Культивирование, уреазная активность и белоксодержащие антигены Helicobacter pylori

Актуальность проблемы.

Helicobacter pylori — микроаэрофильные, неспорообразующие, грамотрицательные, изогнутые палочковидные или кокковидные бактерии, населяющие слизистые оболочки нижних отделов желудка и двенадцатиперстной кишки [Marshall В.J., 1984]. В настоящее время принято считать, что H. pylori ассоциирован с хроническим гастритом и язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, а также является фактором риска при развитии карциномы желудка [Perez-Perez G.I., Blaser M. J, 2003]. Присутствие H. pylori не всегда подразумевает наличие болезни — носительство среди здоровой части популяции составляет 20−84% [Axon А., 1999]. Есть мнение, что H. pylori может играть позитивную роль для человека, поскольку его удаление имеет и отрицательные последствия [Blaser M.J., 1997; Blaser M.J., 1999; Labenz J. et al., 1997; Chow W.H. et al., 1998; Werdmuller B.F. et al., 1997]. Однако конкретных гипотез и доказательств возможной положительной роли H. pylori в доступной литературе до сих пор не представлено. Какой бы ни была роль данных бактерий в организме здоровых и иммунокомпрометированных носителей, диагностика хеликобактериоза остается актуальной.

Существующие методы диагностики включают бактериологические, гистологические, биохимические (разновидности уреазного теста), иммунологические и молекулярно-генетические методы [Лапина Т.Л., 1999]. Обычно для клинической диагностики проводят эндоскопию с последующим исследованием образцов биоптатов слизистой оболочки: посевом на селективную среду, окрашиванием мазков-отпечатков по Граму, качественным определением уреазной активности. Уреаза Н. pylori составляет до 10% от общего белка клетки [Bauerfeind P. et al., 1997]. Этот фермент разлагает мочевину с образованием гидроксил анионов, обеспечивая бактериям возможность персистенции в агрессивной среде желудка, и является одним из главных антигенов Н. pylori. Количественный метод определения активности уреазы в разных вариациях используется в исследовательских целях для оценки активности суспензий клеток различных микроорганизмов и препаратов фермента разной степени очистки [M.-Plaza I., R.-Herrera J., 1967; Юодвальките С.-Д., 1983], однако, до сих пор не был разработан для биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori.

При проведении скрининговых эпидемиологических исследований, а также в случаях невозможности проведения эндоскопии, чаще всего в мировой практике используют иммунодиагностику. За рубежом создан ряд коммерческих препаратов для иммунной диагностики, основанный на использовании антигенов H.pylori. Первое поколение антигенных препаратов из H. pylori, используемых и в настоящее время, включает: целые бактериальные клеткикислотно-глициновые экстракты биомассыклетки, обработанные формалиномультразвуковые экстракты клеток [Perez-Perez G.I., Blaser M. J, 2003]. Известны антигенные белки клеток H. pylori: Vac, А — вакуолизирующий цитотоксин (мол.масса 87 кДа) — Cag, А — цитотоксин ассоциированный белок (140 кДа) — субъединицы уреазы — Ure, А (29.5 кДа) и Ure В (66 кДа) — Hsp 60 — белок теплового шока (59−60 кДа) — жгутиковый флагеллин — Fla (55 кДа) — мембранный белок — аналог флаводоксина Fid, А (19 кДа) и др. В новом поколении антигенных препаратов используют комплекс высокоочищенных белков — клеточных антигенов H.pylori. Известны также специфичные антигены, выделяемые H. pylori в окружающую среду, набор которых значительно уже, чем клеточных [Lindholm С. et al, 1997].

Важным звеном при получении антигенсодержащих препаратов для последующей разработки диагностикумов являются питательные среды и процессы культивирования. Учитывая, что некоторые высокоспецифичные антигены Н. pylori обнаруживаются во внеклеточном пространстве, очень актуально использование синтетических сред определенного химического состава. В доступной литературе описаны такие среды, однако, все они содержат бычий или лошадиный сывороточный альбумин [Albertson N. et al., 1998; Nedenskov P., 1994; Reynolds D.J. and Penn C.W., 1994; Testermann T.L. et al., 2001]. Более или менее значимый прирост биомассы H. pylori отмечен лишь при невысокой степени очистки данного белка. Очевидно, что до сих пор не найден тот основной компонент синтетической среды, который дал бы возможность культивировать H. pylori с высоким выходом биомассы.

