В настоящее время основными методами, позволяющими определять молекулярную структуру клеточных белков и отдельных элементов клетки, таких как микрофиламенты, микротрубочки и молекулярные моторы, являются рентгенографические и спектроскопические методы исследований. Однако знание только структуры клеточных элементов не позволяет понять такие динамические процессы, как перенос веществ внутри и между клетками, деление, передвижение и изменения формы клетки. Для того чтобы изучать и понимать эти процессы, необходимы динамические методы, которые позволили бы определить силы, действующие на клеточные элементы и определяющие их динамику. Такие силы возникают на молекулярном уровне и имеют величину порядка нескольких пиконьютонов. Межмолекулярные силы определяют не только физические свойства твердых.
• тел, жидкостей и газов, а также играют важную роль в самоорганизации биологических объектов [1]. Природу биомолекулярных взаимодействий, участвующих в организации живых организмов, определяет набор слабых, нековалентных межмолекулярных сил [2]. Так, динамику цитоскелета клетки, а, следовательно, и изменения формы, ориентации и направления движения клетки можно описать, если известны все межмолекулярные силы. Знание сил, возникающих между молекулами и биомолекулярными образованиями в клетке, позволяет раскрыть природу таких процессов, как деление, изменение формы и ориентации, рост, передвижение, самоорганизацию клетки, процессов транскрипции и трансляции ДНК, а также процессов, связанных с переносом органелл и молекул внутри клетки. В настоящее время активно разрабатываются динамические методы для определения межмолекулярных взаимодействий. Так, методами атомно-силовой спектроскопии [3], оптического твизера [4,5,6] и микроигл.
• [7] за последние десятилетия проведен ряд уникальных работ по определению межмолекулярных сил. Использование оптического твизера для исследования биологических объектов является наиболее перспективным методом, так как позволяет изучать объекты, находящиеся в растворах, гелях или даже в живой клетке, не повреждая ее. Оптический твизер позволяет не только получать количественные и качественные характеристики межмолекулярных взаимодействий в описанных выше процессах, но и управлять этими процессами. В диссертации рассмотрены возможности, преимущества, а также устройство, принцип работы и методы калибровки оптического твизера, кроме того, предложен и практически реализован новый вариант оптического твизера. Описываемый в диссертации оптический твизер опробован в экспериментах с манипулированием полистирольными частицами различного размера, которые могут быть использованы в качестве посредника между исследуемым объектом и оптической ловушкой твизера. Показано, что возможно манипулирование не.
Ф только твердыми частицами, но и масляными каплями во вводном растворе и полыми сферическими полимерными капсулами. Капсулы могут быть использованы в качестве контейнеров лекарственных препаратов, микрореакторов, а также для моделирования мембраны живой клетки и изучения ее свойств. Кроме того, предлагаемый оптический твизер опробован в экспериментах по исследованию взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой.
Взаимодействию отдельного молекулярного мотора с микротрубочкой было посвящено много работ [8,9], что позволило определить силу, с которой мотор действует на микротрубочку, время и размер отдельного шага мотора. Однако в клетке с одной микротрубочкой могут взаимодействовать несколько молекулярных моторов. Следовательно, интерес представляет изучение взаимодействия группы моторов с микротрубочкой или актиновым филаментом. В диссертационной работе предлагается метод исследования.
• взаимодействий молекулярных моторов с микротрубочкой или микрофиламентами с использованием оптического твизера [10]. Предлагаемый метод позволяет исследовать влияние силы, приложенной к мотору под разными углами, на скорость его передвижения, определить влияние возникающих заторов в движении моторов на скорость их перемещения вдоль микротрубочки, исследовать эффект синхронизации в движении молекулярных моторов, связанных с микротрубочкой. Некоторые возможности методики продемонстрированы с помощью компьютерного моделирования. Взаимодействия молекулярных моторов с микрофиламентами и микротрубочками принимают участие в процессах деления, передвижения, изменения формы клетки, в перемещениях органелл и веществ внутри клетки и между клетками. Развитие нанотехнологий открывает новые применения системам, основанным на вышеописанных биологических молекулах, которые способны передвигаться и перемещать вещества в заданном направлении. Так, в работе [11] подробно описываются возможные применения нано—машин, основанных на молекулярных моторах, которые взаимодействуют с микрофиламентами и микротрубочками, передвигаясь вдоль них. Одно из применений такой системы, реализованное на практике — нано-прибор для измерения силы связи рецептор-лиганд [12]. Прибор представляет собой поверхность с молекулярными моторами и двумя микротрубочками. В последние годы также достигнут значительный прогресс в создании литографических поверхностей, основанных на использовании молекулярных моторов и филаментов. С помощью таких поверхностей осуществляется направленное движение филаментов и контейнеров [13,14,15,16]. Следовательно, с помощью систем, включающих молекулярные моторы и микротрубочки, может быть реализована локальная доставка лекарственных препаратов внутрь живого организма. Так как, молекулярные моторы нано размеров, то доставка лекарственных препаратов может осуществляться на клеточном уровне. Кроме лекарственных препаратов, возможно доставлять приборы— сенсоры с целью диагностики живого организма. Применение возможно и в химии — для доставки катализаторов и веществ в микрореакторы.
Все вышесказанное свидетельствует о том, что системы, основанные на молекулярных моторах и микротрубочках, уже сейчас имеют применения на практике и большие перспективы в будущем, и, следовательно, исследование таких систем является актуальной задачей.
