Лечение резистентных и осложненных форм множественной миеломы с учетом чувствительности опухолевых клето in vitro

Актуальность проблемы Наибольшую актуальность в проблеме повышения противоопухолевой эффективности химиотерапии множественной миеломы (ММ) представляют резистентные формы заболевания. Частота первичной резистентности ММ при оценке ответа на лечение по 50% редукции Pig составляет примерно 20% случаев, а вторичная резистентность после второго рецидива отмечается практически у всех больных (Андреева Н.Е., 1995, Голенков А. К., 1995). В настоящее время данная проблема разрабатывается по нескольким направлениям и включает в себя изучение клинической эффективности новых противоопухолевых препаратов с различными механизмами действия, создание более эффективных химиотерапевтических программ на основе их комбинаций, высокодозную химиотерапию с пересадкой аутологичных и аллогенных стволовых кроветворных клеток, а также лечение синдромов ММ, осложняющих течение заболевания.

Определение чувствительности опухолевых клеток при лейкозах к цитостатическим препаратам in vitro (Kaspers G.J.L., Veerman A.J.P., 1997) также можно рассматривать как актуальное направление в преодолении резистентности миеломных клеток к противоопухолевым препаратам. Причем функция этого подхода достаточно широкая и заключается в скрининговом поиске новых противоопухолевых препаратов с высокой активностью против миеломы (Yasui Н. et al, 2004; Mitsiades C.S. et al, 2004), создании эффективных комбинаций цитостатаков (детерминированный по чувствительности in vitro принцип), что значительно эффективнее, чем эмпирический подход. Это подтверждается работами Berenson J.R., 2004, показавшими in vitro, что комбинация триоксида мышяыса (ATO), мелфалана и аскорбиновой кислоты создает более глубокий противоопухолевый эффект, чем каждый препарат в отдельности или комбинация из двух препаратов.

Полученные результаты in vitro были подтверждены при клиническом исследовании данной комбинации препаратов у больных с рецидивной и рефрактерной ММ.

Бисфосфонаты широко используются в качестве синдромного лечения ММ. Включение их в программы противоопухолевой терапии ММ позволило значительно усилить избирательное воздействие на костнодеструктивный синдром и повысить клиническую результативность лечения. В последнее время появились экспериментальные исследования, свидетельствующие о том, что бисфосфонаты обладают противоопухолевой активностью при ММ (Clezardin P. et al, 2000, Kuroda J. et al, 2003]. Это очень важный для клинической гематологии научный факт, требующий дальнейшего экспериментального и клинического подтверждения.

Весьма актуальным является пересмотр с этих позиций того химиотерапевтического ресурса, который широко используется в настоящее время в противоопухолевой химиотерапии и редко применяется при ММ, а также переоценка эффективности известных комбинаций противоопухолевых препаратов с учетом геста in vitro. Результаты этих исследований обладают высокой актуальностью при лечении осложнений ММ, таких как внутриспинальный опухолевый рост и костнодеструктивный процесс.

Цель исследования: совершенствование противоопухолевой химиотерапии резистентных форм и осложнений множественной миеломы на основе детерминированного принципа по результатам чувствительности опухолевых плазмоцитов костного мозга in vitro к цитостатическим препаратам с использованием DiSC-метода.

Задачи исследования:

1. Выявить клиническую значимость теста определения чувствительности опухолевых плазмоцитов костного мозга к цитостатическим препаратам in vitro DiSC-методом в скришшге у рефрактерных больных множественной миеломой.

2. Провести фармакодинамическое моделирование in vitro опухолевых плазмоцитов костного мозга больных множественной миеломой, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом, с различными концентрациями цитозара.

3. Разработать метод лечения больных множественной миеломой, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом, интратекальной химиотерапией цитозаром с учетом чувствительности опухолевых клеток in vitro.

4. Изучить клиническую эффективность детерминированного по чувствительности in vitro лечения сарколизином резистентных форм множественной миеломы.

5. Определить противоопухолевую активность бисфосфонатов при множественной миеломе in vitro путем окрашивания ДНК апоптотических клеток пропидий йод ид ом и изучить их влияние на выживаемость больных.