Изложенное свидетельствует о том, что для усовершенствования диагностики H. pylori необходимо наличие чувствительного экспресс-метода определения уреазы и высококачественных антигенных препаратов, получаемых с помощью синтетической питательной среды.

Цель исследования:

Исследование активности уреазы и оценка влияния состава питательной среды на накопление биомассы и образование клеточных и внеклеточных белоксодержащих антигенов H.pylori.

Задачи исследования:

1. Создание коллекции штаммов H.pylori.

2. Разработка количественного метода определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori.

3. Разработка новой синтетической среды для культивирования H.pylori.

4. Получение клеточных и внеклеточных антигенсодержащих препаратов из H. pylori при культивировании на поноценной и синтетической средах.

5. Оценка методами ИФА и иммуноблоттинга специфических IgG-антител в сыворотках крови больных язвенной болезнью и бессимптомных доноров с использованием полученных антигенсодержащих препаратов из H.pylori.

Научная новизна.

С помощью разработанного количественного метода показано, что уреазная активность биоптатов коррелирует с активностью уреазы выделенных их них культур H.pylori. Уреазная активность культур зависит от фазы роста: в фазе замедления она в 1,4−10 раз выше, чем в стационарной фазе.

Сопоставление количественной уреазной активности и тяжести течения заболевания в группе больных язвенной болезнью показало отсутствие корреляции между этими показателями.

Метод дает возможность оценить продукцию хеликобактером гидроксил анионов в желудке и, таким образом, судить об участии бактерий в поддержании кислотно-щелочного баланса.

Обнаружено, что именно гемоглобин является тем принципиальным компонентом синтетической среды, который дает возможность культивировать H. pylori с высоким выходом биомассы.

Практическая значимость.

Создана лабораторная коллекция клинических изолятов, насчитывающая 30 штаммов H.pylori.

Разработан количественный метод определения уреазной активности применительно к биоптатам слизистой оболочки желудка и клеточным суспензиям H. pylori, основанный на регистрации изменения рН в реакционной смеси. Метод прост в исполнении и дает полезную информацию в течение 10−40 минут, в отличие от нескольких часов при определении активности уреазы на качественном уровне. В группе из 51 больного язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки данным методом показано наличие H. pylori у 87.7% пациентов.

Создана синтетическая среда для культивирования H. pylori, содержащая минеральные соли, витамины, антибиотики, аминокислоты, гемоглобин, глутамин в качестве основного источника углерода и энергии, 0,1% агарозы для адгезии клеток.

Установлено, что антигенсодержащий препарат из культуральной жидкости после выращивания H. pylori на синтетической среде является более перспективным для создания диагностикума, чем препараты, полученные из клеток H. pylori, выращенных на синтетической или полноценной среде, поскольку содержит минимум антигенов, не имеющих значения для диагностики.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработан количественный высокочувствительный метод определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H. pylori, основанный на учете скорости продукции гидроксил анионов.

2. Разработана новая эффективная синтетическая среда для культивирования H. pylori, содержащая в качестве основных органических компонентов глутамин и гемоглобин.

3. Культивирование H. pylori на разработанной синтетической среде обеспечивает получение внеклеточных специфических диагностических антигенсодержащих белков без дополнительной очистки.

4. Экспериментально обосновано предположение о роли H. pylori в качестве биохимического барьера, регулирующего кислотность на границе желудка и двенадцатиперстной кишки на основании соотнесения скорости продукции гидроксил анионов клетками H. pylori со скоростью выделения протонов слизистой оболочкой желудка.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН (2001) — на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН (2003) — на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Москве (2003) — на заседании Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2004). Диссертация апробирована на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН 4 марта 2005 года.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 2.1. Общая характеристика Helicobacter pylori.

5. ВЫВОДЫ.

1. Разработан количественный метод определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток Helicobacter pylori. Метод дает возможность быстро (в течение 10−40 минут) установить факт носительства и оценить продукцию гидроксил анионов данным штаммом H.pylori.

