Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans

Биосенсоры — аналитические приборы нового поколения, совмещающие в себе идеи и достижения современной биотехнологии, физико-химических методов анализа, электронных технологий. Большинство коммерческих биосенсоров основаны на электрохимическом типе детекции и содержат ферменты в качестве биорецепторного элемента.

Значительный прогресс в создании амперометрических биосенсоров стал возможен благодаря использованию в них соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод — медиаторов электронного транспорта.

Медиаторы способны взаимодействовать не только с выделенными ферментами, но и с ферментами в составе бактерий. Использование целых клеток вместо ферментов в биорецепторных элементах имеет ряд преимуществ: микроорганизмы дешевле очищенных ферментовбиосенсоры на основе целых клеток (в частности, бактерий) обладают каталитической активностью по отношению ко многим субстратам, что является преимуществом при определении суммарного содержания органических соединений (определения БПК сточных вод или суммарного содержания углеводов и спиртов в ферментационных средах) — биосенсоры на основе целых клеток во многих случаях характеризуются повышенным сроком эксплуатации.

Известно, что поверхностная локализация ферментов в мембранах бактериальных клеток облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. Для детекции легкоутилизируемых углеводов и спиртов перспективными могут стать медиаторные биосенсоры на основе бактерий Glu-conobacter oxydans, содержащих мембранлокализованные ферменты.

Электрокаталитическое окисление субстратов бактериями в присутствии медиаторов электронного транспорта мало изучено. Представляется актуальным исследование кинетических особенностей электрокаталитического окисления легкоутилизируемых субстратов бактериями Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов электронного переноса для разработки принципов создания микробных медиаторных биосенсоров.

Цель работы. Выявление кинетических закономерностей функционирования амперометрических медиаторных биосенсорных систем на основе бактерий Gluconobacter oxydans и применение этих закономерностей для разработки макета биосенсора.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Исследование возможности применения соединений различного строения, обладающих обратимыми окислительно-восстановительными свойствами, в качестве медиаторов в биосенсорах на основе целых клеток микроорганизмов G. oxydans.

2. Определение лимитирующей стадии процессов, протекающих в микробных медиаторных электродах.

3. Сравнение эффективности медиаторов электронного транспорта в биосенсорных системах на основе иммобилизованных бактерий G. oxydans.

4. Создание лабораторного макета амперометрического медиаторного биосенсора на основе бактерий G. oxydans. Определение рабочих параметров функционирования (рН, концентрация солей, концентрация медиатора, масса клеток на электроде) микробных биосеснсоров на основе G. oxydans и различных медиаторов переноса электронов.

5. Применение разработанного макета биосенсора для экспресс-определения БПК.

Научная новизна. Получены новые данные о возможности переноса заряда в системах «иммобилизованные бактерии G. oxydans — ферроцены и хиноны». Впервые показана возможность электрокаталитического окисления глюкозы целыми клетками G. oxydans на электродах, модифицированных ацетилферроценом, ферроценкарбальдегидом, 2,5-дибром-1,4-бензохиноном, 2-метил-1,4-бензохиноном. Предложено использовать такие системы как основу для создания безреагентных микробных биосенсоров.

Моделирование процессов, протекающих в рецепторном элементе микробного медиаторного биосенсора, позволило идентифицировать скоростьопределяющую стадию биоэлектрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными на поверхности графитовых электродов бактериями G. oxydans при участии медиаторов электронного транспорта. На основе анализа процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах, в рамках механизма «пинг-понг» получены ряды эффективности медиаторов переноса электронов.

Выявлен эффект изменения субстратной специфичности бактерий G. oxydans при электрокаталитическом окислении углеводов и спиртов в присутствии искусственных (медиаторов) и естественного (кислорода) акцепторов электронов, который имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Результаты создают основы формирующегося в настоящее время нового направления медиаторных клеточных электродов и открывают новые перспективы для создания микробных биосенсоров.

Практическая значимость работы. Выявленные в работе закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Glu-conobacter oxydans могут быть использованы при разработке биосенсоров на основе других микроорганизмов для детекции различных соединений.

