Petrov V. et al., 2006, Sullivan M.B. et al., 2005]. На основании результатов этих исследований можно построить полный портрет Т4-подобного семейства, который по сути своей представляет собой кор из примерно 75 ключевых генов, окруженный пластичной периферией. При этом, количество ключевых генов зависит от исследуемой группы фагов. Так, например, если для бактериофагов Т4, RB49 и Aehl можно выделить примерно 90 коровых генов, то для филогенетически удаленных цианофагов количество общих с Т4 коровых генов составляет даже меньше, чем 45 для каждого. Подобные гены составляют костяк геномов фагов Т4-подобного семейства, и включают в себя большинство (но не все) необходимых генов фага Т4, такие как гены структурных белков вириона и ДНК-реплицирующего аппарата. Удивительно, но среди коровых генов также оказалось и несколько генов, функции которых пока не определены [Comeau A.M. et al., 2007]. Как и предполагалось ранее, гены, отвечающие за взаимодействие с клеткой-хозяином, такие как короткие и длинные хвостовые фибриллы, гены тРНК, гены ДНК-модифицирующих ферментов и прочие, оказались расположенными в гиперпластичных регионах геномов.

Лоскутная" структура генома включающая в себя как гиперпластичные регионы, так и консервативный кор, похоже, является исключительным свойством Т4-подобных фагов. В основанном на полных геномах филогенетическом древе по Роуэр и Эдварде [Rohwer F. et al., 2002], семейство Т4-подобных бактериофагов находится далеко не только от всех остальных фагов, но даже и от прочих фагов с сократимым хвостовым отростком. В общих чертах, фаги с несократимым хвостовым отростком, очевидно, имеют менее ограниченную эволюцию из-за того, что они способны обмениваться большими генетическими модулями с не родственными бактериофагами. Сравнения полных геномов показывают, что все Т4-подобные фаги имеют общие предковые последовательности, распределенные по геному. Множественные выравнивания геномов этих бактериофагов показывают более чем 50% идентичность последовательностей в вышеупомянутых коровых регионах.

Лямбдоидные фаги, представители семейства фагов с несократимым хвостовым отростком (Siphoviridae), напротив, обнаруживают намного меньшее количество предкового кора, который чаще всего располагается в правой половине их генома.

Бактериофаги этого семейства, включающего в себя колифаги и микобактериофаги [Pedulla M.L. et al2003] несомненно, могут замещать свои необходимые гены абсолютно неродственными функционально эквивалентными последовательностями [Hendrix R.W. et al., 2003, Lawrence J.G. et al., 2002]. Это свойство прямо противоположно свойствам Т4-подобных бактериофагов, которые, по всей видимости, имеют прочные барьеры, препятствующие обмену с близкими гомологами и защищающие общую синтению коровой группы генов [Filee J. et al., 2006]. К этим барьерам можно отнести большую комплексность фагов, родственных Т4, с их многочисленными белок-белковыми взаимодействиями между составными частями вириона и репликативной машины [Karam J.D. et al., 2000, Leiman P.G. et al., 2003]. Вне зависимости от этих утверждений, более строгое сохранение кластеров коровых генов ведет к «более вертикальному» пути эволюционного развития с ограниченным латеральным переносом генов, внутри этих кластеров и бурным латеральным переносом в гиперпластичных регионах.

Предполагается, что важность и протяженность латерального переноса генов зависит от комплексности бактериофага. Более просто организованные фаги могут извлекать из этого переноса гораздо большую пользу, чем сложные, в силу своей неприхотливой морфологической и энзиматической архитектуры. В качестве примера, здесь можно привести две подгруппы липид-содержащих бактериофагов семейства Tectiviridae, которые имеют простое строение, маленькие геномы (примерно 15' т.п.н.), организованные сходным образом, но не имеют сколько-либо значимых гомологий в последовательностях [Ravantti J.J. et al., 2003, Saren A.M. et al., 2005]. Что же касается больших и комплексных фагов, родственных Т4, то они могут извлекать пользу из латерального переноса в ограниченных гиперпластичных регионах генома, не затрагивающих их слаженный и живучий генетический кор.

Комо с соавторами [Comeau A.M. et al2007] полагают, что консервативный кор, состоящий из генов репликативной машины и структурных генов вириона, изначально возник в результате сборки из модульных составляющих. Однако, как только эти составляющие более «притерлись» друг к другу, возможностью больших модульных перестановок было пожертвовано.

II.IV. Фибритины Т4-подобных бактериофагов: особенности структуры, функции и эволюции.

Продукт гена wac бактериофага Т4, белок фибритин, входит в состав комплекса «воротничок-бакенбарды», который локализован на частице бактериофага в месте соединения головки фаговой частицы и хвостового отростка — «шейке» (Рис. 3).

Рис. 3. Схема строения бактериофага Т4 и его фибритина. Справа — схема структурной организации фибритина — тримерной альфа-спиральной соИей-соИ (из Ье1аго е1 а!., 2005).

Воротничковые нити, которые представляют собой фибриллы, размерами примерно 48×2 нм, впервые были обнаружены при помощи электронной микроскопии еще в 1970 году в лабораториях Янагида и Диксона [Yanagida M. et al., 1970, Dickson R. et al., 1970]. Свое название, «фибритин», данный белок получил в 1988 году, когда он привлек внимание группы исследователей под руководством В. В. Месянжинова [Prilipov A.G. et al., 1988].

Несколько позже, основываясь на анализе аминокислотной последовательности, данных спектроскопии кругового дихроизма и экспериментах с делеционными вариантами фибритина, В. В. Месянжинов с коллегами сделали вывод о том, что фибритин имеет параллельную альфа-спиральную coiled-coil структуру [Efimov V.P. et al., 1994]. К, настоящему моменту методами рентгеноструктурной кристаллографии разрешены структуры целой серии делеционных вариантов фибритина бактериофага Т4 [Boudko S.P. et. al., 2004, Strelkov. S.V. et al., 1998, Strelkov S.V. et al., 1996]. Согласно данным, полученным, на основании этих структур, фибритин представляет собой тримерную фибриллу, длиной 480 А, которую можно разделить на три домена, отличающихся по своему строению и функции. Глобулярный N-концевой домен фибритина состоит из 50 а.о. и служит для прикрепления данного белка к «шейке» фаговой частицы. Средняя часть фибритина представляет собой тримерную параллельную альфа-спиральную coiled-coil фибриллу, содержащую 13 сегментов с гептадными повторами, перемежающиесяпетлями [Efimov V.P. et al., 1994]. На С-конце фибритин оканчивается еще небольшим (30 а.о.) глобулярным доменом, который служит затравкой для фолдинга всей молекулы [Letarov A.V. et al., 1999].

Фибритин функционирует как молекулярный шаперон, ускоряющий объединение проксимальной и дистальной половинок длинных фибрилл и их присоединение к частице фага [Wood W.B. et al., 1994].

Мутации по гену wac в непермиссивных условиях не имеют летального характера. При росте штаммов фага с амбер мутацией длительность инфекционного цикла на семь минут больше, чем у дикого типа фага. В культуре на твердой среде бляшки wac — дефективных штаммов имеют уменьшенный размер, а в жидкой культуре выход инфекционных фаговых частиц уменьшается в 5−10 раз по сравнению с диким типом [Conley М.Р. et al., 1975]. Фибритин также может рассматриваться как простейший молекулярный сенсор, позволяющий модулировать адсорбцию бактериофага в зависимости от условий среды. Известно, что длинные хвостовые фибриллы на частице фага могут находиться в двух положениях: «down», при котором они направлены вниз и способны к адсорбции на клеточной стенке, и «up», при котором они, взаимодействуя с бакенбардами, отогнуты вверх, вдоль стержня хвостового отростка, и не активны [Conley М.Р. et al., 1975, Follansbee S.E. et al., 1974]. Положение «up» является реакцией на ряд внешних условий окружающей среды — оно имеет место при рН ниже 5, низкой ионной силе, низкой температуре, а так же низких концентрациях полиэтиленгликоля [Follansbee S.E. et al., 1974]. Таким образом, с помощью пг wac бактериофаг Т4 обеспечивает простейшую реакцию на изменение внешней среды. Этим объясняется также способность мутантов фага Т4 по гену wac адсорбироваться на клетках в присутствии полиэтиленгликоля, тогда как адсорбция фага дикого типа полностью подавляется в этих условиях.

Также высказано предположение, что переход длинных фибрилл в опущенное положение в определённых условиях может модулироваться следовыми концентрациями различных метаболитов бактерий и / или изменением кластерной структуры воды в ближайшей окрестности бактериальной клетки. Опускание фибрилл приводит к резкому увеличению эффективного гидродинамического радиуса вирусной частицы и уменьшению амплитуды броуновских движений, что должно приводить к некоторому концентрированию вируса вблизи бактерии (то есть к таксису) [Ivanitskii G.R. et al., 1975].

Бактериофаги, наиболее близко родственные Т4, истинно Т-четные, такие как Т2 и Т6, имеют пг wac, практически идентичные фибритину фага Т4. Однако, подобная картина отнюдь не характерна для бактериофагов, принадлежащих к более удаленным филогенетическим группам. В 2005 году Летаровым и соавторами была определена нуклеотидная последовательность генов wac серии бактериофагов, относящихся к истинношизои псевдо-Т-четным [Letarov A.V. et al, 2005]. Анализ данных последовательностей показал, что наиболее консервативной частью гена wac является его фрагмент, кодирующий N-концевой домен.

Центральная, фибриллярная часть оказалась более пластичной, что связано с тем, что она не участвует в белок-белковых взаимодействиях. Единственное ограничение, которое накладывается на ее последовательность, связано с периодичностью гидрофобных аминокислотных остатков, формирующих гидрофобный кор coiled-coil. Стоит отметить, что в coiled-coil альфа-спирали вытянуты, и потому на один оборот спирали приходится 3,5 а.о., вместо обычных 3,6 а.о. Вследствие этого, аминокислотные остатки, а и d из гептады (abc.

Наибольший интерес в плане разнообразия представляет С-концевой домен фибритинов фагов, родственных Т4. У всех бактериофагов, имеющих отличие от Т4 по аминокислотной последовательности более 20%, С-концевые домены оказались различными (Рис. 4).

Так, например, у бактериофага ЯВ49 гомология с фибритином фага Т4 заканчивается в районе Тгр476 (по координатам Т4), и последние 10 а.о. С-концевого домена замещены на 143 а.о. неизвестного происхождения. Аналогично, у фагов ЯВ42 и 11В43 после в1п455 располагается новый С-концевой домен длиной в 322 а.о., имеющий гомологии с белками, содержащими иммуноглобулин-подобный фолд [На1аЬу Б.М. а1., 1999].

Иммуноглобулин-подобно уложенные фрагменты трижды повторяются в данном домене в виде дефектных тандемных повторов. Не менее интересен гигантский фибритин шизо-Т-четного бактериофага АеЫ, который состоит из 1035 а.о. и нуждается в специфическом молекулярном шапероне для корректной укладки в нативную конформацию [Ье1агоу А.У. е? а1., 2006]. Его С-концевой домен, длиной 612 а.о. имеет слабые гомологии с некоторыми фибриллярными белками профагов, что может говорить о сходстве их структур и возможном общем происхождении.

Т4.

40fia.a.

RB49.

375a. a Г.

143.a.a.

KB42.

320a. a.

Ч>. а. а 11.

394а. а.

34la, a.

Aehl.

373a.a.

612 a, a.

Рис. 4. Структурная организация пг и’ас бактериофагов, родственных Т4. Светло-серым цветом обозначен центральный, соИес1-соИ домен, серым квадратом — И-концевой домен, серым кругом — фолдон фибритина Т4, прямоугольниками разных оттенков — новые С-копцевые домены, (из ЬеХагом е (а!., 2005).