Научная новизна На основании проведенного скринингового исследования чувствительности опухолевых плазмоцитов костного мозга in vitro больных ММ к цитостатическим препаратам DiSC-методом выявлен высокий процент чувствительных больных к цитозару, который ранее не применялся при лечении данной нозологической формы. По результатам КТ и МРТ исследований дана подробная характеристика внутриспинального опухолевого роста, описаны его различные варианты. С учетом полученных in vitro данных разработан метод лечения больных ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом ИТ XT цитозаром (патент № 2 213 563 от 10.10.2003 г.).

Также DiSC-методом обнаружена сохранившаяся у 100% резистентных больных ММ чувствительность миеломных клеток костного мозга in vitro к сарколизину и алкерану, входящим в индукционные и противорецидивные ПХТ схемы, применение которых привело к формированию вторичной рефрактерности. Детерминированная по чувствительности in vitro терапия сарколизином с использованием принципа дозового преимущества позволила получить клинический ответ у рефрактерных больных ММ.

При изучении фармакодинамики бисфосфонатов — бонефоса и зометы в культуре миеломных клеток in vitro выявлен их дозозависимый противоопухолевый эффект.

Научно-практическая ценность Полученные в исследованиях in vitro с использованием DiSC-метода данные чувствительности опухолевых плазмоцитов костного мозга к цитостатическим препаратам, содержат новые сведения, объясняющие механизмы рефрактерности при ММ.

Практическая ценность работы заключается в том, что полученные в исследованиях in vitro DiSC-методом результаты чувствительности опухолевых плазмоцитов костного мозга позволяют расширить спектр противоопухолевых препаратов или использовать традиционные в режиме монотерапии с дозовым преимуществом при лечении рефрактерных больных ММ.

Разработанный метод интратекального введения цитозара больным ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом, позволяет непосредственно воздействовать на опухоль и достигать неврологической ремиссии.

Положення, выносимые на защиту.

1. Фармакодинамическое моделирование цитостатических препаратов in vitro в культуре миеломных клеток — важный преклинический этап совершенствования противоопухолевой химиотерапии резистентной ММ и ее осложнений.

2. Скрининг противоопухолевой активности 12 цитостатических препаратов в культурах миеломных клеток in vitro позволил выявить высокую противоопухолевую активность сарколизина (алкерана) и цитозара у больных ММ. ' '.

3. Предложен метод интратекальной химиотерапии цитозаром с учетом данных in vitro при ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом, позволяющий добиться уменьшения объема внутриспинальной опухоли у данной категории больных.

4. Детерминированная по чувствительности in vitro терапия рефрактерных больных ММ сарколизином с использованием принципа дозового преимущества позволяет получить клинический эффект.

Внедрение Результаты исследования внедрены в практику отделения клинической гематологии и иммунотерапии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М. Ф. Владимирского (МОНИКИ).

Публикации По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 2 в зарубежной печати.

Апробация Диссертация обсуждена на совместной научной конференции МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского с участием сотрудников отделений клинической гематологии и иммунотерапии, гастроэнтерологии, переливания кровилабораторий: клинико-диагностической, клинической иммунологии МОНИКИ, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭД и ТО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Материалы диссертации доложены на Московском областном терапевтическом обществе (ноябрь 2003 г.) и на научно-практической конференции гематологов Московской области (декабрь 2003 г.).

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрированного 25 таблицами и 11 рисунками. Состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 134 источника.

выводы.

1. Скрининговые исследования чувствительности опухолевых плазмоцитов костного мозга нелеченых и рефрактерных к программным курсам полихимиотерапии больных множественной миеломой к 12 цитостатическим препаратам (вепезид, рубомицин, цитозар, алкеран, сарколизин, доксорубицин, белустин, преднизолон, винкристин, цисплатин, метотрексат, дексаметазон) in vitro с использованием DlSC-метода по IC70 показали высокую чувствительность клеток опухоли к сарколизину в 80% и цитозару в 75,8% случаев.