2. С помощью предлагаемого метода показано, что в группе из 49 пациентов с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки 87.7% человек являлись носителями Н. pylori. Показано, что величины уреазной активности биоптатов не коррелировали с тяжестью течения заболевания, рассчитанной по сумме значимых критериев (/* = 0,183). Установлена корреляция между величинами уреазной активности биоптата и соответствующей ему культуры Н. pylori (г = 0,934).

3. Создана новая синтетическая среда для культивирования H. pylori, содержащая аминокислоты, соли, витамины, антибиотики, агарозу и гемоглобин. С помощью данной среды выявлена потребность клеток H. pylori в значительных количествах гемоглобина. Среда превосходит зарубежные аналоги по скорости роста и накоплению биомассы.

4. Получены клеточные и внеклеточные антигенсодержащие препараты из H. pylori при культивировании на полноценной и синтетической средах. Методом иммуноблоттинга установлено, что спектр антигенных белков внеклеточного препарата, получаемого при культивировании H. pylori на разработанной синтетической среде, значительно уже, а доля в нем специфических белков выше, чем в клеточных антигенных препаратах.

5. Оценка сывороток крови больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки и бессимптомных доноров методом ИФА с клеточным препаратом, показала наличие специфических иммуноглобулинов класса G в 41,4 ± 9,1% и 40,7 ± 9,5% случаев соответственно (р > 0,5). Исследование аналогичных сывороток с внеклеточным препаратом, полученным на синтетической среде, выявило наличие положительных результатов у 68,0 ± 9,3% больных и у 32,0 ± 9,3% доноров (р — 0,01).

6. Впервые рассчитаны скорости продукции гидроксил анионов бактериями Hpylori в пилорическом отделе желудка на основании данных по количественной уреазной активности биоптатов. Эти величины соизмеримы со средними скоростями продукции протонов в желудке человека.

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Обнаружение Маршаллом и Уорреном [Warren J.R. and Marshall В.J., 1983] в 1983 году грамотрицательных обитателей слизистой оболочки желудка человека — H. pylori — послужило началом для целого ряда открытий в области гастроэнтерологии. Несмотря на обилие публикаций, посвященных данной теме (к настоящему времени свыше 19 000 источников в поисковой системе Medline), многие вопросы остаются до сих пор неясными. Для нас наиболее интригующим моментом является микроэкологическая роль H. pylori в организме носителя. Участие этих бактерий в развитии различных заболеваний интенсивно изучается — проводят статистические исследования частоты встречаемости, изучают факторы патогенности H. pylori [Josenhans С. and Suerbaum S., 2001], иммунный ответ носителя [D'Elios М.М. and Del Prete G., 2001], антигенный состав бактерий и их геномы [Banerjee S. and Michetti P., 2001; Tomb J.-F. et al., 1997]- созданы экспериментальные животные модели [Eaton К.А., 2001]. Однако частое обнаружение Helicobacter spp. у здоровых людей наводит на мысль об определенной экологической функции этих бактерий в организме человека (таблица 3). Об этом же косвенно свидетельствуют данные об отрицательных последствиях элиминации H. pylori [Blaser M.J., 1997bBlaser M.J., 1999b].

Один из наиболее популярных методов диагностики основан на оценке активности фермента уреазы — основного белка клеток H. pylori, разлагающего мочевину с образованием аммиака и гидроксил анионов. Мы предполагаем, что скорость продукции гидроксил анионов уреазой H. pylori может быть сравнима со скоростью выделения протонов в желудке. Для определения скорости экскреции гидроксил анионов необходимо располагать количественным методом оценки уреазной активности. Известны и используются ь в микробной биотехнологии следующие количественные методы опребделения уреазной активности — колориметрический, титриметрический и метод, основанный на измерении рН. Последний метод применяется в клинической лабораторной диагностике для качественного определения уреазы с помощью рН-индикатора. Мы модифицировали третий метод. Модификация заключалась в 10-кратном уменьшении объема реакционной смеси (по сравнению с исходным количественным методом) за счет портативного рН-метра, что позволило использовать метод не только для суспензий клеток, но и впервые для биопсийного материала. Как диагностический этот метод отличается, например, от дыхательного теста простотой используемого оборудования: рН-метр Piccolo-2 вместо масс-спектрометра или сцинтилляционного счетчика. В отличие от качественного теста с феноловым красным (2−24 часа) наша модификация позволяет провести анализ в течение 10−40 минут.