Разработан действующий макет безреагентного амперометрического микробного медиаторного биосенсора для определения БПК, который может служить прототипом опытного образца прибора для серийного освоения.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — Наука XXI века» (г. Пущино Московской области) в 2002;2006 гг.- VIII Международном конгрессе по биосенсорам, 24 — 26 мая 2004 г. (г. Гранада, Испания) — Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (г. Москва) 12−15 апреля 2005 г., Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006», 25−30 июня 2006 (г. Москва), IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», 11−16 сентября 2006 г. (г.

Томск). Исследование поддержано грантом РФФИ «Закономерности функционирования ферментных систем бактериальных клеток в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов» (№ 01−04−96 023). По теме диссертации опубликовано 6 статей и 10 сообщений в тезисной форме.

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что 2-метил- 1,4-бензохинон, 2,5-дибром-1,4-бензохинон, ацетилферроцен, ферроценкарбальдегид могут служить медиаторами переноса электронов при электрокаталитическом окислении глюкозы иммобилизованными бактериями G. oxydans.

2. Впервые выявлено влияние природы заместителей на медиаторные свойства хинонов и ферроценов. Показано, что введение акцепторных заместителей может ухудшить медиаторные свойства производных ферроцена и 1,4-бензохинона.

3. Проведена оценка лимитирующих стадий процессов, протекающих на микробных медиаторных электродах. Установлено, что при концентрациях глюкозы выше 2 ммоль/л протекающие в микробных биосенсорах процессы лимитирует ферментативная реакция, при концентрациях глюкозы ниже 2 ммоль/л кинетический контроль функционирования биосенсора сменяется на диффузионный.

4. На основе анализа в рамках механизма «пинг-понг» процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах в режиме кинетического контроля, получены ряды эффективности медиаторов переноса электронов: гексацианоферрат (III) калия<2,6-дихлорфенолиндофенол<�и-бензохинон (для водорастворимых медиаторов) — 2-метил-1,4-бензохинон<1,1 '-диметилферроцен<�фер-роцен<2,5-дибром-1,4-бензохинон (для иммобилизованных медиаторов).

5. Найдены оптимальные параметры функционирования микробных био-сеснсоров на основе G oxydans и различных медиаторов электронного транспорта (рН среды измерения, концентрация солей буферного раствора, концентрация медиатора, масса бактерий на электроде). Полученные данные использованы для создании макета медиаторного биосенсора для экспресс-определения БПК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Анализ литературных данных показывает, что использование в биосенсорах целых клеток в сочетании с медиаторами переноса электронов открывает широкие перспективы для детекции различных веществ. Вместе с тем исследования в данной области носят в основном прикладной характер, а протекающие в микробных медиаторных биосенсорах процессы изучены недостаточно.

Бактерии рода Gluconobacter, благодаря мембранной локализации основных ферментов катаболизма спиртов и углеводов — альдози алкогольде-гидрогеназ, а также другим физиолого-биохимическим особенностям, являются удобным объектом для изучения закономерностей биоэлектрокаталити-ческого окисления субстратов в присутствии медиаторов переноса электронов в биосеснсорах.

В связи с изложенным выше, представлялось целесообразным проведение исследований, направленных на выявление кинетических закономерностей функционирования амперометрических медиаторных биосенсорных систем на основе бактерий Gluconobacter oxydans и применение выявленных закономерностей для разработки макета биосенсора. Для этого были предприняты следующие шаги:

1. На первом этапе методом циклической вольтамперометрии была изучена возможность использования некоторых малорастворимых в водных средах ферроценов и хинонов (ферроцен, 1,1'-диметилферроцен, ацетилферроцен, ферроценкарбальдегид, 2,5-дибром-1,4-бензохинон, 2-метил-1,4-бензохинон, 1,2-нафтохинон) в качестве медиаторов переноса электронов в биосенсорах на основе бактерий Gluconobacter oxydans. Выбор данных веществ в качестве потенциальных медиаторов был продиктован необходимостью создания безреагентных биосенсорных систем, т.к. описанные ранее в системах с бактериями Gluconobacter oxydans медиаторы (2,6-дихлорфенолиндофенол, пбензохинон, гексацианоферрат (III) калия) хорошо растворимы в воде и применяются в биосенсорных системах в составе рабочих растворов. Применение вольтамперометрического метода позволило получить новые данные о возможности переноса заряда в системах с бактериями Gluconobacter oxydans в присутствии ферроцена, 1,1'-диметилферроцена, ацетилферроцена, ферроцен-карбальдегида, 2,5-дибром-1,4-бензохинона, 2-метил-1,4-бензохинона. Из полученных вольтамперных зависимостей были определены окислительно-восстановительные потенциалы исследовавшихся медиаторов. Для дальнейшей работы были отобраны четыре медиатора с низкими значениями потенциалов: ферроцен, 1,1'-диметилферроцен, 2,5-дибром-1,4-бензохинон, 2-метил-1,4-бензохинон.

2. На втором этапе было проведено определение лимитирующей стадии процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах при биоэлектрокаталитическом окислении глюкозы в присутствии описанных ранее в системах с бактериями Gluconobacter oxydans и отобранных на предыдущем этапе работы медиаторов переноса электронов. Для обработки экспериментальных данных был применен алгоритм для выявления лимитирующей стадии, который позволяет путем математической обработки зависимости генерируемого биосенсором тока от концентрации субстрата определить вклад ферментативных и диффузионных процессов в значение эффективной константы скорости. Данный подход позволил выявить диапазон концентраций глюкозы (более 2 ммоль/л), в котором исследуемые биосенсоры функционируют в режиме кинетического контроля. При концентрациях глюкозы ниже 2 ммоль/л кинетический контроль сменялся на диффузионый.

3. Выявление на предыдущем этапе диапазона концентраций глюкозы, соответствующих кинетическому контролю, позволило перейти к более детальному изучению взаимодействия бактерий с медиаторами переноса электронов. Для этого взаимодействие в системе «бактерии Gluconobacter oxydans — глюкоза — медиатор» рассматривали как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг», что позволило охарактеризовать процесс электрокаталитического окисления глюкозы в присутствии медиаторов переноса электронов с помощью трех параметров: максимального тока электрокаталитического окисления и констант Михаэлиса по субстрату и медиатору. На основе отношения величин максимального тока к константам Михаэлиса по медиатору были построены ряды эффективности медиаторов переноса электронов.

4. Следующий этап заключался в создании лабораторного макета биосенсорной установки и определении рабочих параметров, таких как рН среды измерения, концентрация солей буферного раствора, концентрация медиатора, масса бактерий на электроде, операционная и долговременная стабильность микробных медиаторных биосенсоров.

5. На пятом этапе была исследована селективность микробных биосенсоров, для этого сравнили величины ответов сенсоров на различные углеводы и спирты. Установлено, что природа медиатора переноса электронов оказывает влияние на селективность микробных биосенсоров. По результатам проведенных экспериментов был сделан вывод, что медиаторные биосенсоры на основе бактерий Gluconobacter oxydans благодаря своей биохимической активности по отношению к целому ряду углеводов и спиртов могут быть использованы для определения суммарного содержания этих веществ в анализируемых образцах или для анализа сред, содержащих только одно из определяемых веществ.

6. Завершающий этап исследования состоял в создании лабораторной модели медиаторного биосенсора на основе бактерий Gluconobacter oxydans для экспресс-определения комплексного показателя загрязнения сточных вод — биологического потребления кислорода. В качестве медиатора был выбран ферроцен — один из эффективных медиаторов, обеспечивающих наибольшую долговременную стабильность биосенсора. По результатам эксперимента сделали вывод, что разработанный медиаторный микробный биосенсор можно применять для определения БПК в интервале 40 — 550 мг/л.

Полученные в ходе выполнения работы результаты показали, что выявленные кинетические закономерности в сочетании с определением рабочих параметров и селективности микробных биосенсоров открывают реальную перспективу создания биосенсорных анализаторов, в частности для определения БПК.