2. В фармакодинамических моделях цитозара в культуре опухолевых клеток костного мозга in vitro больных множественной миеломой, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом, выявлена его высокая противоопухолевая активность на малых концентрациях (от 0,04 до 0,63 мкг/мл) при 96-ти часовой экспозиции, характеризующаяся гибелью в среднем от 40 до 70% плазматических клеток соответственно.

3. Клиническая эффективность предложенной интратекальиой химиотерапии цитозаром больных множественной миеломой, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом, характеризуется уменьшением объема внутриспинальной опухоли в группе больных с резистентным корешковым синдромом в среднем на 70% и на 46% в группе больных с нижним парезом, что сопровождается уменьшением корешковых болей и повышением двигательной активности.

4. Терапия сарколизином рефрактерных больных множественной миеломой по принципу дозового преимущества по чувствительности in vitro приводит к достоверному снижению сывороточного парапротеина в среднем с 5,3±0,6 до 3,4±0,4 г/%.

5. Исследование фармакодинамики бонефоса в культурах миеломных клеток in vitro показало, что он обладает противоопухолевой активностью,.

50% гибель опухолевых клеток получена на концентрации 1000 рМ (0,24 г/л), что не совпадает с зоной клинической эквивалентности.

6. В фармакодинамической модели зометы в 72 часовой культуре миеломных клеток in vitro получено достоверное повышение апоптоза до 21,3±3,5% при максимальной исследованной концентрации 60 рМ (0,016 г/л). Эта модель характеризуется клинической эквивалентностью в интервале между введениями препарата больному со 2-го по 21-й день.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лечение резистентных форм и осложнений ММ представляет собой достаточно трудную задачу для клинической гематологии. Частота первичной резистентности ММ, определяемой по 50% редукции Pig составляет примерно 20%, а вторичная резистентность после первого или второго рецидива отмечается практически у всех больных [1,6]. В настоящее время данная проблема разрабатыается по нескольким направлениям. Она включает в себя изучение клинической эффективности новых противоопухолевых препаратов, создание более эффективных программ противоопухолевой химиотерапии, высокодозную химиотерапию с пересадкой аутологичных и аллогенных стволовых гемопоэтических клеток, а также разработку патогенетически обоснованных программ лечения осложнений ММ.

В настоящее время сформировалось еще одно направление, позволяющее существенно повысить эффективность противоопухолевой химиотерапии ММ Речь идет об определении чувствительности опухолевых клеток к цитостатическим препаратам в культурах in vitro [65,66], которое выходит за рамки индивидуального подхода в подборе цитостатиков для преодоления резистентности.

В связи с этим целью наших исследований было совершенствование программ противоопухолевой химиотерапии резистентных форм и осложнений ММ с учетом результатов чувствительности опухолевых клеток in vitro к цитостатическим препаратам. Перед исследованиями были поставлены следующие задачи:

•выявить клиническую значимость теста определения чуствительности опухолевых плазмоцитов костного мозга in vitro DISCметодом к цитостатическим препаратам в скрининге у рефрактерных больных ММ.

•провести фармакодинамическое моделирование in vitro различных концентраций цитозара с опухолевыми клетками костного мозга больных ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом, для определения его противоопухолевой активности.

•разработать метод лечения больных ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом, интратекальной химиотерапией цитозаром с учетом чувствительности опухолевых клеток in vitro.

•изучить клиническую эффективность детерминированного по чувствительности in vitro лечения сарколизином резистентных форм ММ.

•определить противоопухолевую активность бисфосфонатов при MM in vitro путем окрашивания ДНК алоптотических клеток пропидий йодидом и изучить их влияние на выживаемость больных.

Диагноз ММ устанавливали с использованием всех общепринятых критериев диагностики этого заболевания. При резистентном корешковом синдроме (радикулопатии) или симптомах нижнего пареза больным проводилась КТ или МРТ позвоночника.

На первом этапе работы проведено скрининговое исследование чувствительности опухолевых плазмоцитов костного мозга in vitro в клинически эквивалентных концентрациях к 12 противоопухолевым препаратам: вепезид, рубомицин, цитозар, сарколизин, алкеран, доксорубицин, белустин, преднизолон, винкристин, цисплатин, метотрексат, дексаметазон.