Разработанный метод позволил получить новые данные о взаимосвязи уреазной активности биоптатов и полученных из них штаммов H.pylori. Показано, что чем более активной уреазой обладает штамм Н. pylori, тем выше таковая и в биоптате (коэффициент линейной корреляции Пирсона г = 0,934). На этом основании можно предположить, что общее количество выделяемых бактериями гидроксил анионов в желудке в большей степени зависит от активности штамма, чем от обсемененности слизистой оболочки. Кроме того, изучение активности уреазы в процессе роста культур Н. pylori на плотной среде показало, что в фазе замедления роста активность уреазы в несколько раз выше, чем в стационарной фазе. Такая закономерность характерна для многих микробных ферментов [Перт С.Дж., 1978] и объясняется тем, что в стационарной фазе происходит исчерпание субстратов, необходимых для биосинтеза ферментов. Этот факт может иметь значение в технологии получения фермента или антигена уреазы из клеток H.pylori.

В процессе отработки метода на клинических образцах биопсийного материала антрального отдела желудка была собрана коллекция штаммов, идентифицированных классическими методами как Helicobacter pylori. На сегодняшний день описано изучено уже более 20 видов Helicobacter, 9 из которых связаны с человеком, и только 3 из них встречаются в слизистой оболочке желудка — H. pylori, H. heilmanii и H. felis (таблица 1). Эти виды филогенетически близки между собой, причем, в большинстве случаев из слизистой оболочки желудка человека выделяют Helicobacter pylori [Versalovic J. and Fox J. G, 2001]. Нельзя исключить, что реидентификация коллекционных штаммов молекулярно-генетическими методами покажет некоторые видовые различия, однако, для такого типирования необходимо иметь референс-культуры.

Во многих странах проводится мониторинг носительства H. pylori в больших выборках здоровых людей и больных с различными заболеваниями желудочно-кишечного тракта (таблица 3, 4). Одним из основных методов оценки носительства является иммунологический, основанный на использовании иммунологических тест-систем, с помощью которых можно проводить масштабные скрининговые исследования такого рода. При разработке диагностикумов очень важным моментом являются питательные среды и процессы культивирования. Многие высокоспецифичные антигены Н. pylori обнаруживаются во внеклеточном пространстве (Глава 2.4.), следовательно, для их получения целесообразно использовать синтетические среды определенного химического состава. Нами проанализированы составы сред (таблица 11) [Albertson N. et al, 1998; Nedenskov P, 1994; Reynolds D.J. and Penn C. W, 1994; Testermann T.L. et al., 2001] и показано, что их основными компонентами являются соли, аминокислоты, альбумин и носители типа циклодекстрина, обеспечивающие адгезию клеток H.pylori. Однако ни одна из предлагаемых сред не обеспечивает значительного прироста биомассы. Более того, чем выше была степень очистки альбумина, тем хуже рост культуры H.pylori. В этой связи мы сделали предположение о том, что при очистке альбумина терялся именно тот основной компонент синтетической среды, который дал бы возможность культивировать H. pylori с высоким выходом биомассы. Для поиска данного компонента была разработана схема (рис.3). За основу нами была взята полноценная среда, содержащая в качестве источников углерода и азота пептон, а в качестве источника органического железа — кровь. Из имеющихся в собранной коллекции штаммов были выбраны два, обладающие наиболее высокой скоростью роста на плотной среде с кровью.

Накопление биомассы на среде с пептоном оказалось в 2.3 раза ниже в сравнении со средой с казаминовыми кислотами, по-видимому, из-за более высокого содержания в последней свободных аминокислот. Для замены казаминовых кислот более простыми компонентами исследовали рост H. pylori на среде, содержащей 40 г/л казаминовых кислот и 1% крови в течение 7-ми суток. Провели аминокислотный анализ исходной среды и культуральной жидкости (рис. 8- рис. 9). Оказалось, что 27% от суммарного содержания аминокислот в исходной среде и в конечной культуральной жидкости составил глутамин, а потребление наиболее представленных индивидуальных аминокислот в течение 7-ми суток составило от 49.2 до 59.1%. В интервале от 0 до 48 часов потреблялось 18.31 г/л (43.6%) суммы всех аминокислот, а в интервале от 48 до 168 часов — еще 4.15 г/л (9.9%), что соответствует таким показателям, как скорости роста и скорости метаболизма (таблица 8). Двухфазный характер потребления аминокислот, наряду с отсутствием преимущественного потребления какой-либо из них, может свидетельствовать о наличии в среде двух неизвестных нам факторов роста, которые утилизируются поочередно. Таким образом, в будущей синтетической среде основным источником углерода и азота был выбран глутамин, а остальные аминокислоты, необходимые для роста H. pylori, добавлены в фоновых концентрациях.