Наиболее интересным из исследованных Летаровым и соавторами фибритинов, представляется фибритин бактериофага 42, изолированного на Burkholderia cepacia. Пг wac этого фага имеет стоп-кодон в регионе гомологии с coiled-coil частью фибритина бактериофага Т4 (то есть не имеет фолдона), и в Е. coli экспрессируется в виде телец включения. Исследователи остановились на двух вариантах в отношении данного гена: либо фолдинг его продукта осуществляется при помощи каких-либо молекулярных шаперонов бактерии-хозяина или самого фага, либо уровень его экспрессии с естественными регуляторными последовательностями настолько низок, что не допускает агрегации.

Авторами также был проведен генетический анализ генов 36 бактериофагов, у которых были обнаружены новые разновидности С-концевого домена фибритина. Этот ген кодирует изгибающуюся часть длинных хвостовых фибрилл Т4-подобных фагов, которая у бактериофага Т4 отвечает за взаимодействие «фибритин-ДХФ» [Letarov A.V. et al., 2005]. Во всех проанализированных случаях имели место изменения в области, отвечающей за С-концевой домен пгЗб, в котором, по всей вероятности, расположена мишень вышеупомянутого взаимодействия.

Таким образом, на данный момент очевидно, что часть гена wac, кодирующая С-концевой домен фибритина, у бактериофагов, родственных Т4 относится к гиперпластичным регионам, наряду с генами, кодирующими длинные хвостовые фибриллы, что может быть объяснено необходимостью согласованной замены взаимодействующих компонентов молекулярного сенсора.

II.V. Особенности структурной организации и олигомеризации фолдона фибритина бактериофага Т4.

Роль С-концевого домена в фолдинге фибритина стала очевидной при первых же попытках экспрессии мутантных вариантов пг wac с делециями, затрагивающими последние 30 а.о. [Efimov V.P. et al., 1994]. Именно в отношении этого домена, за его способность инициировать тримеризацию белков in vitro и in vivo, впервые был применен термин «фолдон» [Sobolev B.N. et al., 1995]. Небольшие размеры структурированной части (27 а.о.) и простой фолд делают фолдон фибритина бактериофага Т4 исключительно удобным объектом для изучения закономерностей фолдинга. Во всех предыдущих исследованиях фолдинга гримерных белков применялись большие фибриллярные белки, для которых характерна крайне медленная и комплексная кинетика фолдинга, зачастую сопровождающаяся необратимыми реакциями агрегации [Seckler R., 2000].

Фолдон фибритина бактериофага Т4 представляет собой три мерный бега-пропеллер, собранный из м он о мерных бета-шпилек (Рис. 5).

Тример стабилизируется за счет гидрофобных взаимодействий между Тгр476 (по нумерации с начала фолдона Тгр20 (W20)) каждой субъединицы, межмолекулярных солевых мостиков между Glu461 (Е5) и Arg471 (R15), а также межмолекулярных водородных связей между Туг469(У13)и Arg471(R15). Экспрессия изолированного фолдона (аминокислотные остатки 457−483) приводит к образованию стабильного тримера, для которого характерна двустадийная кривая плавления [Frank S. el al., 2001].

Рис. 5. Строение фолдона фибритина бактериофага Т4. Слевасхема внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий. Справа — модель четвертичной структуры (из Meier et al., 2004).

Тримеризация фолдона также происходит в две стадии, причем скорость образования тримерного фолдона настолько высока, что ее можно сравнить с скоростью образования димеров у самых быстро укладывающихся димерных белков [Guthe S. et al., 2004]. Ассоциация начинается с мономеров с частично скрытыми гидрофобными аминокислотными остатками, в эту же форму белок переходит при понижении рН до 2 [Guthe S. et al., 2004]. Диссоциация комплекса при понижении рН происходит за счет нейтрализации заряда Е5 в сильном межсубъединичном солевом мостике E5-R15, при этом мономеры сохраняют свою структуру — бета-поворот 1 типа. Стабильность этой структуры обеспечивается наличием в ней временных гидрофобных внутрицепочечных взаимодействий и локальной склонности полипептидной цепи к образованию поворота [Munoz V. et al., 1998, Espinosa J.F. et al., 2001].

К настоящему моменту для фолдона фибритина фага Т4 детально охарактеризованы большое количество физико-химических характеристик равновесного состояния «мономер-тример», а также высокотемпературной денатурации его мономерной формы, полученной при низких значениях рН. Кроме того, методами ядерно-магнитного резонанса выявлены, практически все диполь-дипольные взаимодействия в данном белке [Meier S. et al., 2004]. Таким образом, несмотря на некоторое количество «белых пятен», фолдон можно считать одним из наиболее подробно изученных олигомерных белков.

II.VI. Методы предсказания и моделирования белковых структур

Понимание структурной организации белков остается краеугольным вопросом в молекулярной биологии уже более 50 лет. Вплоть до последних двух десятилетий, единственным надежным инструментом для исследования белковых структур был метод непосредственного разрешения структуры исследуемого белка.

Однако, бурное развитие компьютерных технологий не могло не повлиять на изменение подходов к данной проблеме, и к настоящему моменту появилась возможность предсказания структуры многих простых белков in silico.

Современные методы предсказания белковых структур по своим походам разделяются на два направления: предсказание ab initio (на основании первых основополагающих принципов структурной организации белков, без привлечения дополнительных эмпирических предположений) и предсказание. на основе матрицы (белков, структура которых уже разрешена физическими методами).

Подход ab initio считается очень, перспективным, и со временем, несомненно, станет основным методом предсказаний. К сожалению, на данный момент он позволяет делать предсказания структур с очень низкой точностью, причины которой лежат в высокой комплексности проблемы, недостаточном уровне наших познаний, а также низкой вычислительной мощности современных компьютеров [Helles G., 2007].

Другой подход, предсказание по матрице, уже сейчас позволяет довольно точно предсказать структуры многих простых белков. В основе данного подхода лежит построение моделей структур белков на основе матриц — фолдов белков, структура которых уже разрешена и депонирована в базе данных PDB (Protein Data Bank). К настоящему моменту в этой базе данных, расположенной по адресу http://www.pdb.org/ депонированы структуры 48 780 белков^ причем ежемесячно их список увеличивается на 300 структур.

Ключевым шагом в предсказании, основанном на матрице, является распознание белков, которые имеют сходные четвертичные структуры. Для идентификации сходных фолдов исходно применяются несколько методов выравнивания последовательностей: «последовательность-последовательность», «последовательностьпрофиль», «профиль-профиль» и «последовательность-структура».

Наиболее старый метод, «последовательностьпоследовательность», разработанный в 1970;е годы, лег в основу широко применяемого инструмента BLAST [Altschul S.F. et al., 1990]. Данный метод относительно прост и эффективен при работе с большими массивами информации, однако точность его ограничивается возможностью обнаружения гомологов лишь среди белков с 40% идентичностью последовательностей [Vingron M. et al., 1994].

Выравнивания по методам «последовательность-профиль» или «профиль-последовательность» [Baldi P. et al., 1994, Bailey T. et al., 1991, Park J. et al., 1998, Gough J. et al., 2001] более чувствительны при обнаружении удаленных гомологов с идентичностью последовательностей от 20%. Профили могут относиться к простым множественным выравниваниям, позиция-специфичным матрицам подсчета (PSSM), или скрытым моделям Маркова.

Методы выравнивания «профиль-профиль», такие как CLUSTALW [Thompson J. et al., 1994] выгодно отличаются от методов «последовательность-профиль» тем, что их алгоритмы учитывают индивидуальный вес каждого фрагмента выравниваемых последовательностей, варьированием матриц аминокислотных замен, а также учетом значимости коротких инсерций/вставок [Wang G. et al., 2004, Edgar R. et al., 2003, Edgar R. et al., 2004, Soding J., 2005].

Наиболее сложный метод, «последовательность-структура», основывается на выравнивании исходной последовательности с шаблонами структур, уже разрешенных физическими методами, с последующей оценкой совместимости в соответствии с структурной адекватностью внешней среде и контактным потенциалам [Bowie J. et al., 1991, Murzin A. et al., 1995, Murzin A. et al., 1997, Kim D. et al., 2003]. Этот метод наиболее подходит для обнаружения белков, имеющих сходный фолд, однако не имеющих распознаваемого эволюционного родства.

К настоящему времени границы между методами, основанными на последовательности и методами, основанными на структуре, становятся все более зыбкими. Разрабатываются новые и новые методы, сочетающие оба вида информации, что повышает как качество распознания фолда [Panchenko A. et al., 2000, Shan Y. et al., 2001], так и качество выравнивания [Tang С. et al., 2003, O’Sullivan О. et al., 2004].

Один из наиболее популярных в настоящий момент методов — алгоритм TASSER представляет собой иерархический подход к предсказанию белковых структур (Рис. 6).

Он основан на выравнивании «последовательность-структура» с последующей сборкой четвертичной структуры путем перестановки протяженных фрагментов шаблона. На момент своей разработки этот алгоритм позволил построить на основании последовательностей модели 1487 из 1498 протестированных белков с среднеквадратичным отклонением менее чем в 6 A. При этом, довольно высокая точность была получена даже при построении моделей нерегулярных участков белков [Zhang Y. et al., 2004]. В случае со структурами, близкие гомологи которых имеются в Protein Data Bank, среднеквадратичное отклонение в моделях TASSER уменьшается до 2 A [Zhang Y. et al., 2008].

Structure assembly kyy.

Template Native Final Model.

Рис. 6. Схема работы метода предсказания белковых структур I-TASSER (из Zhang К, 2008).

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

III.I. Штаммы бактерий.

В качестве индикаторного штамма мы использовали дериват штамма coli К12 С600 (F-, thi-1, thr-1, leuBo, lacYl, tonA21, supE44). Для клонирования и получения плазмидной ДНК нами применялся штамм Е. coli DH5 (F-, thi-1, gyrA96, supE44, hsdR17, recAl, endAl, relAl). Экспрессию гена wac проводили в клетках Е. coli штамма BL21 (DE3) (gal hsdS (Лс/857 ind-1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene).

III.II. Среды для выращивания ихраиеиия бактерий t.

Для культивирования бактерий использовали жидкие питательные среды LB и 2xTY бульон [Sambrook J. et al., 1989].

В качестве твердых питательных сред использовали LB и 2xTY среды содержащие 1,5% агара (Difco, США). Все среды стерилизовали автоклавированием. Для отбора клонов бактерий, устойчивых к антибиотикам, использовали среды, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Для кратковременного хранения бактериальных культур использовали чашки Петри с LB-агаром, которые хранили при 4 °C. Для длительного хранения при — 70 °C в жидкую среду с бактериальной культурой добавляли глицерин до конечной концентрации 15% (по объему).

III.III. Изоляция бактериофагов.

Проба фекалий лошади (20 г) была гомогенизована в 80 мл фагового буфера (0.2 М NaCl, 0.1 г/л азида натрия, 1 г/л Tween 20).

Затем суспензия перемешивалась на роторной качалке 1 ч при комнатной температуре, после чего аликвоты были центрифугированы в течение 2 мин на микроцентрифуге при 12 000 об/мин. Супернатант использовался для высева на газон индикаторного штамма.

III.IV. Библиотека случайных клонов, клонирование и выделение плазмидной ДНК.

Для получения случайных клонов ДНК бактериофага JS98C3, гидролизованную эндонуклеазой рестрикции Dral, осаждали этанолом, после чего ресуспендировали в деионизованной воде и клонировали в плазмидный вектор T-system PCR cloning kit (Promega, США) в соответствии с инструкциями производителя. В этот же вектор клонировали фрагмент генома фага JS98C3, кодирующий ген wac.

Для клонирования фрагментов гена wac фага JS98C3, кодирующих варианты С-концевого домена фибритина мы использовали плазмидный вектор рЕТ-32а (Novagen, США). Вектор и вставки гидролизовали в течение 1 часа при 37 °C эндонуклеазами рестрикции Ncol и Xhol (Fermentas, Литва) в буфере, рекомендованном производителем, затем, после осаждения этанолом и отмывки лигировали ДНК-лигазой бактериофага Т4 (Fermentas, Литва) в течение часа на столе.

Плазмидную ДНК выделяли при помощи набора Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega, США).