Проведенные скрининговые исследования у 50 больных, включающих вновь диагностированною, осложненную и резистентную ММ, позволили оценить терапевтический ресурс указанных противоопухолевых препаратов.

Высокой вероятностью противоопухолевой активности по данным теста in vitro обладают: вепезид (91%), рубомицин (81%), сарколизин (80%), цитозар (75,8%) и алкеран (73%). Для дальнейшего клинического изучения были взяты два препарата: цитозар и сарколизин.

Предпосылками для клинического изучения цитозара при ММ послужили: возможность его использования для интратекальных введений при нейролейкозах, отсутствие данных о его противоопухолевом эффекте на плазмоклеточные опухоли, а также синдром внутриспинального опухолевого роста (19 из 70 больных ММ в наших наблюдениях), при котором интратекальное введение цитозара с учетом данных чувствительности in vitro патогенетически оправдано. Следует отметить, что к моменту начала исследований нам не удалось найти в литературе аналогичных данных.

Предпосылкой для клинического изучения сарколизина также послужили результаты скрининговой противоопухолевой фармакодинамики in vitro. Было обращено внимание на то, что противоопухолевая эффективность in vitro сарколизина несколько больше, чем алкерана. Скршшнговая концентрация сарколизина, на которой фиксируется эффект по 1С7о в два раза меньше (0,7 мкг/мл) по сравнению с концентрацией алкерана (1,4 мкг/мл). Также частота противоопухолевого ответа in vitro на сарколизин выше, чем на алкеран (80% и 73% соответственно).

Кроме того, при анализе результатов скрининга становится очевидным, что вероятность противоопухолевого эффекта каждого цитостатического препарата, включенного в программы М-2 и ЦСВП (циклофосфан не исследовался in vitro), которые были использованы в индукционном лечении, ниже, чем алкерана и сарколизина. Из этого следует, что доминирующим препаратом в программах М-2 и ЦСВП является алкеран (сарколизин) и при развитии резистентности к этим программам можно использовать принцип дозового преимущества сарколизина в режиме монотерапии.

Далее на основании результатов скрининговых исследований, показавших высокую эффективность щггозара в культуре миеломных клеток, были предприняты исследования, направленные на более глубокое изучение фармакодинамики препарата in vitro. Для этого использовали различные его концентрации: 0,04, 0,16, 0,63, 2,5 и 10 мкг/мл в 96-ти часовых культурах миеломных клеток костного мозга у 9 больных ММ, осложеннной внутриспинальным опухолевым ростом. Изучить противоопухолевую эффективность различных концентраций представлялось важным, так как предполагалось использование цитозара при внутриспинальном опухолевом росте. Очевидно, что клинические концентрации цитозара в плазме и ликворе различны, учитывая их объемы и величины разовых доз.

Анализ результатов фармакодинамического моделирования цитозара in vitro в культуре миеломных клеток показал, что цитозар обладает высокой противоопухолевой активностью на малых концентрациях от 0,04 до 0,63 мкг/мл, когда при 96-ти часовой экспозиции гибнет от 40 до 70% опухолевых клеток. Остаточные опухолевые плазмоциты (в среднем 30%) обладают высокой устойчивостью к цитозару. Для снижения количества живых опухолевых клеток с 30 до 10% необходимо было увеличить концентрацию препарата в 16 раз с 0,63 до 10 мкг/мл.

Проведенные исследования in vitro показали, что в фармакодинамической модели цитозар обладал хорошей цитотоксической активностью против миеломных клеток у больных ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом. Важным фактором исследований является активность цитозара, проявляющаяся на малых концентрациях, что может свидетельствовать об эквивалентности фармакодинамической модели in vitro и клинической фармакодинамике при его интратекальном введении. В связи с этим было проведено исследование клинической эффективности интратекально вводимого цитозара у 19 больных ММ, осложеннной внутриспинальным опухолевым ростом. При проведении КТ и МРТ позвоночника установлен узловой экстрадуральный опухолевый рост у 11 больных, диффузный рост (поражение нитей конского хвоста, нечеткая визуализация оболочек спинного мозга — интратекальный) — у 2, опосредованный рост (внедрение в спинномозговой канал фрагментов позвонков и дисков, разрушенных опухолью) — у 4, диффузный и опосредованный рост — у 2 пациентов.