Цели диссертационной работы могут быть сформулированы следующим образом:
1. Провести комплексный анализ влияния технических параметров оптического твизера, динамических свойств исследуемого объекта и параметров окружающей исследуемый объект среды на точность экспериментально получаемых данных. Провести анализ влияния увеличения температуры исследуемого объекта и окружающего его раствора из-за абсорбции света объектом на способность оптической ловушки удерживать этот объект.
2. Разработать новый оптический твизер с расширенными возможностями, который позволяет: а) работать как с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, так и с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами, что позволит исследовать объекты различных размеров, манипулировать объектами в х, у, z направлениях, создавать и измерять силы в широком диапазонеб) одновременно наблюдать исследуемые объекты и манипулировать ими в обеих конфигурациях оптического твизерав) работать с флуоресцентными объектамиг) создавать несколько оптических ловушек в плоскости образца для одновременного манипулирования несколькими объектами или сложными объектами.
3. Произвести калибровку оптического твизера для разных размеров частиц, в конфигурациях твизера с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом и двумя встречными лучами. Измерить другие важные характеристики оптической ловушки оптического твизера.
4. Показать возможность применения оптического твизера для исследования различных объектов.
5. Разработать новый метод исследования взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой с помощью оптического твизера. Провести теоретическое и экспериментальное исследование взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой.
Научная новизна и практическая ценность работы:
1. Впервые представлен и реализован на практике оптический твизер, позволяющий работать как с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, так и с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами. Новый оптический твизер позволяет одновременно и манипулировать исследуемыми объектами, и визуально наблюдать их. Новый оптический твизер также позволяет:
1. Манипулировать объектами микронного и субмикронного размера в х, у, z направлениях.
2. Создавать и измерять силы от долей единиц до сотен пиконьютонов.
3. Работать с флуоресцентными объектами, что позволяет исследовать объекты нано размеров.
4. Одновременно работать с несколькими оптическими ловушками, что позволяет одновременно управлять несколькими исследуемыми объектами или исследовать сложные системы.
2. Разработан новый метод с использованием оптического твизера для исследования взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой. Метод позволяет исследовать динамические свойства молекулярных моторов и микротрубочки, исследовать процессы синхронизации при движении группы моторов вдоль микротрубочки, оценить силы, возникающие при воздействии молекулярных моторов на микротрубочку, получить значения скоростей при перемещении молекулярных моторов вдоль микротрубочки и их зависимости от величины и направления внешней нагрузки, приложенной к молекулярным моторам.
В соответствии с вышесказанным на защиту выносится:
1. Устройство нового оптического твизера и принцип его работы.
2. Экспериментально полученные характеристики оптического твизера:
— калибровочные кривые — зависимость силы, с которой частицы разного диаметра удерживаются в оптической ловушке, от мощности лазерного луча, в случае оптической ловушки, образованной как одним сфокусированным лучом, так и двумя встречными лучами;
— устойчивость и радиус действия оптической ловушки;
— экспериментальное подтверждение возможности исследования разных объектов с помощью предлагаемого оптического твизера.
3. Результаты теоретического и экспериментального исследования взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой.
4. Результаты компьютерного эксперимента с использованием оптического твизера для определения свойств взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой.
Публикации.
Основные результаты диссертации опубликованы в 6 печатных работах.
Структура и объем диссертации
.
Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Она включает в себя 124 страниц текста, 26 рисунков, 3 таблицы. Список цитированной литературы содержит 84 наименования.
2.7. Выводы и постановка задачи.
В первых двух главах рассмотрены задачи, которые могут быть решены с помощью оптического твизера, а также устройство оптического твизера и методы его калибровки. Показано, что при калибровке необходимо учитывать увеличение температуры жидкости внутри оптической ловушки и, как следствие этого, потери мощности. В результате нагревания частицы и окружающей ее жидкости возникает конвекция жидкости, в результате чего возникает дополнительная сила, которую также необходимо учитывать при калибровке оптического твизера. Увеличение температуры в окрестности небольших полистирольных частиц больше, чем в окрестности частиц.
84) я.
85) большого размера, поскольку абсорбция на частицах меньше. Следовательно, для частиц меньшего диаметра влияние силы, возникающей в результате конвекции жидкости, более существенно. Точность измерения возрастает при уменьшении вязкости среды, в которой находится исследуемый объект у, и скорости движения образца, что позволяет уменьшить частоту отсечки fa. Для исследуемого объекта, связанного со сферической частицей высокой константой упругости к5, точность измерения смещения частицы возрастает. Отношение сигнал — шум не зависит от коэффициента к, характеризующего силу оптической ловушки, но зависит от силы связи сферической частицы с исследуемым объектом ks, а также от частоты отсечки f0. Отношение сигнал — шум увеличивается при увеличении силы связи ks, уменьшения вязкости среды, в которой находятся зонд и исследуемый объект у, а также частоты отсечки f0.