Изучение влияния компонентов крови — сыворотки и эритроцитов — показало, что более значимым компонентом являются эритроциты (таблица 7). Установлено также, что внесение в среду культивирования негемовой фракции эритроцитов (препарата «аминокровин») также не дает значительного прироста биомассы. Замена крови на простые гемсодержащие аналоги — гемин и цитохром с — не привела к сколько-нибудь значимому росту. Оказалось, что наиболее эффективным компонентом, содержащим органическое железо, является гемоглобин.

Из двух изученных гемоглобинов животного происхождения предпочтительным оказался лошадиный. Характер зависимости плотности популяции клеток от концентрации данного субстрата свидетельствует о том, что он является лимитирующим рост [Перт С.Дж., 1978]. Используемый способ оценки утилизации гемоглобина клетками — по величине поглощения бесклеточного супернатанта при 550 нм — позволяет сделать вывод о том, что в процессе роста клетки H. pylori потребляли именно гемсодержащий белок, причём в «субстратных», а не в микроколичествах. Нами рассчитано, что на 1 мг биомассы H. pylori клетки утилизировали от 1.3 до 3.5 мкг гемового железа в зависимости от содержания гемоглобина в среде (таблица 10). Такой высокий расход данного субстрата может быть обусловлен двумя причинами. Во-первых, H. pylori — это микроаэрофильные бактерии, имеющие примитивную (неразветвленную) дыхательную цепь с цитохромами b, с и сЪ типов — ферментами, содержащими железо [Smith М. et al., 2000]. Остается неясным вопрос: почему H. pylori не использует предшественники гемоглобина — цитохром с и гемин? Можно лишь предположить, что отсутствие белковой составляющей в гемине и конформационные и аминокислотные отличия белковой компоненты в цитохроме с от таковой в гемоглобине являются принципиальными моментами. Во-вторых, есть данные литературы о том, что хеликобактер запасает большие количества ферритина в цитоплазме, обеспечивая клетки на случай лимита железа в среде [WaidnerB. etal., 2002].

На основании экспериментальных данных нами подсчитана примерная скорость потребления гемоглобина в пилорическом отделе желудка за счет метаболизма H. pylori — она может составлять от 2 до 4 мг в сутки (таблица 15). Концентрация гемоглобина в крови человека составляет 120−150 мг/мл. Таким образом, само по себе наличие H. pylori не может быть причиной развития железодефицитной анемии, как предполагают некоторые авторы [Choe Y.H. et al., 1999; Choe Y.H. et al., 2003; Milman N. Et al., 1998].

Важным моментом при культивировании H. pylori является внесение в среду агарозы. При добавке агарозы в концентрации 0,1% (таблица 7) выход биомассы при культивировании на синтетической среде становится сравнимым с таковым на полноценной среде с кровью. Очевидно, что клеткам H. pylori необходима адгезия на поверхности твердой фазы, аналогичной их природному экотопу. К такому же выводу можно прийти, анализируя данные литературы [Testerman et al, 2001].

Как и прочие микроаэрофильные микроорганизмы, H. pylori нуждается в невысокой, но постоянной концентрации кислорода в среде. Без дополнительной аэрации рост H. pylori затруднен, однако, рис.6), вставка шприцевой иглы в пробку флакона после 1 суток дала возможность избежать лимитирования роста кислородом. Этот прием известен [Deshpande М. et al., 1995], хотя авторы публикации использовали замену резиновой пробки на ватную.

Проверка данной рецептуры среды (с лошадиным гемоглобином при указанном режиме аэрации и наличии агарозы) обеспечивала высокий уровень накопления биомассы 6-ти штаммов из нашей коллекции.