Различия в клинической картине поражения нервной системы позволили разделить исследуемых больных на 2 группы. В первую вошли 7 больных с опухолевой радикулопатией, которая характеризовалась тяжелыми и резистентными корешковыми болями. Во вторую включено 12 больных с опухолевой миелопатией, проявляющейся нижними парезами и нарушениями функции тазовых органов у 3 больных.

Длительность интратекальной химиотерапии цитозаром в первой группе составила в среднем 4 месяца, в индукционную фазу препарат вводился 1 раз в неделю, а в фазу поддерживающего лечения — 1 раз в 2 месяца. Во второй группе длительность терапии составила 7 месяцев, в период индукции цитозар вводился 1−2 раза в неделю, а в период поддерживающего лечения 1 раз в 1,5 месяца. В результате проведенной интратекальной терапии цитозаром отмечено уменьшение внутриспинального опухолевого роста, оцениваемого по данным КТ и МРТ позвоночника, в первой группе на 70%, а во второй — на 46%.

Важным фактором эффективности предложенного метода лечения является положительная динамика клинического статуса, тяжесть которого оценивали по шкале Karnofsky. Установлено, что у больных ММ, осложненной корешковым синдромом, индекс Karnofsky, отражающий двигательную активность, повышался с 45 до 70 баллов. У больных с компрессионной миелопатией аналогичный показатель также имел положительную тендендшо (с 30 до 65 баллов). Это означает, что у практически обездвиженных больных появлялась возможность к самостоятельному передвижению.

Интенсивность корешковых болей, оцениваемая по визуально-аналоговой шкале, снижалась с максимального значения 10 ед. до 5,5 ед. у пациентов с ММ, осложненной корешковым синдромом и с 9,5 ед. до 4,5 ед. в группе больных с компрессионной миелопатией. Необходимо отметить, что в одном случае ММ, осложненной нижним вялым парапарезом, отмечалась самая высокая чувствительность миеломных клеток к цитозару среди наблюдавшихся больных. Это соответствовало клиническому эффекту, выражающемуся в полном восстановлении подвижности больного и исчезновении внутриспинальной опухоли по данным МРТ позвоночника, выполненной спустя 24 дня после 3 введений цитозара по 50 мг каждое.

Таким образом, проведенные исследования показали высокую клиническую значимость фармакодинамического моделирования цитозара in vitro в культуре миеломных клеток, позволивших предложить новый эффективный метод лечения опухолевых миелорадикулопатий, осложняющих течение ММ (патент № 2 213 563 от 10.10.2003 г.).

Основываясь на результатах фармакодинамического моделирования сарколизина in vitro в культуре миеломных клеток, был проведен клинический анализ его противоопухолевой активности. Препарат применяли в режиме монотерапии, используя принцип дозового преимущества, у 10 резистентных к программам М-2 и ЦСВП больных. Данный принцип основан на том, что при тестировании in vitro программ М-2 и ЦСВП, только сарколизин и алкеран обладали противоопухолевой активностью в 100% случаев. Остальные компоненты комбинаций (винкристин, белустин, преднизолон) были активны в 60 и 70% случаев соответственно. Это означает, что данные эмпирически созданные комбинации, без тестирования in vitro их противоопухолевых характеристик, обладают сомнительным усилением интегральной противоопухолевой активности.

Сарколизин был взят для клинического исследования в связи с тем, что его «удельная» противоопухолевая активность in vitro, отнесенная к концентрации, выше, чем алкерана. В среднем проведено 6 курсов монотерапии сарколизином, средняя курсовая доза которого составила 70 мг, что на 43% превышает суммарную дозу аналога сарколизина алкерана в индукционных ПХТ схемах.