Несмотря на то, что представленные варианты оптических твизеров позволяют успешно решать многие задачи, они ограничены по своим возможностям. Так, представленные на рисунке 6 оптические твизеры имеют оптическую ловушку, образованную только одним сфокусированным лучом. В такой конфигурации для удержания исследуемых объектов необходимо создать высокий градиент интенсивности в области оптической ловушки. Для этого используется объектив с высокой числовой апертурой и небольшим рабочим расстоянием, что в свою очередь накладывает ограничения на размер исследуемых объектов и на управление объектами в аксиальном направлении, вдоль распространения луча. Эти недостатки возможно устранить в случае использования оптического твизера с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами. В этом случае исследуемый объект удерживается в оптической ловушке преимущественно за счет сил рассеяния, направленных вдоль встречных лучей, при этом нет необходимости создавать большой градиент интенсивности света в области оптической ловушки. Такая оптическая ловушка может быть создана с помощью двух объективов с небольшой числовой апертурой, направляющих лучи на встречу друг другу. Но при этом возникает сложность с одновременной визуализацией исследуемого объекта и его манипулированием, так как систему из двух объективов необходимо скооперировать с микроскопом. Обобщая материал, изложенный в первых двух главах, можно сформулировать следующие задачи:
1. Необходимо разработать новый оптический твизер, который позволит: а) проводить исследования как с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, так и с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами. Это позволит исследовать объекты различных размеров, манипулировать объектами в х, у, z направлениях, создавать и измерять силы в широком диапазонеб) одновременно наблюдать исследуемые объекты и манипулировать ими в обеих конфигурациях оптического твизерав) работать с флуоресцентными объектамиг) создавать несколько оптических ловушек в плоскости образца для одновременного манипулирования несколькими или сложными объектами.
2. Произвести калибровку оптическиго твизера для разных размеров частиц в конфигурациях твизера с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом и двумя встречными лучами.
3. Измерить характеристики оптической ловушки оптического твизера.
4. Показать возможность применения оптического твизера для исследования различных объектов.
5. Разработать новый метод исследования взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой с помощью оптического твизера. Провести теоретическое и экспериментальное исследование взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой.
ГЛАВА 3.
Оптический твизер
В этой главе описан новый оптический твизер, оптическая часть которого показана на рисунке 9 [72]. Этот оптический твизер был практически реализован и опробован в экспериментах по исследованию взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой для манипулирования полистирольными частицами различного размера. Показано, что возможно также манипулирование масляными каплями во вводном растворе и полыми сферическими полимерными капсулами. Оптический твизер, представленный на рисунке 9, позволяет работать как с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, так и с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами, один из которых проходит по оптическому пути от лазера до объектива и сфокусирован над объективом, другой проходит через конденсор. Для оптического твизера с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, используется объектив с увеличением 100х, с большой числовой апертурой и с коротким рабочим расстоянием в направлении z оси луча, что накладывает ограничение на перемещение объектов в z направлении и на размер исследуемых объектов. Так, перемещение объектов в z направлении от стенки емкости, в которой находится раствор с исследуемыми объектами, ограничено рабочим расстоянием объектива за вычетом толщины стенки емкости. При исследовании динамических свойств объекта, находящегося вблизи стенки емкости, необходимо учитывать влияние стенки. Возможный размер исследуемых объектов также ограничен рабочим расстоянием объектива и не может превышать максимально возможного расстояния от стенки емкости. Оптический твизер с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, прост в обращении и позволяет получать большие значения сил для частиц небольшого размера. Однако оптический твизер с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами, позволяет использовать объектив с большим рабочим расстоянием и, следовательно, манипулировать объектами большого размера и перемещать их в z направлении на значительные расстояния, т. е. не имеет недостатков, присущих твизеру, оптическая ловушка которого образованна одним сфокусированным лучом. Следовательно, оптический твизер, представленный на рисунке 9, включает как преимущества твизера с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, так и оптического твизера, оптическая ловушка которого образована двумя встречными лучами. Другим преимуществом оптического твизера, представленного на рисунке 9 и его отличие от других вариантов, является то, что для создания оптической ловушки и наблюдения за исследуемыми объектами используется один и тот же объектив и конденсор микроскопа. Оптический твизер, представленный на рисунке 9, позволяет работать с флуоресцентными объектами, что позволяет визуально наблюдать объекты малых размеров и одновременно манипулировать ими. Длина волны рабочего лазера оптического твизера лежит в инфракрасном диапазоне, что не оказывает негативного влияния на работу с биологическими и флуоресцентными объектами, возбуждение которых происходит в диапазоне частот выше инфракрасного. С помощью гальвано-сканирующего зеркала оптического твизера, представленного на рисунке 9, возможно создание нескольких оптических ловушек в плоскости образца. При этом с компьютера осуществляется перемещение ловушек в заданных направлениях и с заданными скоростями. Несколько оптических ловушек позволяют одновременно управлять несколькими объектами или сложными объектами. Так, исследуемый объект может быть захвачен в нескольких точках, далее возможно перемещение, растягивание или сжатие объекта, измерение его динамических и эластических свойств.
Рис. 9. Схема оптического твизера. Для части оптического твизера, изображенной слева на сером фоне, показан вид с боку, вертикальная плоскость х, z, для другой части оптического твизера, изображенной справа на белом фоне, показан вид сверху, горизонтальная плоскость х, у. В схеме используются следующие обозначения: L-, LRj, PPS — линзы, fj — фокусное расстояние линз, Mi — зеркала, D- - диафрагмы, МС — конденсор, МОмикрообъектив, О — объектив, Рг М6 — призма, В Si — разделительные кубы, GsM — гальвано-сканирующие зеркало, ML — подсветка микроскопа, Pjполуволновые пластинки. Стрелками ft, И на конденсоре МС и объективе микроскопа МО показано направление лучей, которыми образуется оптическая ловушка в плоскости образца.
3.1. Лазер
Экспериментальная установка, представленная на рисунке 9, включает три источника света: основной рабочий Nd: YAG^a3ep с длиной волны Д=1064 нм, ТЕМоо модой и максимальной мощностью 5 Ватт и два вспомогательных лазера, работающих в видимом диапазоне для визуализации оптического пути, настройки и калибровки оптического твизера.