Итак, упрощение полноценной питательной среды, содержащей пептон и кровь, позволило: избежать использования высокомолекулярных сывороточных белков неизвестного составаобнаружить высокую потребность H. pylori в гемовой и белковой составляющих гемоглобинаувеличить прирост биомассы, выраженной в КОЕ/мл, на 2−3 порядка по сравнению с результатами других авторов.

Созданная синтетическая среда, наряду с полноценной, была использована для получения клеточных и внеклеточных антигенсодержащих препаратов из H.pylori. Перечень основных антигенов H. pylori представлен в таблице 5. Оценка полученных нами препаратов с сыворотками больных — носителей H. pylori показала следующее. Все препараты содержат антигенные белки. Препарат из клеток, выращенных на полноценной среде, содержит минимум 39 антигенных белков. Препараты из клеток, выращенных на синтетической среде до фазы замедления роста, содержат 15 антигенных белкова до стационарной фазы — 13. Препараты из культуральной жидкости после выращивания H. pylori на синтетической среде содержат 9 антигенных белков независимо от фазы роста. Три из этих 9 белков соответствуют молекулярным массам и являются предположительно: 19 kDaмембранным белком Fid, А, 26 kDa — алкилгидропероксид редуктаза (NapA), 66 kDa — Ure В (субъединица уреазы). Данные согласуются с исследованием [Lindholm.

С. et al, 1997], где показано наличие 26 kDa белка во внеклеточной жидкости после культивирования H. pylori в жидкой полноценной среде на качалке. Таким образом, разработанная синтетическая среда дает возможность сузить спектр антигенных белков в препарате, увеличить в препарате долю специфических белков и получать антигенный комплекс H. pylori без специальной очистки.

С помощью полученных из H. pylori антигенсодержащих препаратов оценивали наличие специфических IgG-антител в сыворотках крови больных язвенной болезнью и бессимптомных доноров. Оценка сывороток крови 29 пациентов и 27 бессимптомных доноров методом ИФА с препаратом из клеток H. pylori, выращенных на полноценной среде, показала следующее: 41,4 ± 9,1% сывороток пациентов и 40,7±9,5% сывороток доноров содержали иммуноглобулины класса G (р > 0.5). Отсутствие разницы в результатах можно объяснить высоким содержанием неспецифических (перекрестно реагирующих) белковых антигенов в изученном препарате. Аналогичное исследование, проведенное на 25 сыворотках крови больных язвенной болезнью и 25 сыворотках доноров с использованием внеклеточного препарата из культуральной жидкости после выращивания H. pylori на синтетической среде, выявило наличие положительных результатов в 68,0 ± 9,3% и 32,0 ± 9,3% случаев соответственно. Вероятно, высокий процент положительных сывороток в данном случае обусловлен частым носительством этих бактерий среди популяции здоровых людей (см. таблицу 3).

На основании совокупных данных по иммуноблоттингу и ИФА можно заключить, что полученный с помощью синтетической среды внеклеточный антигенный препарат является более перспективным для создания диагностикума, нежели клеточный.

Совокупные исследования носительства (по данным микроскопии и высевам) и количественной уреазной активности, проведенные в группе из 49 больных (таблица 13), показали невысокую степень корреляции между этими показателями: г = 0.360. Однако при полном отсутствии уреазы носительство ни в одном случае не было подтверждено (12.3% из 49 обследованных). Кроме того, средняя величина уреазной активности у пациентов с неподтвержденным носительством (0,15 ± 0,17 АрН /часхмг биоптата) была очевидно ниже, чем таковая у явных носителей (0,79 ± 0,59 ДрН /часхмг биоптата). Суммируя все полученные данные можно заключить, что даже отсутствие различимых клеток в мазке-отпечатке и колоний на кровяном агаре при положительном количественном уреазном тесте имеет смысл рассматривать как носительство. Значимость различных вариантов уреазного теста в диагностике хеликобактериоза в сравнении с мазками/высевами обсуждается в литературе, причем, есть указания на целесообразность совокупной оценки носительства по всем трем показателям [Лапина Т. Л, 1999]. В нашем случае необходимо учесть, что уреазный тест проводился на количественном уровне. С помощью количественного метода было показано носительство Н, pylori в группе больных язвенной болезнью в 87.7% случаев, а помощью качественного в 73.1% случаев. Можно утверждать, что количественный метод более чувствителен, чем качественный, поскольку даже при очень низкой активности (пологая кривая зависимости рН от времени) в течение 1 часа можно с уверенностью констатировать наличие уреазы, тогда как при качественном тесте нужен значительный перепад рН, чтобы краситель феноловый красный поменял цвет с желтого на малиновый.