III.V. ПЦР, олигонуклеотидные праймеры и секвенирование.

Для ПЦР-амплификации и секвенирования случайных клонов из плазмидной библиотеки нами применялись стандартные праймеры M13 °F и Sp6 (Fermentas, Литва). Для обнаружения бактериофагов, родственных Т4 мы применяли вырожденные олигонуклеотидные праймеры к гену 23, MZIAlbis (5'-GAT ATT TGI GGI GTT CAG CCI ATG А) и MZIA6 (5'-CGC GGT TGA TTT CCA GCA TGA TTT С) в концентрации 0.5 пМ/мкл. Ген wac амплифицировали и секвенировали с использованием олигонуклеотидов JST12up (5'-AGT TAC CAT (TA)(TC)G TTG A (CT)G GC), JS131o (5'-ATA AAA AGC CTG ATA ACC TTT), JS98wacM (5'-AAC CGA GTT GAT ATT CTG G) и jsNdlo (5' -TTT TTT CCA TGG TTA AGT GTC АТС AAG GAT TTC AGC CC). Для амплификации и секвенирования гена 36 использовали олигонуклеотиды JS9835up (5'-GAA TTT GG (T/C) GT (A/C) AAT GGT ATT CG) и JS98g371o (5'-TCT TTT AAG TTA ATA GCC AG (C/T) TC (G/A) CCT TC (A/G) GC). Фрагменты C-концевого домена амплифицировали при помощи олигонуклеотидов jsCdlup (5' -TTT TTT CCA TGG GTC AAA TGC СТА СТА AAT TGG G), jsCd2up (5' -TTT TTT CCA TGG GTA CAG AAA TTG ATA CGG ТС) и jsCdlo (5' -TTT TTT CTC GAG GCC CTT TTG TTA TGG TGC TGG G).

ПНР-амплификация производилась в 50 мкл ПЦР-буфера (67 мМ Tris-HCl (pH 8.3), 17 мМ (NH4)2S04, 0.001% Tween 20, 2.5 мМ MgCl2) с Taqполимеразой производства Sigma (США), 1.25 ед. акт. В т качестве матрицы для скрининга использовался 1 мкл экстракта фаговой бляшки. Матрицей для амплификации генов wac и 36 служил 1 мкл лизата бактериофага JS98C3 с титром 10б б. о. е./мл.

Полимеразную цепную реакцию проводили в приборе MJ Mini (Bio-Rad, США) в соответствии с программой: первичная денатурация — 3 мин при 93 °C, затем 25 циклов, состоящих из 40 с денатурации при 93 °C, 30 с отжига при 56 °C и 45 с элонгации при 72 °C. Завершалась программа финальной достройкой в течение 3 мин при 72 °C. ПЦР-продукты анализировались путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле в IxTAE буфере с окрашиванием бромистым этидием [Sambrook J. et al., 1989]. Секвенирование ПЦР-продуктов и случайных клонов проводили на автоматическом секвенаторе Avant 3150 (Applied Biosystems, США) с использованием реактивов фирмы-производителя.

III.VI. Электронная микроскопия.

Каплю фагового лизата наносили на медную сетку с формвар-углеродным покрытием, после 5 мин' инкубации на столе каплю отбирали фильтровальной бумагой. Затем препарат контрастировали 1%-ным уранилацетатом и* исследовали при помощи электронного микроскопа Jeol 100S (Япония) при 25 000хувеличении.

III. VII. Приготовление компетентных клеток Е. coli и трансформация плазмидной ДНК.

Клетки Е. coli из одиночной колонии вносили в 2 мл 2xYT бульона и выращивали при 37 °C в течение ночи. Ночную культуру разводили в 100 раз 2xYT бульоном и подращивали при 37 °C до достижения оптической плотности 0,6 (при длине волны 600 нм). Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин при 4 °C. Осадок ресуспендировали в 1/5 исходного объема 0,1 M MgCl2, охлажденном во льду. Смесь инкубировали во льду 10 мин, затем добавляли равный объем 0,1 M СаС12 и инкубировали еще 20 мин во льду. Затем клетки осаждали центрифугированием при тех же условиях и осадок ресуспендировали в 1/25 исходного объема 0,1 M СаС12. Затем добавляли 1/100 исходного объема 80% глицерина и расфасовывали клеточную суспензию по 0,2 мл. Полученные таким образом препараты хранили при -70°С.

Для проведения трансформации 100−200 мкл суспензии компетентных клеток Е. coli размораживали во льду, добавляли ДНК и инкубировали 20−40 мин во льду. Затем нагревали при 42 °C в течение 1,5−2 мин, охлаждали 1−2 мин во льду, добавляли 500 мкл 2xYT бульона и инкубировали 45−60 мин при 37 °C. Клеточную суспензию высевали на чашки Петри, содержащие твердые среды.

III.VIII Экспрессия, выделение и очистка пг wac и вариантов его С-копцевого домена.

Культуру клеток Е. coli BL21 (DE3), трансформированных плазмидной конструкцией с геном, кодирующим целевой белок, подращивали при интенсивной аэрации на среде LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, при 37 °C до OD590 = 0.7. Затем мы индуцировали экспрессию целевого гена добавлением ИПТГ (изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали культуру при интенсивной аэрации и 37 °C еще 4 ч. Биомассу осаждали центрифугированием при 6000 g и температуре 4 °C в течение 20 мин, после чего ресуспендировали осадок в буфере для лизиса (50 мМ натриево-фосфатный буфер (pH 7.0), 300 мМ NaCl). К клеточной суспензии добавляли лизоцим до 300 мкг/мл и ДНКазу I до 5 мкг/мл, после 20 мин инкубации на столе она была разрушена при помощи ультразвукового дезинтегратора. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 10 000 g и 4 °C в течение 10 мин. К осветленному лизату по каплям при интенсивном перемешивании добавляли (NH4)2S04 до 25% от насыщения, затем после 20 мин инкубации при 4 °C высоленный белок осаждался центрифугированием при 10 000 g и 4 °C в течение 10 мин.

Грубую очистку целевого белка проводили несколькими циклами дифференциального высаливания насыщенным раствором сульфата аммония.

Варианты С-концевого домена пг wac очищали при помощи аффинной хроматографии на колонке с Co-NTA смолой Talon (Clontech, США) в соответствии с инструкцией производителя. Предварительно очищенный высаливанием раствор целевого белка наносили на колонку с 1 мл смолы. После промывки 10 мл промывочного буфера (50 мМ натриево-фосфатный буфер (pH 7.0), 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазол), белок элюировали 2 мл буфера для элюции (pH 7.0), 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол). Затем раствор белка диализовали* против 500 мл буфера. для гидролиза тромбина (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 150 мМ NaCl, 2,5 тМ СаС12) в течение ночи при 4 °C.

После гидролиза тромбином, белки вновь диализовали против буфера для лизиса, затем проводили еще один цикл очистки на колонке с Co-NTA.

Степень очистки целевых оценивали при помощи ДСН-ПААГ электрофореза в 10% (пг wac и его N-концевой домен) или 15% (варианты С-концевого домена) акриламидном геле по методике Лэммли [Sambrook J. et al., 1989] с окраской Кумасси R-250, а также путем измерения соотношения оптической плотности раствора при длинах волн в 260 и 280 нм. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Брэдфорд, с использованием набора реактивов BioRad (Bio-Rad, США), согласно инструкции фирмы-изготовителя.

III.IX. Ограниченный протеолиз.

К белку в буфере 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 1 мМ СаСЬ добавляли трипсин (Serva, США) в различных соотношениях и инкубировали в течение 30 мин при 37 °C. Реакцию останавливали добавлением ФМСФ до концентрации 2 мМ. Затем добавляли двукратный буфер для образцов, нагревали 3−5 мин в кипящей воде и наносили на ПААГ с ДСН.

III.X. Гидролиз тромбином.

Для отщепления вариантов С-концевого домена пг wac от слитого с ними тиоредоксина, их обрабатывали сайт-специфической протеиназой тромбин (Novagen, США) согласно инструкции фирмы производителя. К 1 мл раствора целевого белка в концентрации 5 мг/мл в буфере для гидролиза тромбином добавляли 5 ед. активности тромбина, затем тщательно перемешивали и инкубировали при 37 °C в течении 1 часа.

III.XI. Спектрскопия кругового дихроизма.

Спектры кругового дихроизма целевых белков в дальнем ультрафиолете снимали при помощи спектрополяриметра Jasco J-810 (JASCO, Япония). Концентрация составляла 0,4 мг/мл в 10 мМ натриево-фосфатном буфере. Запись спектра производили при длине волны от 190 до 250 нм с шагом в 1 нм при 24 °C. Полученные данные были проанализированы на предмет наличия вторичных структур при помощи последних версий программ CONTINLL и CDSSTR (http://lamar.colostate.edu/~sreeram/CDPro/).

III.XII. Предсказание вторичной и третичной структуры.

Предсказанные аминокислотные последовательности мотивов пг wac бактериофага JS98C3, гомологичных фолдону фибритина фага Т4, а также данные, полученные в результате поиска их гомологов в GenBank (программа BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) анализировали при помощи программы Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera). В качестве шаблона для построения моделей предполагаемых вторичных и третичных структур использовали модель фолдона фибритина бактериофага Т4, депонированную в Protein Data Bank по результатам рентгеноструктурного анализа [Guthe S. et al., 2004].

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

IV.I. Изоляция нового Т-чётного бактериофага JS98C3.

В лаборатории вирусов микроорганизмов Института Микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН уже продолжительное время ведется работа по исследованию смешанных бактериально-фаговых сообществ из кишечника лошади [Куликов Е.Е. и соавт., 2007]. Мы провели скрининг коллекции полевых изолятов колифагов, полученных в ходе этого исследования, с целью обнаружения бактериофагов, родственных Т-чётным.

Вырожденные олигонуклеотидные праймеры к консервативным участкам гена 23, кодирующего основную субъединицу головки Т4-подобных бактериофагов были подобраны в 2000 г. группой Н.М. Krisch [Tetart F. et al., 2001]. За прошедшие годы эти олигонуклеотиды зарекомендовали себя как надежное и удобное средство для быстрой идентификации бактериофагов, родственных Т4, а также установления их систематического положения [Nolan J. et al., 2006, Yoshida Т. et al., 2006]. Нами были проскринированы путем ПЦР-амплификации экстракты ДНК из 50 фаговых бляшек различной морфологии, высеянных из фекалий лошади. Только в одном случае был получен ПЦР-продукт, который имел размеры около 540 п.о. Данный ПЦР-продукт был секвенирован с тех же олигонуклеотидных праймеров. Поиск гомологий в базе данных GenBank дал 95%-ное совпадение с последовательностью гена 23 бактериофага JS98, изолированного группой Н. Brussow в 2004 г. в Бангладеш из стула педиатрических пациентов с симптомами диареи [Chibani-Chennoufi S. et ah,. 2004]. Сконцентрированный и очищенный дифференциальным центрифугированием препарат фага был, исследован методами электронной микроскопии, его морфология оказалась крайне близкой к морфологии бактериофага Т4 (рис. 1).

Были секвенированы 3 случайных клона из полученной нами плазмидной библиотеки ДНК этого фага. Первый из этих клонов оказался фрагментом гена 55 (сигма-фактор РНК-полимеразы Т4-подобных фагов) и показал 88%-ное совпадение нуклеотидной последовательности с аналогичным геном фага .1598 (аминокислотная последовательность транслированного клона совпала на 96%).

Рис 7. Электронная микрофотография бактериофага № 98СЗ.

Последовательность второго клона, фрагмента гена 7 (одна из субъединиц базальной пластинки), имела гомологию в 87% (95% - в транслированном виде). Третий клон имел в транслированном виде 89% гомологию с предсказанной последовательностью большой субъединицы топоизомеразы II (пг 39) фага .1598. Нуклеотидные последовательности этих трех клонов депонированы в ОепВапк под номерами ЕР618 561Л, ЕИб 18 562.1 иЕР618 563.1 соответственно.