Выбор длины волны рабочего лазера является важной задачей при конструировании твизера, если предполагается использовать оптический твизер для исследования биологических объектов. Например, необходимо брать во внимание то, что такой биологический пигмент, как гемоглобин, абсорбирует свет в видимом диапазоне. Этот эффект менее значим в диапазоне частот, близком к инфракрасному, выше 800 нм. За пределами 800 нм свет абсорбируется водой в большей степени, чем биоматериалами [17]. Поскольку из двух вариантов наиболее приемлемым является нагрев окружающей биообъект среды, а не самого объекта и если при этом уровень мощности и рабочий период лазера поддерживаются на минимальном уровне, то это позволяет избежать пагубного влияния излучения на биологические объекты [6]. При мощности луча 80 мВт и предположении величины коэффициента абсорбции «0.1 см» 1, температурный рост оценивается в несколько сотых градуса [19]. Таким образом, для исследования биологических объектов наибольший компромисс достигается в инфракрасном диапазоне частот лазера. Кроме того, следующим преимуществом лазера с инфракрасным диапазоном частот является возможность работы с флуоресцентными объектами. Так, представленный на рисунке 9 твизер позволяет манипулировать флуоресцентными частицами, возбуждение которых осуществляется с помощью люминесцентной лампы, установленной в микроскопе. Таким образом, возбуждение и излучение частицы осуществляется в видимом диапазоне, а манипулирование — в инфракрасном диапазоне частот, и эти процессы независимы. В тоже время лазер с инфракрасным диапазоном частот требует использования оптических элементов, оптимизированных под этот диапазон частот, т. е. потери на оптических элементах должны быть минимальны для частоты лазера. Недостатком использования лазера с длиной волны «к = 1064 нм является усложнение настройки оптического твизера из—за невидимости луча невооруженным глазом, и, следовательно, использования дополнительного оборудования для визуализации луча. Работа с Nd: YAG-^a3epOM требует соблюдения норм безопасности. Так, необходимым является наличие защитных очков, которые отфильтровывают инфракрасную компоненту света, создаваемую работающим лазером. Лазер должен быть установлен ниже уровня глаз, параллельно оптическому столу. При процедуре регулировки должна быть использована минимальная мощность. Также, должна быть установлена блокирующая свет система на выходе, чтобы предотвратить воздействие света на людей за пределами лаборатории. В экспериментальной установке (см. рис. 9) лазер установлен параллельно оптическому столу на высоте 1 м, все оптические элементы расположены перпендикулярно распространяющемуся лучу.
3.2. Мощность лазера.
Для точной регулировки лазера, а также для измерения эффективности оптических элементов необходимо определить мощность лазера в разных точках оптического пути. Измерения мощности лазера на оптическом пути позволяют сделать выводы об эффективности оптических элементов и найти точки, в которых потери мощности являются наибольшими. Мощность лазера измеряется с использованием измерителя мощности. Мощность измеряется в точках оптического пути, в которых диаметр луча лазера не превышает диаметра окна на входе детектора, что позволяет измерять суммарную интенсивность лазера. Экспериментально мощность была измерена непосредственно на выходе лазера, на выходе разделительного куба BSi, перед объективом, после конденсора.
Мощность лазера задается с компьютера через напряжение источника питания лазера. Таким образом, мощность лазера на экране монитора представлена током источника и выражена в Амперах. Измеренные кривые преобразования величины тока источника в Амперах в мощность лазера, выраженную в Ваттах, показаны на рисунках 10−13. Мощность, измеряемая на выходе лазера, принимается за 100% мощности и далее рассматривается падение мощности от 100%, в зависимости от оптического пути. Уменьшение мощности вследствие прохождения луча по оптическому пути от лазера до микроскопа на выходе разделительного куба BSi составляет 47%. Разделительный куб BSi делит световой луч на два, распределение интенсивности между двумя лучами зависит от поляризации входного луча. Следовательно, распределение интенсивности между двумя лучами может быть управляемо с помощью полуволновой пластинки, установленной перед разделительным кубом BSi. Измеренные значения мощности на выходе разделительного куба BSj для обоих лучей при различных поворотах полуволновой пластинки приведены на рисунке 11. Для конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, уменьшение мощности вследствие прохождения луча по оптическому пути от лазера до входа микрообъектива составляет 81%, используемый для этой конфигурации микрообъектив с увеличением 100х уменьшает мощность еще на 72% от входной величины мощности. Зависимости мощности от тока источника питания лазера, измеренные непосредственно на выходе лазера и перед входом микрообъектива, в конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, показаны на рисунке 10. Для конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами, распределение интенсивности между двумя лучами зависит от поляризации входного луча и, следовательно, поворота полуволновой пластинки, находящейся перед разделительным кубом BSi. Уменьшение мощности вследствие прохождения луча по оптическому пути от лазера до входа микрообъектива составляют 86% при повороте полуволновой пластинки на угол 0°, 89% при 15°, 94% при 30°, зависимости мощности от тока источника питания лазера показаны на рисунке 12. Для оптического пути, от лазера через конденсор до плоскости образца, уменьшение мощности составляет 91% при повороте полуволновой пластинки на 45°, 93% при 30°, 98% при 15°, зависимости мощности от тока источника питания лазера показаны на рисунке 13. Для конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами, используется микрообъектив с увеличением 40х, который увеличивает потери мощности еще на 71% от входной величины мощности.