В результате лечения у 60% рефрактерных больных ММ был получен ответ. Концентрация Pig в сыворотке снизилась с 5,3 ±0,6 до 3,4 ±0,4 г/% (Р<0,05), СОЭ уменьшилась с 65,1 ±2,9 до 37,7± 9,5 мм/ч (Р<0,05). Двигательная активность по шкале Карновского увеличилась с 70,0 до 90,0.

Токсичность детерминированной по чувствительности in vitro терапии сарколизином по принципу дозового преимущества не отличалась от таковой при лечении ПХТ программами.

Оценивая клинический результат в соответствии с критериями эффективности SWOG, разработанными в 1972 г., полный ответ был получен у 1-го больного (редукция Pig на 75%), частичныйу 2-х (редукция Pig на 53%), объективный ответу 3-х (редукция на 32%), отсутствие ответа — у 4 пациентов (редукция Pig на 6%). Длительность ответа сохранялась 11 месяцев (от 1 до 30 мес.) на фоне проведения поддерживающего лечения.

Сравнивая клинический результат с данными фармакодинамического моделирования in vitro, можно говорить о совпадении полученных значений. Сарколизин вызывает лизис опухолевых плазмоцитов in vitro по IC70 у всех больных (100%). Редукция маркера MM Pig от 32 до 75% после лечения сарколизином была достигнута у 6 больных (60%). При этом следует учитывать, что реальный лизис опухолевых клеток несколько больше, чем редукция Pig в сыворотке, которая запаздывает в соответствии со временем его полураспада.

Важным этапом нашей работы было изучение противоопухолевой активности бисфосфонатов (бонефос, зомета) при ММ на основании фармакодинамического моделирования in vitro, а также их влияния на выживаемость больных.

Интерес к проблеме бисфосфонатов обусловлен тем, что они включены в стандарты современного лечения ММ, что связано с их остеотропным действием, усиливающим репаративные процессы в костной системе. В то же время длительный прием этих препаратов может оказывать влияние на опухолевые клетки, о чем свидетельствуют данные литературы.

Анализируя результаты противоопухолевых фармакодинамических моделей бонефоса в культурах миеломных клеток in vitro больных ММ, следует отметить, что его противоопухолевая эффективность проявляется на высоких концентрациях (1С50 достигнута на концентрации 1000 р. М). Нарастание эффекта зависело от дозы препарата, но не от времени инкубации (24 или 72 часа). В тоже время анализ фармакокинетики бонефоса показал, что его концентрации в сыворотке больного при приеме терапевтических доз значительно меньше, чем in vitro при достижении противоопухолевого эффекта. Следовательно длительный прием бонефоса больными ММ не будет сопровождаться противоопухолевым эффектом.

При изучении противоопухолевой фармакодинамики зометы in vitro было получено достоверное повышение процента апоптотических клеток на максимальной концентрации препарата (60 рМ), однако значения 1С50 достигнуто не было. При сравнительном анализе данных фармакокинетики в клинике и фармакодинамики in vitro установлена их клиническая эквивалентность. Это означает, что остаточные концентрации зометы, сохраняющиеся в интервале между введениями, обладают противоопухолевым эффектом.

Таким образом, проведенные исследования чувствительности миеломных клеток к цитостатическим препаратам и бисфосфонатам in vitro, позволили получить важные для клинической практики результаты.

Скрининговое фармакодинамическое моделирование in vitro к 12 цитостатическим препаратам послужило основанием для дальнейшего клинического исследования двух препаратов: сарколизина (алкерана) и цитозара. Подробное фармакодинамическое исследование цитозара установило противоопухолевую активность малых концентраций, что послужило поводом для его использования при внутриспинальном опухолевом росте, осложняющим течение ММ. Интратекальные введения цитозара при этом сопровождались уменьшением объема внутриспинальной опухоли и позитивным клиническим результатом.

Высокая противоопухолевая эффективность in vitro сарколизина подтвердилась в клинике при лечении 10 больных ММ, резистентных к ранее проводимой ПХТ с использованием алкерана. Это позволило говорить о детерминированном по чувствительности in vitro лечении резистентной ММ по принципу дозового преимущества.

Установлена противоопухолевая активность in vitro бисфосфонатов с наличием клинической эквивалентности концентраций у зометы и отсутствием таковой у бонефоса.