Таким образом, полученные данные подтвердили генетическое сходство фага Д598СЗ с фагом .1598.

Физико-химические условия, с которыми сталкиваются бактериофаги и их хозяева в кишечнике лошади, имеют массу отличий от условий кишечника человека, из которого был изолирован фаг JS98. Мы сделали предположение, что в силу этих отличий, компоненты молекулярного сенсора фага JS98C3, ответственного за предотвращение инфекции в неблагоприятных условиях, должны нести соответствующие изменения.

IV.II. Последовательность гена wac.

ПЦР-амплификация с использованием подобранных нами вырожденных олигонуклеотидных праймеров с последующим секвенированием ПЦР-фрагмента позволила нам определить полную последовательность гена wac фага JS98C3. Нуклеотидная последовательность этого гена депонирована в GenBank под номером EU2244220. Предсказанная аминокислотная последовательность N'-концевого участка пг wac (а.о. 1−48), имеющая значительную гомологию с последовательностью фибритина фага Т4, была практически идентичной в геномах фагов JS98C3 и JS98. Последующие 379 а.о. последовательности фибритинов фагов JS98C3 и JS98 также имеют высокую степень гомологии и сходны по своей гептадной coiled-coil периодичности с фибритином бактериофага Т4. Однако пг wac JS98 имеет дополнительный С-концевой домен, отсутствующий в пг wac фага Т4. Длина этого домена составляет 298 а.о. В фибритине фага JS98C3 также имеется «дополнительный» домен, однако его длина составляет только 54 а.о.

Последовательность С-концевой области пг wac фага JS98C3 почти идентична С-концевой последовательности пг wac фага JS98. Таким образом, по отношению к последнему пг wac фага JS98C3 имеет внутреннюю делецию 237 а.о. (Рис.2).

IV.HI. Последовательность гена 36.

Продукт гена 36 является одним из компонентов молекулярного сенсора Т4-подобных бактериофагов, «Колено» ДХФ (пгЗб) принимает участие в первой стадии приведения фибрилл в состояние «ир» в неблагоприятных условиях путем взаимодействия с С-концевым доменом фибритина.

27 я о ->

Рис. 8. Схема строения фибритинов бактериофагов Т4, № 98 и № 98СЗ. Овалами отмечены аминокислотные последовательности фолдонов.

Для того, чтобы выяснить, отразилась ли обнаруженная нами делеция в гене м? ас на последовательности гена 36, нами были подобраны вырожденные олигонуклеотидные ираймеры, фланкирующие данный ген. Полученный ПЦР-фрагмент по размерам и нуклеотидной последовательности оказался очень близким к гену 36 фага .1598 (номер в СепВапк Еи224 421). Аминокислотная последовательность, кодируемая данными генами, оказалась практически идентичной. Это говорит о том, что связывание ДХФ с фибритином у фагов Д598СЗ и⁹⁸ происходит за счет одинаковых белок-белковых взаимодействий.

262 а.о.

IV.IV. Анализ последовательности генов wac бактериофагов JS98 и JS98C3.

Для сравнения нуклеотидной последовательности генов wac фагов JS98 и JS98C3 мы использовали возможности программы Omiga 2.0 (Oxford Molecular LTD, США). Графические результаты анализа (рис. 9) подтверждают наше предположение о делеции в гене wac крупного фрагмента в регионе 1400−2100 о о -4 ю.

500 750 1000.

J598C3 gene wac.

Рис. 9. Dot Plot диаграмма выравнивания нуклеотидных последовательностей генов wac фагов JS98 и JS98C3.

Dot Plot выравнивание нуклеотидной последовательности гена wac фага JS98 саму на себя выявило в ее 3' - конце (регион 1800−2100) фрагмент, дважды содержащий прямой тандемный повтор (рис.10). Тандемные повторы в нуклеотидной последовательности бактериофагов, родственных Т4, а следовательно, имеющих сходный тип репликации ДНК (рекомбинационно-зависимый), несомненно говорят о том, что данный регион является горячей точкой рекомбинации и может устойчиво наследоваться только в случае, если дает бактериофагу несомненное селективное преимущество.

J S 9 8ge newac.

Рис. 10. Dot plot диаграмма выравнивания нуклеотидной последовательности гена wac бактериофага JS98 на саму себя.

Графическое отображение выравнивания нуклеотидной последовательности гена уас бактериофага, Г898СЗ на саму себя драматически отличается от подобного выравнивания гена м? ас фага 1Б98 (рис.11). Обращает на себя внимание практически полное отсутствие нуклеотидных повторов, и в целом картина этого выравнивания выглядит намного более уравновешенной, чем предыдущая. Это говорит о том, что вероятность гомологичной рекомбинации внутри гена wac фага JS98C3 значительно ниже, а, следовательно, этот ген гораздо более стабилен, чем соответствующий ген бактериофага JS98.

JS98C3 gene wac.

Рис. 11. Dot plot диаграмма выравнивания нуклеотидной последовательности гена wac бактериофага JS98C3 на саму себя.

Помимо поиска нуклеотидных повторов в последовательностях генов уас фагов .189 803 и 1898, мы провели поиск повторов аминокислотных последовательностей. Как показали результаты анализа обнаруженных аминокислотных повторов (Табл. 1), все выявленные нами ранее нуклеотидные тандемные повторы оказались в одной рамке считывания, а кодируемые ими аминокислотные последовательности имеют высокую степень гомологии. Кроме того, в аминокислотной последовательности гена ¥-ас фага 1898СЗ мы обнаружили короткий (17 а.о.) фрагмент, высоко гомологичный повторам из последовательности пг уас бактериофага 1598.

Табл. 1.

Аминокислотные повторы в пг wac бактериофага JS98. Серым цветом выделена строка с гомологичной аминокислотной последовательностью из пг wac фага JS98C3.

Аминокислотная последовательность Положение Размер, а.о.

1 KIAPLTTRVTTAEGKITTLETGLAAVKVESD 601 31.

2 KVAGINTRLGTAEGDIGTLKTGLAEVKGESD 632 31 з KVAAIDTRLGWEGEVGTLETGLAAVKVESD 663 31.

4 1 KVADLGTRLTAAEGKITALETELS———- 694 24.

————LLEAEGKimLETEMAK——— 4S8 Г. 17.

IV.V. Экспрессия фибритина бактериофага JS98C3.

Фрагмент генома фага 1S98C3 содержащий ген wac с естественным сайтом инициации трансляции был амплифицирован при помощи олигонуклеотидов, комплементарных 3'-концу гена 12 и 5'- концу гена 13, и клонирован в плазмидный вектор pGEM-T. ПЦР-амплификацией были отобраны клоны с ориентацией вставки, совпадающей с ориентацией промотора Т7 РНК-полимеразы.

Для нативной тримерной молекулы фибритина была показана способность к ренатурации после нагревания, а также свойства ограниченной устойчивости к ДСН (додецилсульфату натрия) и ограниченной устойчивости к действию протеаз [Boudko S. et al., 2002]. Экспрессия гена wac в клетках Е. coli BL21 (DE3) под контролем Т7 промотора привела к суперпродукции растворимого и ограниченно ДСН-устойчивого фибритина. Олигомерность белка анализировали путем электрофореза в 10% ДСН-ПААГ, на который наносили препараты белка в стандартном ДСН-буфере для образцов.

Образцы были нанесены в двух вариантах: в первом варианте перед нанесением их прогревали 3−5 мин на кипящей водяной бане, во втором варианте их наносили сразу же после смешивания белкового препарата с буфером для образцов (рис. 12).

Не прогретые образцы после окрашивания давали тонкую, высокоплотную полосу в верхней части геля, которая свидетельствует о том, что целевой белок находится в ДСН-устойчивом олигомерном состоянии.

166,0 66,2.

45,0 35,0.

18,4.

Рис. 12. Анализ экспрессии пг м? ас фага № 98СЗ и его трипсинолиза в 10% ПААГ-ДСН: 1 — маркеры молекулярного веса- 2 — осветленный лизат- 3 -не прогретый перед нанесением осветленный лизат в ДСН-буфере для образцов- 4 — высоленный препарат пг и>ас- 5 — тот же препарат, не прогретый перед нанесениемб — пг ц? ас после обработки трипсином в концентрации 0,01 мг/мл- 7 — он же, не прогретый перед нанесением- 8 — пг XVас после обработки трипсином в концентрации 0,05 мг/мл- 9 — тот же препарат, не прогретый перед нанесением.

IV.VI. Ограниченный протеолиз фибритина бактериофага Ш8СЗ.

Для подтверждения того, что фибритин фага 1898СЗ образует компактную нативную структуру, мы подвергли его ограниченному протеолизу. К очищенному препарату фибритина в буфере для гидролиза мы добавляли трипсин в разных концентрациях." После 30 мин гидролиза при 37 °C мы останавливали реакцию добавлением ФМСФ и анализировали продукты гидролиза электрофорезом в 10% ДСН-ПААГ (рис. 12).

Анализ геля показал, что молекулярная масса пг м? ас после гидролиза трипсином несколько уменьшается, однако, даже при внесении трипсина до концентрации 0.05 мг/мл данный белок не гидролизуется полностью и остается олигомерным. Это свидетельствует об эффективном сворачивании исследуемого белка в компактную нативную структуру. Следовательно, имеющаяся делеция в «дополнительном» С-концевом домене не препятствует нормальному фолдингу этого белка.

1У.УП. Экспрессия фибритина фага 1Б98СЗ с делецией части С-концевого домена.

Для установления влияния С-концевого домена на фолдинг пг vcic фибритина фага 1Б98СЗ, нами был получен его делеционный вариант, оканчивающийся на С-конце • стоп-кодоном в регионе, в котором происходит терминация трансляции гена м>ас бактериофага Т4 (сразу же за первым фолдоном). Для амплификации и секвенирования этого фрагмента гена мы использовали олигонуклеотидные праймеры 18Т12ир и ]зКс11о (рис. 13). Исходя из степени гомологии между фолдоном фибритина бактериофага Т4 и аминокислотным мотивом, фланкирующим проклонированнуюнами последовательность, мы ожидали получить в результате экспрессии растворимый олигомерный и ДСН-устойчивый продукт. Однако уровень экспрессии оказался крайне низким, на уровне мажорных клеточных белков. Исходя из полученных данных, мы предполагаем, что наличие аминокислотного мотива, гомологичного фолдону фибритина фага Т4 не обеспечивает быстрого принятия молекулой пг vcic фага 1Б98СЗ нативной конформации. Белок, находящийся в состоянии «расплавленной глобулы» в течение продолжительного времени, становится уязвимым для клеточных протеаз, чем и объясняется наблюдаемое нами небольшое количество растворимого белкового продукта.

3 4 —>—>

12 wac.

I < I I I I.

Рис. 13. Схема расположения олигонуклеотидных праймеров, использованных в работе. 1 — ЗБТ12ир, 2 — JSglЗlo, 3 — ]зСс1ир, 4 — ]зСс12ир, 5 — ]$СсИо, 6 —/уТУ^/о. Серыми прямоугольниками отмечены последовательности, кодирующие аминокислотные мотивы, гомологичные фолдону бактериофага Т4. 1.

1У.УШ. С-концевой домен фибритина фага JS98CЗ.

Для того, чтобы выяснить, способен ли С-концевой домен фибритина фага 1898СЗ к самостоятельной тримеризации, мы проклонировали последовательность, кодирующую С-концевой домен в плазмидный вектор. Подобранные нами олигонуклеотидные праймеры ]зСс!ир ]зСс!2ир и jsCdlo (рис. 13) позволили нам амплифицировать и проклонировать последовательность С-концевого домена в двух вариантах: как с мотивом, гомологичным фолдону фибритина фага Т4 на N-конце, так и без него.

В силу того, что небольшие размеры С-концевого домена представляют препятствие для его экспрессии и осложняют манипуляции по очистке, мы проклонировали кодирующие его последовательности в плазмидный вектор рЕТ-32а, в одной рамке считывания с тиоредоксином Е. coli (рис. 14).