6000 50 004 000 3000 О, 2000 1000 0.
Я Я у входа объектива —•—на выходе лазера.
Рис. 10. Мощность лазерного луча в зависимости от тока источника питания лазера, измеренная непосредственно на выходе лазера и перед объективом в конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом. Падение мощности составляет 81%.
2000н /¦л.
1500о," .
5000 ТГ- 0° 1U 45° ТГ- 15° 1U 30° fr 30° 15е х.
12 14.
7, А.
Рис. 11. Мощность лазерного луча в зависимости от тока источника питания лазера, измеренная на выходе разделительным кубом BSi для лучей ft — проходящего по часовой стрелке к объективу, II — проходящего против часовой стрелки к конденсору, при поворотах полуволновой пластинки на различные углы.
800 700 600 500 400−1 300.
200 100.
— 15' 30' X У у Аю.
12 14.
J, А.
1 20.
Рис. 12. Мощность лазерного луча в зависимости от тока источника питания лазера, измеренная перед объективом при поворотах полуволновой пластинки на углы 0°Д5°, 30о.
500-,.
400 н.
Й 300 2 2D0-I.
45' .-30' 15е у.
У' у Л X лх у".
I, А.
Рис. 13. Мощность лазерного луча в зависимости от тока источника питания лазера, измеренная в плоскости образца для луча, проходящего против часовой стрелки через конденсор при поворотах полуволновой пластинки на углы 15°, 30°, 45°.
Однако для знания мощности непосредственно в области оптической ловушки, где происходит захват исследуемого объекта, необходимо оценить также потери, возникающие вследствие прохождения светом стеклянной пластинки толщиной от 70 мкм до 2 мм (стенки стеклянной емкости, где находится раствор с исследуемыми объектами). Потери мощности луча из-за аберрации света при прохождении луча через границу масло — стекло — вода, потери из-за нагрева раствора, в котором находятся частицы. Нагрев раствора происходит из-за абсорбции света. Кроме того, потери возникают из-за абсорбции света самой частицей. В предыдущей главе был приведен теоретический расчет, позволяющий оценить потери, возникающие из-за абсорбции света одновременно раствором и измеряемой частицей. Тем не менее, учесть все факторы не представляется возможным.
Надо заметить, что существует множество методов, позволяющих уменьшить потери. Так, использование оптических элементов с покрытием, которое снижает отражение в инфракрасном диапазоне, позволяет снизить рассеяние мощности на оптическом пути, но использование таких элементов значительно увеличивает стоимость экспериментальной установки.
3.3. Оптика.
Оптический твизер включает два основных элемента — микроскоп и лазер, а также набор оптических элементов — зеркал и линз, составляющих путь от источника света — лазера до микроскопа, где происходит визуализация исследуемого объекта. В разработанном твизере используется оптический микроскоп фирмы ZESS, внутренняя оптическая схема которого представлена на рисунке 9. К сожалению, оптические элементы внутри микроскопа не оптимизированы под инфракрасный диапазон частот и, следовательно, потери в мощности луча от Nd: YAG^a3epa на участке пути, включающем микроскоп, максимальны. Микроскоп снабжен двумя объективами, которые используются для разных конфигураций оптического твизера. Оптический твизер, представленный на рисунке 9, возможно использовать в двух различных конфигурациях — с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами, и с ловушкой, образованной одним лучом.
В конфигурации оптического твизера (рис. 9) с ловушкой, образованной двумя встречными лучами, используется микрообъектив МО с увеличением 40х, числовой апертурой 0.6 и рабочим расстоянием 1.8 мм. Такая конфигурация оптического твизера позволяет управлять частицами в трех направлениях — х, у, z и перекрывает большой диапазон диаметров частиц, так как позволяет управлять не только частицами малого размера, но и частицами с большим диаметром.
Можно также использовать оптический твизер с ловушкой, образованной одним лучом, для этого используется микрообъектив МО с увеличением 100х, числовой апертурой 1.4, объектив требует наличие масла между зрачком объектива и стенкой емкости образца. В такой конфигурации луч сфокусирован на расстоянии порядка 150 мкм от зрачка микрообъектива и, следовательно, управление частицами происходит преимущественно в плоскости — х, у. В конфигурации с одним лучом оптический твизер может быть упрощен, так как не требует разделительного куба BSi и элементов оптического пути, проходящего от разделительного куба BSi до конденсора. Такая конфигурация оптического твизера упрощает настройку оптической системы твизера, а также управление частицами.
Оптический путь от лазера до микроскопа должен быть выбран с учетом размерностей и специфики всех оптических элементов. Все элементы оптического пути описываемой установке, показаны на рисунке 9. При прохождении разделительного куба BSi луч разделяется на два луча — идущий снизу вверх или по часовой стрелке и сверху вниз или против часовой стрелки. Встречаясь в фокусе над объективом, лучи образуют оптическую ловушку, размер которой может быть оптимизирован под размер исследуемого объекта.
Интенсивности проходящего через разделительный куб BSi и отраженного под углом 90° лучей могут быть различны и зависят от поляризации луча. Для того чтобы уравнять интенсивности лучей и иметь возможность изменять их, перед разделительным кубом BSi вводится полуволновая пластинка, вращение которой позволяет изменять направление поляризации. Так как на пути луча, после BSi, идущего по часовой стрелке, встречается разделительный куб MBS, расположенный внутри микроскопа, то после BSi и перед входом в микроскоп также установлена полуволновая пластинка, после прохождения которой направление поляризации должно соответствовать максимуму интенсивности выходящего из микроскопа луча.