Считают, что уреаза является одним из факторов вирулентности Hpylori [Eaton et al, 1991]. Использование количественного метода определения уреазы в клинике позволило нам соотнести данный показатель с тяжестью течения заболевания и, таким образом, косвенно судить о степени участия H. pylori в патологическом процессе. В совместных исследованиях с Никольской К. А. (ЦНИИ Гастроэнтерологии) разработана схема количественной оценки тяжести заболевания с учетом следующих значимых критериев: длительность заболевания, частота обострений, субъективные показатели — боли, изжога, тяжесть в желудке, тошнота, отрыжкаа также данные эндоскопии 12-перстной кишки и пищевода. Сравнение величин уреазной активности с суммой всех (1) и объективных (2) критериев свидетельствовало об отсутствии корреляции между тяжестью течения язвенной болезни и активностью уреазы: коэффициент Пирсона в первом случае был равен г i = 0,183, а во втором г 2— 0,273.

На основании вышеизложенного можно заключить, что метод количественного определения уреазной активности дает возможность быстро установить факт носительства и оценить скорость продукции гидроксил анионов данным штаммом H. pylori, однако, сама по себе величина этого показателя, очевидно, не может рассматриваться как мера патогенности этих бактерий.

Обобщая данные литературы можно заключить, что H. pylori, как таковой, не является главным в патогенезе язвенной болезни, поскольку присутствие бактерий не всегда подразумевает наличие болезни, а их элиминация вовсе необязательно заканчивается излечением. Более того, носительство H. pylori может быть полезным для человека, поскольку его удаление зачастую имеет отрицательные последствия [Blaser M.J., 1997bBlaser M.J., 1999b Labenz J. et al., 1997; Chow W.H. et al., 1998; Werdmuller B.F. et al., 1997]. Предположения о некоей положительной роли H. pylori в организме носителя довольно часто обсуждаются в литературе последних лет, однако, нам нигде не встретились конкретные гипотезы по данному вопросу.

Известно, что скорость образования протонов [Н^] в среднестатистическом здоровом желудке колеблется в пределах от 114.2 до 238.4 мкмоль Н+/мин [Физиология. Основы и функциональные системы. «Медицина», 2000]. На основании данных по величине уреазной активности биоптатов, полученных при эндоскопическом обследовании больных, были рассчитаны возможные скорости продукции гидроксил анионов в пилорическом отделе среднестатистического желудка взрослого человека за счет функционирования уреазы хеликобактера (глава 3.6.3.) По нашим данным скорость выделения [ОН" ] может достигать 1318.9 мкмоль/мин, тогда как скорости, соответствующие средним величинам уреазной активности, варьируют в пределах 37.7 — 414.2 мкмоль/мин. Таким образом, скорость образования гидроксил ионов H. pylori соизмерима со скоростью продукции протонов, следовательно, участие этих бактерий в регуляции кислотно-щелочного равновесия вполне вероятно. Можно предположить, что заселение хеликобактером именно пилорического отдела желудка имеет особое значение для носителя. Пилорический отдел находится в преддверии двенадцатиперстной кишки, рН содержимого которой близок к нейтральному. Роль механического барьера между желудком и двенадцатиперстной кишкой выполняет двустворчатая валикообразная складка (заслонка). Нельзя исключить, что одной из составляющих биохимического барьера, регулирующего кислотность на границе желудка и двенадцатиперстной кишки, служит именно Helicobacter pylori. Кроме того, можно предположить, что носительство H. pylori более полезно при активной продукции кислоты в желудке, нежели при пониженной функции желудочных желез. Вполне вероятно, что именно в последнем случае носительство этих микроорганизмов является фактором риска в развитии таких заболеваний, как карцинома.

На основании полученных данных именно уреазу можно рассматривать как фактор, обусловливающий роль H. pylori в микроэкологии желудка здорового носителя.