T-N и.

2 Thioredoxin.

C-domain.

Рис. 14. Схема участка плазмидной конструкции с С-концевым доменом фибритина фага JS98C3. Цифрами обозначены: 1 — промотор Т7 РНК-полимеразы- 2 — 6xHis tag- 3 — сайт узнавания сайт-специфической протеиназы тромбин.

Экспрессия С-концевого домена пг wac с такой относительно крупной глобулярной структурой как тиоредоксин на N-конце также позволяет оценить его способность образовывать стабильные химерные тримеры.

Таким образом, нами были получены плазмидные конструкции pETCd (С-концевой домен обоими фолдонами) и pETCd2 (тот же домен без N-концевого фолдона). Соответствие нуклеотидной последовательности вставок расчетным последовательностям в обеих конструкциях было проверено секвенированием.

Белки, представляющие собой варианты С-концевого домена фибритина фага JS98C3, экспрессировались в Е. coli в количестве, превышающем 40% суммарного клеточного белка. Их электрофоретическая подвижность в 15% ДСН-ПААГ в прогретых образцах соответствовала предсказанной молекулярной массе (рис. 15). Не прогретые перед нанесением образцы дали на ПААГ полосы, характерные для олигомерных белков, в верхней части геля. Мы очистили белки из осветленного лизата путем аффинной хроматографии на Со-ЫТА, после чего отщепили тиоредоксин гидролизом их сайт-специфической протеиназой тромбин. Следующий цикл очистки на Со-ЫТА позволил нам очистить белки от тиоредоксина, который остался связанным со смолой. Целевые белки прошли через колонку в свободном объеме сорбента. После промывки промывочным буфером, мы элюировали тиоредоксин имидазолом, для того, чтобы убедиться в полноте гидролиза тромбином.

18,4 14,4.

250,0 1150,0 -100,0 -75,0.

— 50,0 -37,0.

— 25,0.

•<-20,0.

4−15,0 м-10,0 1 8.

Рис. 15. Анализ очистки вариантов С-концевого домена фибритина бактериофага № 98СЗ в 17% ДСН-ПААГ. Порядок нанесения: 1,10-маркеры молекулярной массы- 2, б — тотальный препарат белков: с двумя фопдонами и без первого фолдона соответственно- 3, 7 — те же препараты, не прогретые перед нанесением- 4, 8 — второй этап очистки на Со-МТА (после гидролиза тромбином) с двумя фолдонами и без первого фолдона соответственно- 5, 9 — те же препараты, не прогретые перед нанесением.

Не прогретые перед нанесением на ПААГ образцы элюата не показали аномальной подвижности, характерной для олигомеров, в то время как образцы целевого белка из фракции «проскока» этим свойством обладали.

Это говорит о том, что гидролиз рекомбинантных вариантов С-концевого домена пг vcic прошел полностью.

В процессе очистки варианта С-концевого домена пг час. без 1Ч-концевого фолдона, нами было показано его уникальное свойство: частично сохранять условно нативную конформацию после прогревания образца с ДСН до 90 °C в течении 5−6 минут. Полная утрата олигомерной конформации данным белком происходила только прогревания его препарата с ДСН-буфером в течении 10−12 минут.

Подобное свойство, ранее показанное только для фолдона пг 5 бактериофага Т4 [К.А. Мирошников, личное сообщение] говорит об очень высокой энергии, необходимой для плавления данного домена, либо о его способности к очень быстрой эффективной тримеризации, и может быть использовано для конструирования химерных тримерных белков.

1У.1Х. Спектроскопия кругового дихроизма.

Нами были сняты спектры кругового дихроизма полноразмерного фибритина фага 1Б98СЗ и его делеционных вариантов. Математическая обработка полученных спектров показала высокое содержание альфа-спиральных вторичных структур во всех исследованных образцах. Эти данные подтверждают наши предположения о высоком сходстве между вторичными и третичными структурами фибритинов бактериофагов Т4 и 1598СЗ. Обращает на себя внимание резкое отличие в соотношениях альфаи бетаструктур между двумя делеционными вариантами С-концевого домена фибритина. Выявленное большее количество альфа-спиралей в варианте С-концевого домена фибритина с одним фолдоном говорит в пользу того, что отсутствующий в этом белке 1Ч-концевой фолдон действительно представляет собой бета-пропеллерную структуру (рис. 16, табл. 2).

Табл. 2.

Содержание элементов вторичных структур в целевых белках, рассчитанное по данным спектроскопии кругового дихроизма.

Содержание элементов вторичной-структуры,^ % альфабетаБета;

Образец спираль лист поворот. непериодическая.

Полноразмерный фибритин 38 16 18 28.

С-концевой домен с двумя фолдонами 25 20 22 33.

С-концевой домен с одним фолдоном 42 16 14 28 зоооо К.

2 20 000 м 10 000 i о л ®.

— 10 000.

— 20 000.

— г.

Полноразмерный фибритан С-концееой домен с двумя фолдонами.

—-С-концееой домен с одним фолдоном.

210 т.

230 I.

А, нм т.

Рис. 16. Спектры кругового дихроизма в дальней УФ области фибритина фага № 98СЗ и его делеционных вариантов.

IV.X. Поиск последовательностей, гомологичных фолдону фибритина фага Т4 в GenBank.

Современные данные говорят о том, что фолдон фибритина бактериофага Т4 представляет собой энергетически выгодное и очень стабильное состояние белковой молекулы [Guthe S. et al., 2004]. Ранее эта структура считалась уникальной. Обнаруженные нами в фибритине фага JS98C3 аминокислотные последовательности имеют высокую степень гомологии с фолдоном фибритина фага Т4, а показанные физическими методами их свойства говорят об их сходной функциональной нагрузке.

Факт того, что в фолдонах фаговых фибрилл возможны отклонения от «канонической» последовательности фолдона фибритина фага Т4, позволил нам сделать предположение о возможной широкой распространенности различных вариантов данного фолдона. В связи с этим, нами был произведен поиск гомологий в базе данных GenBank.

Для поиска нами была использована программа BLAST. В качестве матрицы для запроса мы использовали аминокислотные последовательности фолдонов пг wac фага Т4, а также изолированного нами фага JS98C3. Извлеченные таким образом из базы данных последовательности были выровнены при, помощи программы ClustalW 1.4. (рис. 17).

Данные гомологи были выявлены не только в последовательностях фибритинов бактериофагов, родственных Т4, но и в предполагаемых аминокислотных последовательностях белков некоторых бактериофагов, относящихся к семейству Siphoviridae. Обращает на себя тот факт, что в нескольких случаях, при больших размерах белка, фолдон-подобные последовательности встречались неоднократно, например, в белке хвостовой фибриллы бактериофага.

ВсерЫаг^! или в фибритине родственного Т4 фага АеИ1. Кроме того, последовательность, гомологичная фолдону фибритинаТ4 была обнаружена в предсказанной аминокислотной последовательности гипотетического белка ОЬешОКАРТ3444 бактерии ОеоЬаМег Ьет1(1]1ет18 Вет.

Рис. 17. Выравнивание аминокислотных последовательностей выявленных нами гомологов фолдона фибритина фага Т4.

IV.XI. Моделирование вторичных и третичных структур фолдонов фибритина бактериофага JS98C3 in silico.

Мы построили модели вторичных и третичных структур фолдонов фибритина фага JS98C3 при помощи программы Chimera. В качестве матрицы для построения структур нами была использована pdb-модель фолдона фибритина фага Т4 1RFO (рис. 18), депонированная в базе данных Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) под номером PF07921.

Моделирование in silico возможных вторичных и третичных.

Т4.

RB32 RB69 KVP40.

Geobacter bemidjiensis Bern.

BcepNazgull.

BcepNazgul2.

BcepNazgul3.

BcepNazgul4.

JS98-C31.

JS98-C32.

JS981.

JS982.

D3112.

MP22.

RB49.

DMS3.

Aehll.

Aehl2.

Aehl3.

BcepFl.

— GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL—GYIPEAPKDGQAYVRKDGEWVbLSTFL—GYIEDAPSDGKFYVRKDGANVELPTA—.

— D GVLEAPAD GQE Y VRKD FQWVL P T Y PT —GAVGDAPKDGKLYVRQNGRWVELVTAA—GGIPDAPSDGVGYARKDGGWTPVATGS.

— SGIPEAPADGKQYARKNSGWAEVQIPA-TAGIADAPSDGTKYMRQNGTWASFFTK—.

— G GIPD APNN AN Q Y TRG QATRNVLGAFV.

— TKLGDAPADSKLYGRKDAAWAEILDDT—RPPVAPTADGLPYVLVDNAVIVLLSDFV—GKLGDAPSD GKL Y &RRN AAWRE WWN S —RPPVAPAADGLPYVLVDNAWVLLSDFV—GGMADAPSDGSNYARNHGEWGKLGTAA—GGMSDAPSDGSHYARNNGAWGKLGTAA—NKVDDVPDDGFHYbRKRGEWVQVAYAA—GGMADAPSDGKRYARLNNAWAGLGTAA-HDGL-DAPKDDAMYARKNGVWTAFNPGG HDGI-DAPSDGSYYARNNGTWQKVFN-GVTSAFDVPTDDKRYSRRNGKWIQSYYYG—GGIQDAPDDGFPYVRDSKEWSRLQGLSструктур фолдонов фибритина бактериофага 1898СЗ показало высокую степень их сходства с вторичными и третичными структурами фолдона фибритина фага Т4.

Построенные нами модели с некоторой степенью достоверности объясняют результаты экспериментов с экспрессией делеционных вариантов пг м? ас фага 1898СЗ:

1) Недостаточная эффективность фолдинга, а, следовательно, и низкий уровень экспрессии варианта фибритина без части С-концевого домена можно объяснить более релаксированной по сравнению с фолдоном фибритина фага Т4 структурой К-концевого фолдона (рис. 18,19).

2) Сохранение частично олигомерного состояния С-концевого домена после прогревания с ДСН возможно объяснить наличием в С-концевом фолдоне дополнительному альфа-спирального участка, не характерного для фолдона фибритина фага Т4. Этот участок предположительно стабилизирован относительно полипептидной цепи двумя водородными связями, и придает третичной структуре фолдона дополнительную жесткость, а также повышает температуру его плавления (рис. 20, 21, 22).

Рис. 18. Модель четвертичной структуры фолдона фибритина фага Т4.

Рис. 19. Модель четвертичной структуры первого фолдона фибритина фага № 98СЗ.

Рис. 20. Модель четвертичной структуры второго (С-концевого) фолдона фибритина фага Ц898СЗ. Стрелкой показан дополнительный участок альфа-спирали.

Рис. 21. Предсказанная третичная структура С-концевого фолдона фибритина фага № 98СЗ. Показаны водородные связи. ь 9.

Рис. 22. Наложение третичной структуры фолдона фибритина фага Т4 и С-копцевого фолдона фибритина фага^98СЗ. Светлосерым цветом обозначен фолдон фибритина фага Т4.

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

V.l. Изоляция бактериофага JS98C3, близкородственного фагу JS98.

Изоляция нами бактериофага JS98C3, имеющего очень высокую гомологию нуклеотидной последовательности с бактериофагом JS98 не оставляет никаких сомнений в том, что бактериофаги Е. coli имеют очень большую географическую мобильность. Учитывая крайне высокие темпы эволюции геномов Т4-подобных фагов, основанную на механизме репликации их ДНК, можно с уверенностью сказать, что фаги JS98C3 и JS98 произошли от общего предка совсем недавно. Этот вывод подтверждается не только высокими гомологиями в их генах, находящихся в «коровых» по определинию Г. Криш регионах, но и почти полной идентичностью последовательностей генов wac (естественно, не принимая во внимание делецию), которые относятся к гиперпластичным областям геномов [Comeau A.M. et al., 2007].

Случай с обнаруженной нами парой близкородственных Т4-подобных бактериофагов предоставляет исследователям уникальную возможность выяснить, путем полного определения нуклуотидной последовательности фага JS98C3, в каких направлениях происходит дивергенция, и в каких локусах она происходит в первую очередь.