Луч инфракрасного лазера подводится к разделительному кубу BSi с помощью зеркал М4, Мз, М9, Мю и гальваносканирующего зеркала GsM. Гальваносканирующие зеркало GsM позволяет создавать несколько оптических ловушек в плоскости образца. Частота и углы вращения задаются с компьютера. Таким образом, луч, перемещаясь по заданной траектории, создает оптические ловушки в плоскости образца, расположение которых соответствует заданным параметрам. Кроме набора зеркал, оптический путь от YAG-лазера к разделительному кубу включает в себя телескоп, образованный двумя линзами Lb L2 с фокусными длинами f = 400 мм и f2 = 120 мм.
Введение
телескопа позволяет расширить луч, коэффициент увеличения телескопа равен отношению фокусных длин, М = f/ f2 «3:1. На пути от лазера до разделительного куба BSi установлены диафрагмы: D3 на расстоянии фокусной длины от линзы Ь2 и Di после зеркала М9. Основная цель диафрагм — отсекать лучи, образованные вследствие отражений от задних стенок зеркал. Кроме отсечения ненужных отраженных лучей, диафрагмы помогают при настройке оптической системы. Для того чтобы оптическая ловушка, образованная сфокусированным лучом от инфракрасного YAG-лазера, и отображаемые камерой в видимом диапазоне частицы были сфокусированы в одной плоскости, необходимо скомпенсировать разницу в фокусных плоскостях, возникающую из-за разницы в длинах волн инфракрасного и видимого света. Разница в фокусных плоскостях составляет порядка 50 мкм, в случае, если используется объектив 40х, и порядка 6 мкм при использовании объектива 100х. Таким образом, скомпенсировать разницу необходимо, только если используется конфигурация оптического твизера с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами. Для компенсации этой разницы между диафрагмой Di и гальваносканирующим зеркалом GsM установлен объектив с увеличением 5х и линза с фокусной длиной f = 60 мм.
После прохождения разделительного куба BSi оптический путь разделяется на два: 1) образованный системой из трех линз: PPS, разделителем MBS, линзой OL и микрообъективом МОв этом случае луч проходит по часовой стрелке- 2) путь против часовой стрелки представлен диафрагмой D2, призмой Рг М6, зеркалами М7, М8, телескопом, состоящим из линз LRi с фокусной длиной f=150 мм и линзой LR2, состоящей из двух линз с фокусными длинами f = 35 мм, f2 = 50 мм, разделителем BS2 и конденсором. Фокусное расстояние линзы LRi определяется по формуле:
1 1 1 ^ т + -г—гг> (86) где € - расстояние между линзами, составляющими 1ЛьТаким образом, изменение расстояния между линзами € позволяет подстраивать фокусное расстояние под необходимое значение. При смещении луча с помощью гальвано-сканирующего зеркала GsM, разделенные разделительным кубом BSi лучи в плоскости образца должны смещаться в одинаковом направлении. Призма Рг М6 играет роль зеркала, но при этом инвертирует луч таким образом, чтобы синхронизовать встречные лучи в плоскости образца S при перемещении луча с помощью гальвано-сканирующего зеркала GsM.
Система из трех линз PPS используется с двумя целями: для увеличения диаметра луча, с коэффициентом увеличения М = f/ f2, что необходимо для того, чтобы покрыть зрачок микрообъектива МО и скомпенсировать наличие оптовара OL внутри микроскопа.
С помощью призмы Рг М6, зеркал М7, М8 и разделителя BS2 луч от разделительного куба BSi направляется в конденсор. Телескоп LR2 — LRi выполняет две цели: увеличивает диаметр луча с коэффициентом увеличения М = fi/ f2, для того, чтобы покрыть зрачок конденсора и уравнять длины оптических путей для лучей, идущих по часовой стрелке и против часовой стрелки. Для того чтобы, при использовании гальвано-сканирующего зеркала GsM, лучи перемещались на одинаковое расстояние для сохранения целостности оптической ловушки, оптические пути для лучей должны быть одинаковы.
Необходимо, чтобы лучи были сфокусированы в плоскости образца, оси лучей совпадали и были перпендикулярны плоскости образца, сечение лучей имели круглую одинаковую форму. Форма выходящего луча является важным параметром в оценке эффективности оптической ловушки. Форма луча определяется параметрами микро-объектива — числовой апертурой. Однородная сферическая форма луча способствует образованию резкого градиента интенсивности и повышению эффективности оптической ловушки. Из-за аберрации света при прохождении луча через границу масло-вода, форма луча отклоняется от сферической [73].
3.4. Система визуализации.
Для наблюдения за частицами используется камера CCD (Cool Snap HQ, Roper Scientific, US), которая установлена на микроскопе. Данные с камеры в подаются на компьютер. Управление камерой и анализ изображения осуществляется с помощью специального программного обеспечения Simple PCI. Видеосигнал подается к телевизору и записывающему устройству, где также происходит визуализация и запись изображения. Для визуализации инфракрасной оптической ловушки, то есть фокуса, используется камера ICC, которая также подает изображение на компьютер. Время экспозиции камеры, по возможности, должно быть минимально, что позволяет работать в реальном времени. Время экспозиции определяет скорость обновления кадров. Для оптического твизера, представленного на рисунке 9, время экспозиции камеры установлено равным 0.02 сек.
3.5. Настройка оптической системы твизера.