V.U. Анализ нуклеотидной последовательности гена wac фага JS98C3.

Многообразие С-концевых модулей у бактериофагов, родственных Т4, представляет собой эволюционную загадку [Летаров А.В., 2004]. Существенно отличающиеся по размеру и предполагаемым вторичным структурам, эти домены либо замещают С-концевой домен (фолдон) фибритина фага Т4, являющегося наиболее просто устроенной структурой, либо следуют прямо за ним в виде «довеска» как у фагов 1898 и 1898СЗ. Подобное многообразие до сих пор не имеет адекватного объяснения: участки белка, инициирующие его фолдинг, обычно бывают эволюционно консервативны. Высокая частота модульных перестановок в этой области фибритина свидетельствует о том, что вирусы получают заметное селективное преимущество в результате части таких событий.

Мы предполагаем, что система, при которой фибритин связывается своим С-концевым доменом с пг 36 в составе длинной хвостовой фибриллы, может действовать не только по схеме, описанной для фага Т4, когда в неблагоприятных условиях при сравнительно коротком фибритине его взаимодействие с ДХФ приводит последнюю в поднятое состояние. Возможно, что данная система у других бактериофагов, родственных Т4, может действовать еще и в другом направлении, а именно, при благоприятных условиях удерживать ДХФ на расстоянии, наиболее способствующем взаимодействию фагового адгезина с молекулой-рецептором4 на поверхности бактериальной клетки. Подобное ограничение степени подвижности ДХФ может принести бактериофагу некоторые экологические преимущества, в частности, повышать скорость адсорбции в благоприятной для этого ситуации. Это предположение согласуется с наличием в последовательностях многих «новых» С-доменов аминокислотного мотива, соответствующего фолдону бактериофага Т4 — предполагаемому региону взаимодействия фибритина с пг 36.

Возможно также, что у некоторых фагов С-концевые домены фибритина играют роль дополнительных адгезинов, взаимодействующих с рецепторами на поверхности клеток бактерий, увеличивая, таким образом, вероятность адсорбции фага в условиях низкой плотности клеток-хозяев [Летаров A.B., 2004].

Отдельно стоит остановиться на тандемных повторах, обнаруженных нами в нуклеотидной последовательности гена wac бактериофага JS98. На данный момент представляется затруднительным с точностью найти объяснение наличию такого количества высоко гомологичных последовательностей в пределах одного гена. Однако, мы можем сделать несколько выводов-предположений :

1) Четырежды повторяющиеся аминокислотные мотивы могут нести какую-либо функциональную нагрузку, и давать бактериофагу соответствующее селективное преимущество. За счет этого ген с прямыми нуклеотидными повторами стабильно наследуется.

2) Возможно, это преимущество достигается только за счет вынесения С-концевого фолдона (который может являться областью связывания с ДХФ) на определенное расстояние от фаговой частицы. Структура несомненно, была собрана из тех модулей, которые были доступны для рекомбинации, и подошли по стерическим требованиям, а содержит повторы в силу недостатка материала.

3) Структура, содержащая эти повторы, возникла по эволюционным меркам совсем недавно, в результате дупликации, а потому еще не накопились синонимичные нуклеотидные замены, которые могли бы предотвратить рекомбинационное событие.

4) Наличие в фибритине фага JS98C3 фрагмента, высоко гомологичного аминокислотным повторам из пг wac фага JS98, может свидетельствовать о том, что некоторое время назад произошло вышеупомянутое рекомбинационное событие, которое и привело к делеции части гена в регионе 1400−2100.

У.Ш. Новые гомологи фолдона фибритина фага Т4.

Для нас не стал неожиданностью тот факт, что аминокислотные мотивы, гомологичные фолдону фибритина фага Т4 были обнаружены в последовательностях белков других бактериофагов. Физико-химические свойства фолдона фибритина фага Т4 говорят о том, что этот белок — исключительно сбалансированный и эволюционно оптимизированный домен тримеризации. Вполне очевидно, что подобные структуры должны широко использоваться для сходных целей в сходных по структурной организации белках.

Гораздо больше нас удивило большое количество отличий этих мотивов от «канонической «последовательности фолдона. Причем, эти отличия, при явной функциональности белка (как в случае с вторым фолдоном фага 1898СЗ), затрагивают аминокислоты, считающиеся на данный мемент крайне важными при образовании внутримолекулярных связей в процессе тримеризации домена.

Исходя из последовательности второго фолдона фибритина бактериофага 1898СЗ, о котором мы, основываясь на экспериментальных данных, можемс уверенностью говорить как о домене, эффективно тримеризующем большую тримерную молекулу фибритина, можно сделать вывод, что в нем не образуется солевого мостика Е5-Я15 «канонического» фолдона. При этом, аминокислотная последовательность, необходимая для формирования бета-шпильки, необходимой для тримеризации, в нем присустствует, что подтверждается т зШсо расчетами на основании большинства современных алгоритмов предсказания вторичных структур.

Подобное расхождение с экспериментально подтвержденной «идеальной» структурой можно объяснить:

1) тем, что структура второго фолдона фага JS98C3 более прочна за счет участка альфа-спирали между листами бета-шпильки;

2) молекулярный сенсор бактериофага JS98C3 рассчитан на ответ на иные физико-химические условия, чем сенсор фага Т4;

3) функция второго фолдона — только инициация тримеризации фибритина. 1.

Стоит несколько более подробно остановиться на предпосылках ко второму из вышеперечисленных объяснений. По не вполне ясной причине, исследователи, занимающиеся структурными белками бактериофага Т4, до настоящего момента так и не провели параллелей между работами Майера [Meier S. et al., 2004] и более ранними работами Фоллансби и Конли [Conley М.Р. et al., 1975, Follansbee S.E. et al., 1974]. Обобщая результаты этих работ, можно сделать предположение, что компонентом молекулярного сенсора (или одним из этих компонентов), реагирующим на изменения внешней среды, такие как понижение рН, у фага Т4 является именно фолдон фибритина.

Диссоциация фолдона на мономеры вполне может экспонировать аминокислоты, участвующие во взаимодействии «фибритин-ДХФ». При этом экспонируемые аминокислоты, скорее всего, располагаются в прилежащей к бета-шпильке петле, гомологии в которой, несмотря на ее нерегулярную структуру, не имеющую, до определенных пределов, влияния на. тримеризацию домена, прослеживаются среди всех вновь обнаруженных последовательностей.

Плавление при низких значениях рН гомологов фолдона фибритина Т4 может также в какой-то мере объяснить и множественность некоторых из этих доменов в соотвествующих белках. Учитывая то, что ДХФ закреплены на базальной пластинке довольно пластично, вполне адекватно наличие на фибртине нескольких центров, способных их связать, особенно в тех случаях, когда сенсор должен отреагировать на изменение условий максимально быстро.

Также можно допустить, что некоторые из этих доменов могут диссоциировать на мономеры и экспонировать активные центры в ответ на иные факторы, нежели низкий рН. Подобное допущение вполне укладывается в нашу гипотезу о возможном действии молекулярного сенсора в ответ на факторы, располагающие к инфекции. Кроме того, разные разновидности фолдона, реагирующие на различные факторы внешней среды, и расположенные на одном фибритине, могли бы обеспечивать многофункциональность молекулярного сенсора.

VI. выводы.

1. Изолирован новый Т4-подобный энтеробактериофаг 1898СЗ. В последовательности фибритина этого бактериофага обнаружены аминокислотные мотивы, имеющие высокую степень гомологии с фолдоном фибритина фага Т4.

2. Показано, что С-концевой домен фибритина бактериофага 1898СЗ способен к эффективной автономной тримеризации, что делает перспективным использование входящих в его состав фолдонов в белковой инженерии в качестве модулей, инициирующих фолдинг химерных белков.

3. В результате проведенного поиска в базе данных ОепВапк выявлено 16 новых аминокислотных мотивов, гомологичных фолдону фибритина фага Т4. Девять из вновь обнаруженных последовательностей находятся в последовательностях белков, не родственных фибритину, бактериофагов, относящихся к семейству Siphovirid. de, что говорит о широкой распространенности подобных структур.

4. 1п бШсо моделирование вторичных и третичных структур вновь обнаруженных нами в ОепВапк аминокислотных мотивов подтвердило предположение о сходстве их конформации с фолдоном фибритина бактериофага Т4, что может свидетельствовать об их сходной роли в фолдинге соответствующих белков.

1. Куликов Е. Е Биоразнообразие и динамика бактериофагов фекалиях лошади. / Е. Е. Куликов, А. С. Исаева, А. С. Роткина, А. А. Маныкин, А. В. Летаров. // Микробиология. — 2007. — Т. 76. — С. 271 278.

2. Летаров А. В. Эволюционная динамика, фолдинг и функция некоторых фибриллярных белков бактриофагов, родственных Т-чётным фагам энтеробактерий / А. В. Летаров // Труды ИНМИ им. С. Н. Виноградского. — 2004. — Вып. XII. — С. 269−284.

3. Abkevich V.I. Specific nucleus as the transition state for protein folding: evidence from the lattice model / V.I. Abkevich, A.M. Gutin, E.I. Shakhnovich // Biochemistry. — 1994. — V. 33. — P. 10 026−10 036.

4. Akhter T. The neck of bacteriophage T4 is a ring-like structure formed by a hetero-oligomer of gpl3 and gpl4 / T. Akhter, L. Zhao, A. Kohda, K. Mio, S. Kanamaru, F. Arisaka // Biochim. Biophys. Acta. -2007. — V. 1774. — No. 8. — P. 1036−1043.

5. Altschul S.F. Basic local aligment tool / S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, D. Lipman // J. Mol. Biol. — 1990. — V. 215. — P. 403−410.

6. Anfinsen C.B. The kinetics of formation of native ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain / C.B. Anfinsen E. Harber, M. Jr. Sela, F.H. White // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1961. — V. 47. — P. 1309−1314.

7. Bailey T. Score distributions for simultaneous matching to multiple motifs / T. Bailey and M. Gribskov // J. Comput. Biol. — 1997. -V. 4. — P. 45−59.

8. Baldi P., Hidden markov models of biological primary sequence information / P. Baldi, Y. Chauvin, T. Hunkapiller, M.A. McClure // Proc.

Natl Acad. Sci. USA, — 1994. — V. 91. — P. 1059−1063.

9. Baiter M. Virology. Evolution on life’s fringes / M. Baiter // Science. — 2000. — V. 289. — No. 5486. — P. 1866−1867.

10. Boudko S. Domain organization, folding and stability of bacteriophage T4 fibritin, a segmented coiled-coil protein / S. Boudko, Y. Londer, A. Letarov, N. Sernova, J. Engel and V. Mesyanzhinov // Eur. J. Biochem. — 2002. — V. 269. — P. 833−841.

11. Boudko S.P. Design and crystal structure of bacteriophage T4 mini-fibritin NCCF / S.P. Boudko, S.V. Strelkov, J. Engel, J. Stetefeld // J Mol Biol. — 2004. — V. 339. — P. 927−35.

12. Bowie J. A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure / J. Bowie R. Liithy, D. Eisenberg // Science, -1991. — V. 253. — P. 164−170.

13. Brussow H. Phage genomics: small is beautiful / H. Brussow, R.W. Hendrix // Cell. — 2002. — V. 108. — No. 1. — P. 13−16.

14. Chibani-Chennoufi S. Isolation of Escherichia coli bacteriophages from the stool of pediatric patients in Bangladesh / S. Chibani-Chennoufi, J. Sidoti, A. Bruttin, M.-L. Dillmann, E. Kutter, F. Qadri, S.A. Sarker, H. Briissow. // J. Bacterid., 2004, V. 186, No 24. — P. 8287−8294.

15. Comeau A.M. Modular architecture of the T4 phage superfamily: a conserved core genome and a plastic periphery A.M. Comeau, C. Bertrand, A. Letarov, F. Tetart, H.M. Krisch // Virology. — 2007. — V. 362. — No. 2. — P. 384−96.

16. Conley M.P. Bacteriophage T4 whiskers: a rudimentary environment-sensing device / M.P. Conley, W.B. Wood // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1975. — V. 72. — No 9. — P. 3701−3705.

17. Coombs D.H. Studies on the structure, protein composition, and assembly of the neck of bacteriophage T4 / D.H. Coombs, F.A. Eiserling. // J. Mol. Biol. — 1977. — V. 116. — No 3. — P. 357−405.

18. Demerec M. Bacteriophage-Resistant Mutants in Escherichia Coli M. Demerec and U. Fano // Genetics. — 1945. — No 30. — P. 119−136.

19. Dickson R. Structural proteins of bacteriophage T4 / R. Dickson, S. Barnes, F. Eiserling // J Mol Biol. -1970. — V. 53. — P. 461−74.

20. Doermann A.H., Genetic control of capsid length in bacteriophage T4: clustering ofptg mutations in gene 23 / A.H. Doermann, A. Pao, and P. Jackson // J. Virol. — 1987. — V. 61. — P. 2823−2827.

21. Edgar R. COACH: profile-profile alignment of protein families using hidden markov models / R. Edgar and K. Sjolander // Bioinformatics.

— 2004. — V. 20 — P. 1309−1318.

22. Edgar R. Simultaneous sequence alignment and tree construction using hidden Markov models / R. Edgar and K. Sjolander // Bioinformatics. — 2003. — V. 19. — P. 1404−1411.

23. Efimov V.P. Fibritin encoded by bacteriophage T4 gene wac has a parallel triple-stranded alphahelical coiled-coil structure / V.P. Efimov, I.V. Nepluev, B.N. Sobolev, T.G. Zurabishvili, T. Schulthess, A. Lustig, J. Engel, M. Haener, U. Aebi, S. Venyaminov // J. Mol. Biol. — 1994. — V. 242. — No 4. — P. 470¹⁸⁶.

24. Espinosa J.F. Interplay between hydrophobic cluster and loop propensity in beta-hairpin formation / J.F. Espinosa, V. Munoz & S.H. Gellman // J. Mol. Biol. — 2001. — V. 306. — P. 397-^02.

25. Fersht A.R. Nucleation mechanisms in protein folding / A.R. Fersht // Curr. Opin. Struct. Biol. — 1997. — V. 7. — P. 3−9.

26. Filee J. A selective barrier tohorizontal gene transfer in the T4-type bacteriophages that has preserved acore genome with the viral replication and structural genes / J. Filee, E. Bapteste, E. Susko, H.M. Krisch // Mol. Biol. Evol. — 2006. — V. 23. — P. 1688−1696.

27. Fokine A. Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4 / A. Fokine, P.R. Chipman, P.G. Leiman, V. V Mesyanzhinov, V.B. Rao, M.G. Rossmann // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

— 2004. — V. 101. — No. 16. — P. 6003−6008.

28. Follansbee S.E. A new set of adsorption mutants of bacteriophage T4D: Identification of a new gene / S.E. Follansbee, R.W. Vanderslice, L.G. Chavez, C.D. Yegian // Virology. — 1974. — V. 58. — P. 180−199.

29. Frank S., Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering / S. Frank, R.A. Kammerer, D. Mechling, T. Schulthess, R.J.B. Landwehr, Y. Guo et al. // J. Mol. Biol. — 2001. — V. 308. — P. 1081−1089.

30. Frydman J. Principles of chaperone-assisted protein folding: differences between in vitro and in vivo mechanisms / J. Frydman, F.U. Hartl // Science. — 1996. — V. 272. — P. 1497−1502.

31. Fuhrman J.A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects / J.A. Fuhrman // Nature. — 1999. — V. 399. — No. 6736. — P. 541−548.

32. Games D. Mice as models: transgenic approaches and Alzheimer’s disease / D. Games, M. Buttini, D. Kobayashi, D. Schenk, P. Seubert // J. Alzheimers Dis. — 2006. — V. 9. — P. 133−149.

33. Gough J. Assignment of homology to genome sequences using a library of hidden markov models that represent all proteins of known structure / J. Gough, K. Karplus, R. Hughey, C. Chothia // J. Mol. Biol., -2001. — V. 313. — P. 903−919.

34. Guthe S. Very Fast Folding and Association of a Trimerization Domain from Bacteriophage T4 Fibritin / S. Guthe, L. Kapinos, A. Moglich, S. Meier, S. Grzesiek and T. Kiefhaber // J. Mol. Biol. — 2004. -V. 337. — P: 905−915.

35. Halaby D.M. The immunoglobulin fold family: sequence analysis and 3D structure comparisons /D.M. Halaby, A. Poupon, and J. Mornon // Protein Eng. — 1999. — V. 12. — P. 563−571.

36. Hambly E. A conserved genetic module that encodes the major virion components in both the coliphage T4 and the marine cyanophage S-PM2 / E. Hambly, F. Tetart, C. Desplats, W.H. Wilson, H.M. Krisch, N.H.

Mann // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 2001. — V. 98. — No. 20. — P. 11 411−11 416.

37. Harris D.A. A murine model of a familial prion disease / D.A. Harris, R. Chiesa, B. Drisaldi, E. Quaglio, A. Migheli, P. Piccardo, B. Ghetti // Clin. Lab. Med. — 2003. — V. 23. — P. 175−186.

38. Helles G. A comparative study of the reported performance of ab initio protein structure prediction algorithms / G. Helles // J R Soc Interface. — 2007. — [Epub ahead of print].

39. Hendrix R.W. Bacteriophages with tails: chasing their origins and evolution / R.W. Hendrix, G.F. Hatfull,, M.C. Smith, // Res. Microbiol. -2003.-V. 154.-P. 253−257.

40. Hensley K. On the relation of oxidative stress to neuroinflammation: lessons learned from the G93A-SOD1 mouse model of amyotrophic lateral sclerosis / K. Hensley, M. Mhatre, S. Mou, Q.N. Pye, C. Stewart, M. West, K.S. Williamson // Antioxid. Redox Signal. — 2006. -V. 8. — P. 2075;2087.

41. Ivanitskii G.R. Does taxis exist in bacterial viruses? / G.R. Ivanitskii, A.B. Medvinskii, A.A. Deev, A.A. Khusainov, M.A. Tsyganov // Biofizika. — 1995. — V. 40. — No. 1. — P. 60−73.

42. Jackson S.E. Folding of chy mo trypsin inhibitor Evidence for a two-state transition / S.E. Jackson, A.R. Fersht // Biochemistry. — 1991. -V. 30. — No. 43. — P. 10 428−43.

43. Karam J.D. DNA polymerase of the T4-related bacteriophages / J.D. Karam, W.H. Konigsberg // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. -2000. — V. 64. — P. 65−96.

44. Kim D. PROSPECT ii: protein structure prediction, method for genomescale applications / D. Kim, D. Xu, J.T. Guo, K. Ellrott, Y. Xu // Protein Eng. — 2003. — V. 16. — P. 641−650.

45. Kostyuchenko V.A. The tail structure of bacteriophage T4 and its mechanism of contraction / V.A. Kostyuchenko, P.R. Chipman, P.G.

Leiman, F. Arisaka, V.V. Mesyanzhinov, M.G. Rossmann // Nat. Struct. Mol. Biol. — 2005. — V. 9. — P. 810−813.

46. Lawrence J.G. Imbroglios of viral taxonomy: genetic exchange and failings of phenetic approaches / J.G. Lawrence, G.F. Hatfull, R.W. Hendrix //J. Bacteriol. — 2002. — V. 184. — P. 4891−4905.

47. Leckner J. The effect of the metal ion on the folding energetics of azurin: a comparison of the native, zinc and apoprotein / J. Leckner, N. Bonander, P. Wittung-Stafshede, B.G. Malmstrom, B.G. Karlsson // Biochim. Biophys. Acta. — 1997. — V. 1342. — P. 19−27.

48. Leiman P.G. Structure and morphogenesis of bacteriophage T4 / P.G. Leiman, S. Kanamaru, V.V. Mesyanzhinov, F. Arisaka, M.G. Rossmann // Cell. Mol. Life. Sci. — 2003. — V. 60. — P. 2356−2370.

49. Letarov A.V. gpwac of the T4-type bacteriophages: structure, function, and evolution of a segmented coiled-coil protein that controls viral infectivity / A. Letarov, X. Manival, C. Desplats, H.M. Krisch // J. Bacteriol., 2005, V.187 No 3,1055−66.

50. Letarov A. The function and evolution of fibritins in T4-related phages: C-end of the story / A. Letarov, O. Latypov. and H.M. Krisch. //1st Texas — Evergreen Phage/Virus Genomics and Ecology Meeting. -2006. Book of Abstracts, — P. 9.

51. Letarov A.V. The carboxy-terminal domain initiates trimerization of bacteriophage T4 fibritin / A.V. Letarov, Y.Y. Londer, S.P. Boudko, V.V. Mesyanzhinov // Biochemistry. — 1999. — V. 64. — No 7 — P. 817−823.

52. Levinthal C. Molecular model-building by computer / C. Levinthal // Sci Am. — 1966. — V. 214, — No. 6. — P. 42−52.

53. Lifshits E.M. Physical Kinetics / E.M. Lifshits, L.P. Pitaevskii // Pergamon Press. Oxford. -1981.

54. Lilie H. Advances in refolding of proteins produced in E. coli / H. Lilie, E. Schwarz, R. Rudolph // Curr Opin Biotechnol. — 1998 9 :497−501.

55. Loayza D. Gene 32 transcription and mRNA processing in T4related bacteriophages / D. Loayza, A.J. Carpousis, and H.M. Krisch // Mol. Microbiol. -1991. — V. 5. — P. 715−725.

56. Luby-Phelps K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area / K. Luby-Phelps // Int. Rev. Cytol. — 2000: — V. 192. — P. 189−221.

57. Mann N.H. The genome of S-PM2, a «photosynthetic» T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains / N.H. Mann, M.R.J. Clokie, A. Millard, A. Cook, W.H. Wilson, P.J. Wheatley, A. Letarov, H.M. Krisch //J. Bacteriol. — 2005. — V. 187, — P. 3188−3200.

58. Martin J. The effect of macromolecular crowding on chaperonin-mcdiated protein folding / J. Martin, F.U. Hartl // Curr. Opin. Struct. Biol. — 1997. — V. 7. — P. 41−52.

59. Matsuzaki S. Cloning and sequencing of major capsid protein (mcp) gene of a vibriophage, KVP20, possibly related to T-even coliphages / S. Matsuzaki, T. Inoue, M. Kuroda, S. Kimura, and S. Tanaka // Gene. -1998. — V. 222. — P. 25−30.

60. McPheeters D. S. Nucleotide sequences of the bacteriophage T2 and T6 gene 32 mRNAs / D.S. McPheeters, G. Gosch, and L. Gold // Nucleic Acids Res. — 1988. — V. 16. — P. 9341.

61. Meier S. Foldon, the natural trimerization domain of T4 fibritin, dissociates into a monomeric A-state form containing a stable b-hairpin: atomic details of trimer dissociation and local b-hairpin stability from residual dipolar couplings / S. Meier, S. Guthe, T. Kiefhaber and. S. Grzesiek // J. Mol. Biol. — 2004. — V. 334. — P. 1051−1069.

62. Miller E.S., Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4- related bacteriophage / E.S. Miller, J.F. Heidelberg, J.A. Eisen, W.C. Nelson, A.S. Durkin, A. Ciecko, T.V. Feldblyum, O. White, I.T. Paulsen, W.C. Nierman, J. Lee, B. Szczypinski, C.M. Fraser // J. Bacteriol. — 2003. -V. 185, — P. 5220−5233.

63. Miller E.S. Bacteriophage T4 genome / E.S. Miller, E. Kutter, G.

Mosig, F. Arisaka, T. Kunisawa and W. Ruger // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 2003. — V. 67. — P. 86−156.