Экспериментальная установка (см. рис. 9) включает YAG-лазер, работающий в инфракрасном диапазоне. YAG-лазер должен быть настроен с учетом всех оптических элементов, входящих в экспериментальную установку. Конечной целью настройки оптической системы твизера является создание оптической ловушки в плоскости образца с заданными параметрами. Для визуализации инфракрасного луча от YAG-лазера используется специальная детектирующая пластинка IR. В целях безопасности, регулировку инфракрасного лазера необходимо производить при минимальных мощностях.
Экспериментальная установка (см. рис. 9), кроме основного рабочего YAG-лазера включает HeNel-лазер и HeNe2 диодный лазер. Эти два дополнительных лазера необходимы для настройки оптической системы и визуализации оптического пути, так как, в отличие от YAG-лазера, работают в видимом диапазоне. Так, HeNel-лазер используется для настройки системы, включающей: разделительный куб BSi, PPS, разделительный куб MBS, линзу OL, микрообъектив МО. Использование Не№ 2-лазера позволяет провести настройку системы, состоящей из BSi, призмы Рг М6, системы двух линз LR.2, зеркала М8, линзы LR]- разделителя BS2, конденсора. Каждое зеркало и линза имеют до шести степеней свободы, которые используются при настройке оптического твизера. Необходимо добиться того, чтобы оси сфокусированных лучей: луча, исходящего из микрообъектива МО и луча, исходящего из конденсора, совпадали, были взаимно параллельны и перпендикулярны плоскости образца.
Для работы с частицами (объектами) необходимо развести фокусы лучей вдоль оптической оси. Для этого необходимо изменить расстояние между микрообъективом и конденсором. Таким образом, между фокусами лучей образуется промежуток, в который захватывается частица. Для больших частиц фокус луча, исходящего из МО, должен быть выше фокуса луча, исходящего из конденсора, а для маленьких частиц — наоборот (см. рис. 14). Расстояние разведения фокусов лучей лучше подбирать таким образом, чтобы для объектов данного размера сила удержания объекта в оптической ловушке была максимальна.
3.6. Сканирование.
Вращение гальванических зеркал, в конфигурации твизера с двумя лучами, перемещает лучи с различной амплитудой и даже в противоположных направлениях, при этом оптическая ловушка разрушается, что делает работу с несколькими ловушками невозможной. Проблема противоположных направлений решена введением призмы Рг Мб вместо зеркала. Призма Рг Мб играет роль зеркала, но при этом инвертирует луч таким образом, чтобы разделенные разделительным кубом BSi лучи в плоскости образца S при перемещении луча с помощью гальвано сканирующего зеркала GsM смещались в одинаковом направлении,.
Проблема соответствия амплитуд сдвигов лучей может быть решена изменением увеличения LRi-LR2 телескопа. На практике, проблема может быть решена изменением фокальной длины LR2, для этого изменяется расстояние между двумя линзами (86), входящими в LR2 и корректировкой положения системы из двух линз LR2 вдоль оптической оси.
Перемещение луча с заданной частотой и амплитудой с помощью гальвано-сканирующего зеркала GsM, позволяет создавать несколько оптических ловушек в плоскости образца S.
3.7. Управление частицами оптическим твизером.
Как было отмечено выше, оптический твизер позволяет удерживать частицу в пределах оптического фокуса и манипулировать этой частицей. Оптический твизер, представленный на рисунке 9, позволяет удерживать и манипулировать частицами, размер которых варьируется в широком диапазоне. Твизер, представленный на рисунке 9, был откалиброван для частиц с диаметром от 0.984 мкм до 16.3 мкм.
Оптический твизер, представленный на рисунке 9, может быть использован в двух различных конфигурациях: 1) с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучамитакая конфигурация подразумевает наличие разделительного куба BSi и дополнительного оптического пути, проходящего против часовой стрелки (см. рис. 9) — 2) без разделительного куба BSi, что позволяет использовать луч с большей мощностью, направленный к системе линз PPS и далее к микрообъективу МОв такой конфигурации оптическая ловушка образована только одним лучом, проходящем по часовой стрелке. В первой конфигурации возможно манипулировать не только частицами малого размера, но и частицами большого диаметра. С другой стороны, для большого набора задач, достаточно наличие конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной только одним лучом, что упрощает управление частицами, но при этом управление частицами преимущественно осуществляется только в плоскости х, у.
Исследуемый образец представляет собой раствор с исследуемыми частицами или другими объектами. Раствор заключен в прозрачную емкость. Так, для конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, использовалась емкость, состоящая из двух стеклянных склеенных пластин диаметром 70−100 мкм и расстоянием между пластинами — стенками емкости 50−70 мкм. Для конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами, использовалась кварцевая емкость, с расстоянием между стенками 1 мм, длиной 40 мм, шириной 10 мм, толщиной стенок 1.25 мм.
Задача перемещения частиц относительно внешней среды — жидкости, в которой находятся частицы, может быть решена перемещением оптической ловушки при фиксированном положении внешней среды или перемещением внешней среды при фиксированном положении оптической ловушки. В конфигурации описываумого оптического твизера (см. рис. 9) используется моторизированная платформа, на которой закрепляется образец. Управление платформой осуществляется с компьютера, при этом задаются координаты, скорость и ускорение. Используемая в твизере (см. рис. 9) моторизированная платформа позволяет перемещать образец в диапазоне скоростей от 0.001 до 40 мм/с и в трех направлениях — х, у, z. При перемещении платформы с образцом положение оптической ловушки фиксировано.