64. Monod C. The genome of the pseudoT-even bacteriophages, a diverse group that resembles the T-even phages / C. Monod, F. Repoila, M. Kutateladze, F. Te’tart, and H. M. Krisch. // J. Mol. Biol. — 1997. — V. 267. — P. 237−249.

65. Mosig G. Gene expression: A paradigm of integrated circuits / G. Mosig, D.H. Hall, in: J.D. Karam, J.W. Drake, K.N. Kreuzer, G. Mosig,.

D.H. Hall, F.A. Eiserling, L. Black, E.K. Spicer, E.M. Kutter, K. Carlson,.

E.S. Miller (Eds.) // Molecular Biology of Bacteriophage T4. — American Society for Microbiology. — Washington, DC. — 1994. — P. 127−131.

66. Munoz V. A statistical mechanical model for beta-hairpin kinetics / V. Munoz, E.R. Henry, J. Hofrichter & W.A. Eaton // Proc. Natl Acad. Sci. USA. — 1998. — V. 95. — P. 5872−5879.

67. Murzin A. Distance homology recognition using structural classification of proteins / A. Murzin and A. Bateman // Proteins — 1997. -Suppl. l.-P. 105−112.

68. Murzin A. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures / A. Murzin, S.E. Brenner, T. Hubbard, C. Chothia // J. Mol. Biol. — 1995. — V. 247. — P. 536−540.

69. Nolan J. Genetic diversity among five T4-like bacteriophages / J. Nolan, V. Petrov, C. Bertrand, H.M. Krisch, J.D. Karam // Virol. J. — 2006. -V. 3. — P. 30.

70. O’Sullivan O. 3DCoffee: combining protein sequences and structures within multiple sequence alignment / O. O’Sullivan, C. Notredame, K. Suhre, C. Abergel, D.G. Higgins // J. Mol. Biol. — 2004. -V. 340. — P. 385−395.

71. Panchenko A. Combination of threading potentials and sequence profiles improves fold recognition / A. Panchenko, A. Marchler-Bauer, S. H Bryant // J. Mol. Biol. — 2000. — V. 296 — P. 1319−1331.

72. Papanikolopoulou K. Adenovirus fibre shaft sequences fold into the native triple beta-spiral fold when N-terminally fused to the bacteriophage T4 fibritin foldon trimerisation motif / K. Papanikolopoulou, S. Teixeira, H. Belrhali, V.T. Forsyth, A. Mitraki and M. J. van Raaij // J. Mol. Biol. — 2004, — V.342. — P. 219−227.

73. Park J. Sequence comparisons using multiple sequences detect three times as many remote homologues as pairwise methods / J. Park, K. Karplus, C. Barrett, R. Hughey, D: Haussler, T. Hubbard, C. Chothia // J. Mol. Biol. — 1998. — V. 284. — P. 1201−1210.

74. Pedulla M.L. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes / M.L. Pedulla, M.E. Ford, J.M. Houtz, T. Karthikeyan, C. Wadsworth, J.A. Lewis, D. Jacobs-Sera, J. Falbo, J. Gross, N.R. Pannunzio, W. Brucker, V. Kumar, J. Kandasamy, L. Keenan, S. Bardarov, J. Kriakov, J.G. Lawrence, W.R. Jacobs, R.W. Hendrix, G.F. Hatfull // Cell. — 2003. — V. 113. — P. 171−182.

75. Petrov V. Plasticity of the gene functions for DNA replication in the T4-like phages / V. Petrov, J. Nolan, C. Bertrand, D. Levy, C. Desplats, H.M. Krisch, J. Karam // J. Mol. Biol. — 2006. — V. 361 — P. 46−68.

76. Prilipov A.G. Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 gene wac / A.G. Prilipov, N.A. Selivanov, L.I. Nikolaeva, V.V. Mesyanzhinov // Nucleic Acids Res. — 1988. — V. 16. -No. 21.-P. 10 361.

77. Ravantti J.J. Comparative analysis of bacterial viruses Bam35, infecting a Gram-positive host, and PRD1, infecting Gram-negative hosts, demonstrates a viral lineage / J.J. Ravantti, A. Gaidelyte, D.H. Bamford, J.K.H. Bamford // Virology. — 2003. — V. 313. — P. 401¹¹⁴.

78. Rohwer F. The phage proteomic tree: a genome-based taxonomy for" phage / F. Rohwer, R. Edwards //J. Bacteriol. — 2002. — V. 184. — P. 4529−4535.

79. Ruska H. Die Sichtbarmachung der BakteriophagenLyse im.

Ubermikroskop / H. Ruska // Naturwissenschaaften. — 1940.

80. Sambrook J. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edn. / J. Sambrook, E.F. Fritch, T. Maniatis // /New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. — 1989.

81. Saren A.M. A snapshot of viral evolution from genome analysis of the Tectiviridae family / A.M. Saren, J.J. Ravantti, S.D. Benson, R.M. Burnett, L. Paulin, D.H. Bamford, J.K.H. Bamford // J. Mol. Biol. — 2005.

— V. 350. — P. 427−440.

82. Seckler R. Assembly of multi-subunit structures. In Mechanisms of Protein Folding (Pain, R., ed.) / R. Seckler // Oxford University Press, Oxford. — 2000. — P. 279−308.

83. Selick H.E. Analysis of five presumptive protein-coding sequences clustered between the primosome genes, 41 and 61, of bacteriophages T4, T2, and T6 / H.E. Selick, G.D. Stormo, R.L. Dyson, and B.M. Alberts // J. Virol. — 1993. — V. 67. — P. 2305−2316.

84. Shakhnovich E.I. Theoretical studies of protein-folding thermodynamics and kinetics / E.I. Shakhnovich // Curr. Opin. Struct. Biol.

— 1997. -V. 7.-P. 29−40.

85. Shan Y. Fold recognition and accurate query-template alignment by a combination of PSI-BLAST and threading / Y. Shan, G. Wang, H.X. Zhou // Proteins, — 2001. — V. 42. — P. 23−37.

86. Sobolev B.N. Fibritin and adhesin of bacteriophage T4 tell us how fibrous protein folds and assembles / B.N. Sobolev, M.M. Shneider, E. I: Marusich, V.V. Mesyanzhinov (Poglazov B.F., Kurganov B.I., Kritsky M.S., and Gladilin K.L. eds.). In: Evolutionary biochemistry and related' areas of physicochemical biology. // Moscow /Bach Institute of Biochemistry and ANKO. — 1995. — P. 351−374.

87. Soding J. Protein homology detection by HMM-HMM comparison / J. Soding // Bioinformatics. — 2005. — V. 21. — P. 951−960.

88. Slrelkov S.V. Preliminary crystallographic studies of bacteriophage T4 fibritin confirm a trimeric coiled-coil structure / S.V. Strelkov, Y. Tao, M.G. Rossmann, L.P. Kurochkina, M.M. Shneider, V.V. Mesyanzhinov // Virology. — 1996. — V. 219. — No.l. — P. 190−4.

89. Strelkov S.V. Structure of bacteriophage T4 fibritin M: a troublesome packing arrangement / S.V. Strelkov, Y. Tao, M.M. Shneider, V.V. Mesyanzhinov, M.G.Rossmann // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. — 1998. — V. 54(Pt 5). — P. 805−16.

90. Sullivan M.B. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations / M.B. Sullivan, M.L. Coleman, P. Weigele, F. Rohwer, S.W. Chisholm // PLoS Biol. — 2005. -V. 3. — P. 144.

91. Suttle C.A. Viruses in the sea / C.A. Suttle // Nature. — 2006. — No. 437. — P. 356−361.

92. Tang C. On the role of structural information in remote homology detection and sequence alignment: new methods using hybrid sequence profiles / C. Tang, L. Xie, I.Y. Koh, S. Posy, E. Alexov, B. Honig // J. Mol. Biol., — 2003. -V. 334. — P. 1043−1062.

93. Tetart F. Phylogeny of the major head and tail genes of the wideranging T4-type bacteriophages / F Tetart, C. Desplats, M. Kutateladze, C. Monod, H1W. Ackermann, H.M. Krisch // J Bacteriol. — 2001. — V. 183. No. l.-P. 358−366.

94. Theimer C.A. Non-nearest neighbor effects on the thermodynamics of unfolding of a model mRNA pseudoknot / C.A. Theimer, Y. Wang, D.W. Hoffman, H.M. Krisch and D.P. Giedroc // J. Mol. Biol. — 1998. — V. 279. — P. 545−564.

95. Thompson J. CLUSTALW: improving the t sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice / J. Thompson, D. G Higgins, T.J. Gibson // Nucleic Acids Res., -1994. — V. 22. — P. 46 734 680.

96. Vingron M. Sequence alignment and penalty choice. Review of concepts, case studies and implecations / M. Vingron and M. Waterman // J. Mol. Biol. — 1994. -V. 235. — P. 1−12.

97. Wang G. Scoring profile-profile sequence alignments / G. Wang and R.J. Dunbrack // Protein Sci. — 2004. — V. 13. — P. 1612−1626.

98. Wittung-Stafshede P. Role of cofactors in protein folding / P. Wittung-Stafshede // Acc. Chem. Res. — 2002. — V. 35. — P. 201−208.

99. Wood W.B. «Long tail fibers: genes, proteins, structure, and assembly» — in Bacteriophage T4 (Karam J.D., ed.) / W.B. Wood, F.A. Eiserling, R.A. Crowther // American society for microbiology, Washington D.C., — 1994. — P. 282−290.

100. Yanagida M. Determination of gene product positions in bacteriophage T4 by specific antibody association / M. Yanagida, C. Ahmad-Zadeh // J .Mol Biol. —^1970. — V. 51. — P. 411−21.

101. Yeh L.S., Divergence of a DNA replication gene cluster in the T4-related bacteriophage RB69 / L.S. Yeh, T. Hsu, and J.D. Karam // J. Bacteriol. -1998. — V. 180. — P. 2005;2013.

102. Yoshida T., Isolation and characterization of a cyanophage infecting the toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa / T. Yoshida, Y. Takashima, Y. Tomaru, Y. Shirai, Y. Takao, S. Hiroishi, K. Nagasaki // Appl. Env. Microbiol., 2006, V. 72, No 2, P. 1239−1247.

103. Zhang Y. Automated structure prediction of weakly homologous proteins on a genomic scale / Y. Zhang & J. Skolnick // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2004. — V. 101, — P. 7594−7599.

104. Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction / Y. Zhang // BMC Bioinformatics. — 2008. — V. 9. — No. 1. — P. 40 [Epub ahead of print].

БЛАГОДАРНОСТИ.

Я выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю, к.б.н. A.B. Летарову за помощь в постановке экспериментальных целей и задач. Также я очень признателен Ольге Воронцовой (ИБХ РАН) за помощь в получении спектров кругового дихроизма, Максиму Фильчикову (ИБХ РАН) за помощь в построении моделей вторичных и третичных структур, а также к.б.н. Артему Кононенко (ИМБ РАН) за ценные советы и помощь при решении экспериментальных задач.

1. Изолирован новый Т4-подобный энтеробактериофаг JS98C3. В последовательности фибритина этого бактериофага обнаружены аминокислотные мотивы, имеющие высокую степень гомологии с фолдоном фибритина фага Т4.2. Показано, что С-концевой домен фибритина бактериофага JS98C3 способен к эффективной автономной тримеризации, что делает перспективным использование входящих в его состав фолдонов в белковой инженерии в качестве модулей, инициирующих фолдинг химерных белков.3. В результате проведенного поиска в базе данных GenBank выявлено 16 новых аминокислотных мотивов, гомологичных фолдону фибритина фага Т4. Девять из вновь обнаруженных последовательностей находятся в последовательностях белков, не родственных фибритину, бактериофагов, относящихся к семейству Siphoviridae, что говорит о широкой распространенности подобных структур.4. In silico моделирование вторичных и третичных структур вновь обнаруженных нами в GenBank аминокислотных мотивов подтвердило предположение о сходстве их конформации с фолдоном фибритина бактериофага Т4, что может свидетельствовать об их сходной роли в фолдинге соответствующих белков.