Процедура захвата частицы. Образец представляет собой стеклянную емкость, в которой находится раствор с частицами (см. рис 7). Для конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, захват частицы в ловушку осуществить труднее, если фокус движется вглубь образца, что происходит в результате сферической аберрации на границе масло — стекло — вода [73], так как используемый объектив для этой конфигурации требует наличие масла между зрачком объектива и стенкой емкости. Для того чтобы поймать частицу в оптическую ловушку, оптический фокус устанавливается выше частицы, и устанавливается достаточно большое значение мощности до тех пор, пока частица не попадет в ловушку. После того, как частица попадет в ловушку, устанавливается необходимая мощность. При изменении позиции фокуса частица также изменяет положение. Таким образом, возникает возможность перемещать отдельную частицу в направлениях х, у, z осей координат с заданной скоростью и ускорением. Для конфигурации оптического твизера с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами, для захвата частицы в оптическую ловушку необходимо развести фокусы встречных лучей на расстояние, при котором частица наиболее устойчива в оптической ловушке, поскольку сила, с которой частица удерживается в ловушке, зависит от расстояния между фокусами лучей (см. рис. 14).
Управление флуоресцентными частицами. Для работы с флуоресцентными частицами необходимо установить дополнительные фильтры. В микроскоп оптического твизера, представленного на рисунке 9, встроена люминесцентная лампа и три различных комбинации фильтров для манипулирования различными флуоресцентными частицами. Каждая комбинация фильтров содержит два фильтра и разделительный куб (см. таблицу 1). Один из фильтров соответствует длине волны возбуждения частицы и устанавливается после люминесцентной лампы, пропуская свет только с необходимой для возбуждения частицы длиной волны. Второй фильтр соответствует длине волны света, излученного флуоресцентными частицами, пропуская к камере только необходимую длину волны света, дающую информацию о местоположении и движении частиц. Разделительный куб должен отражать свет на длинах волн, соответствующих длине волны возбуждения частицы, направляя свет от люминесцентной лампы к частицам и пропускать свет на длине волны излученного света флуоресцентными частицами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
Выше кратко был рассмотрен ряд задач, которые успешно решаются при помощи оптического твизера. Орисаны принципы работы оптического твизера и методы калибровки оптического твизера. Проведен анализ влияния технических параметров оптического твизера, динамических свойств исследуемого объекта, параметров окружающей исследуемый объект среды на точность экспериментально получаемых данных. Проведен анализ влияния увеличения температуры из—за абсорбции света исследуемого объекта и окружающего его раствора на способность оптической ловушки удерживать этот объект. Оптический твизер позволяет не только решать многие исследовательские задачи, но может быть также использован для управления био-процессами и манипулирования биологическими объектами. Оптический твизер также используется в комбинации с другими спектроскопическими методами. Развитие этого нового метода исследований, несомненно, позволит решить множество исследовательских и прикладных задач биологии. Основные результаты работы.
1. Разработан и практически реализован новый оптический твизер, получены следующие его характеристики: а) оптический твизер позволяет создавать и измерять силы в диапазоне от 0.5 — 100 пНб) позволяет работать как с оптической ловушкой, образованной одним сфокусированным лучом, так и с оптической ловушкой, образованной двумя встречными лучами, при этом, возможно одновременно наблюдать исследуемые объекты и манипулировать ими в обеих конфигурациях оптического твизерав) с помощью оптического твизера возможно удерживать и манипулировать частицами в х, у, z направлениях, размер которых варьируется в широком диапазоне. Оптический твизер откалиброван для сферических полистирольных частиц с диаметром от 0.984 мкм до 16.3 мкм. Такие частицы могут быть легко захвачены в оптическую ловушку и могут быть использованы в качестве посредников между исследуемым объектом и оптическим пинцетом. Показано, что кроме твердых полистирольных частиц возможно оптически манипулировать маслеными каплями в водном растворе и полимерными полыми капсуламиг) оптический твизер позволяет работать с флуоресцентными объектами, что позволяет визуально наблюдать объекты малых размеров и одновременно манипулировать имид) с помощью представленного оптического твизера возможно создавать несколько оптических ловушек в плоскости образца. При этом с компьютера осуществляется перемещение ловушек в заданных направлениях и с заданными скоростями. Несколько оптических ловушек позволяют одновременно управлять несколькими объектами или сложными объектами. Так, исследуемый объект может быть захвачен в нескольких точках, далее возможно перемещение, растягивание или сжатие объекта, измерение его динамических и эластических свойств.
2. Описан новый метод исследования свойств взаимодействия молекулярных моторов с микротрубочкой: влияния силы, приложенной в разных направлениях к молекулярным моторам, на скорость их перемещения по микротрубочке, синхронизации движения группы моторов вдоль микротрубочки, влияния заторов на мобильность моторов. Разработанный экспериментальный метод реализуется при использовании оптического твизера. Экспериментально показано, что расстояние, на которое частица со связанными с ней молекулярными моторами перемещается вдоль микротрубочки, увеличивается с увеличением числа связанных с микротрубочкой моторов. Из-за заторов в движении моторов при их большой плотности на частице происходит замедление движения частицы по микротрубочке. В работе предложен математический аппарат для описания механических, динамических и статистических свойств молекулярных моторов, взаимодействующих с микротрубочкой. С помощью компьютерного моделирования продемонстрированы некоторые возможности методики. Предложенный метод упрощает проведение эксперимента и имеет значительные преимущества по объему получаемой информации.
