Разработка методов получения биологически активных соединений для диагностики системы гемостаза

Исследование системы гемостаза имеет большое, решающее значение для диагностики различных видов кровоточивости, тромбоэмболических синдромов, гематогенных тромбофилий и процессов диссеминированного внутри-сосудистого свертывания крови, в том числе развивающихся при критических и терминальных состояниях (1, 2, 4, 5, 8, 10, 20). Постоянный лабораторный контроль коагулологической системы крови необходим также при проведении антитромботической терапии в процессе лечения сердечно-сосудистых заболеваний, ишемий и инфарктов различных органов, большого числа акушерских осложнений и болезней новорожденных (7, 9, 11, 12, 13, 25).

Основу современного исследования гемостаза составляют четыре базовых теста, без выполнения которых определение коагулологического статуса пациента не может считаться полным и достоверным (14, 19). Этими тестами являются протромбиновое время, активированное частичное тромбопластино-вое время, тромбиновое время и определение концентрации фибриногена. Они моделируют in vitro три основные механизма коагуляционного каскада, а именно, внешний, внутренний и общий пути свертывания (3, 14, 19). Для проведения этих тестов, в отличие от подавляющего большинства обычных биохимических исследований, выполняемых при помощи простых химических соединений, необходимы сложные биологически активные субстанции, фактически представляющие собой вещества либо сами участвующие в процессе коагуляции in vivo, либо являющиеся их близкими аналогами. Это обстоятельство оказывает большое влияние как на технику проведения самих коагулоло-гических исследований, так и на требования, предъявляемые к этим веществам по чувствительности, воспроизводимости и стабильности результатов, получаемых с их помощью (18). В связи с этим повышается роль современных унифицированных методик диагностики свертывающей системы крови.

До настоящего времени в нашей стране практически отсутствовало производство современных реагентов для выполнения стандартизованных коагу-лологических тестов. Большинство лабораторий, занимающихся исследованиями гемостаза, готовило реагенты для этих целей самостоятельно, что, естественно, приводило к получению несопоставимых результатов. Кроме того, часто отсутствие реагентов было причиной не полного обследования пациентов. В связи с этим внедрение в практику здравоохранения современных методов диагностики свертывающей системы крови представляется весьма актуальным.

Цель работы: разработать методы получения и исследовать свойства биологически активных соединений (тромбопластина, АЧТВ-реагента и тромбина), для стандартизации выполнения четырех базовых коагуляционных тестов: протромбинового времени, активированного частичного тромбопластино-вого времени, тромбинового времени и определения фибриногена по методу Клаусса.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние условий экстракции на свойства получаемого тромбопластина и на основании этого разработать метод выделения реагента, чувствительного к VII фактору свертывания. Изучить свойства полученного тромбопластина и доказать возможность его применения для определения протромбинового времени.

2. Изучить влияние способов активации АЧТВ-реагентов на их чувствительность и активность для получения реагента с заранее заданными свойствами. Разработать метод получения АЧТВ-реагентов на основе различных активаторов (каолина и эллаговой кислоты) и фосфолипидов (мозговых, соевых и эритроцитарных) и исследовать их чувствительность к дефициту факторов внутреннего пути свертывания и присутствию антикоагулянтов (гепарина).

3. Разработать метод получения стабильного высокоактивного препарата тромбина. Исследовать свойства полученного тромбина и доказать возможность его применения для определения тромбинового времени и концентрации фибриногена по методу Клаусса.

Научная новизна.

Разработан оригинальный метод получения чувствительного к VII фактору свертывания тромбопластина, аттестованного согласно требованиям Международного Комитета по Тромбозам и Гемостазу по системе MHO и пригодного для мониторинга антикоагулянтой терапии. Исследована зависимость свойств тромбопластина от условий его получения.

Впервые разработан метод получения эритроцитарных фосфолипидовосновы реагента для определения АЧТВ (Патент СССР № 1 790 604 A3.-1993). Показана возможность применения разработанного метода для выделения фосфолипидов из мозга кролика и бобов сои. Разработана панель из десяти АЧТВ-реагентов на основе активатора эллаговой кислоты и показано, что в зависимости от состава реагентов их чувствительность к факторам внутреннего пути свертывания и присутствию антикоагулянтов может изменяться в широких пределах.

Разработан оригинальный метод получения стабильного высокоактивного препарата тромбина и показана возможность его применения для определения тромбинового времени и концентрации фибриногена по методу Клаусса.

Теоретическое и практическое значение работы.

Проведенные исследования позволили разработать методы получения тромбопластина, АЧТВ-реагента и тромбина, с заранее заданными свойствами, сравнимыми со свойствами современных зарубежных аналогов.

Полученные в работе данные позволили организовать в Гематологическом Научном Центре РАМН производство современных наборов реагентов для диагностики гемостаза и внедрить их в практику здравоохранения.

Комиссией по реактивам Комитета по новой технике МЗ РФ утверждены.

Технические Условия и разрешен выпуск и применение следующих наборов:

1. Набор для определения протромбинового времени «Диагем-П» ТУ 9 398 254−5 595 541−97.

2. Набор для определения АЧТВ «Коагуло-тест» ТУ 9398−237−5 595 541−96.

3. Набор для определения активности VIII фактора свертывания крови «Фактор VIII-тест» ТУ 9398−233−55 955 541−99.

4. Набор для определения активности IX фактора свертывания «Фактор IX-тест» ТУ 9398−234−55 955 541−99.

5. Набор для определения тромбинового времени «Тромбин-тест» ТУ 9 398 255−5 595 541−97.

6. Набор для определения концентрации фибриногена «Фибриноген-тест» ТУ 9398−264−5 595 541−97.

Положения, выносимые на защиту.

1. Чувствительность тромбопластина к факторам протромбинового комплекса зависит от концентрации поверхностно активных веществ в буфере, используемом для экстракции. При увеличении их концентрации чувствительность тромбопластина увеличивается, при этом одновременно снижается его активность.

2. Метод получения тромбопластина, основанный на экстракции дегидратированной ткани мозга кролика буфером, содержащим ионогенный детергент, и позволяющий получать тромбопластин-кальциевый реагент, обладающий высокой чувствительностью к дефициту фактора VII, и имеющий МИЧ не превышающий 1.1.

3. Метод получения тромбопластина, основанный на экстракции дегидратированной ткани мозга кролика буфером, содержащим неиногенный детергент и хаотропный агент, и позволяющий получать тромбопластин, обладающий средней чувствительностью к дефициту фактора VII, и имеющий МИЧ не превышающий 1.5.

4. Метод выделения фосфолипидов для проведения теста АЧТВ, основанный на экстракции тканей различного происхождения органическими растворителями, а также метод получения АЧТВ-реагентов на основе активатора эллаговой кислоты.

5. Чувствительность АЧТВ-реагентов к дефициту факторов внутреннего пути свертывания и к присутствию в плазме антикоагулянтов (гепарин сульфата) зависит от природы фосфолипидов, а также ионов двухвалентных переходных металлов, добавляемых для активации к раствору эллаговой кислоты.

6. Метод получения стабильного высокоактивного раствора тромбина, основанный на хроматографическом выделении протромбина, конверсии его в тромбин с помощью тромбопластина и очистки кальций-фосфатным осаждением примесей.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ в отечественных изданиях и получен один патент СССР.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех частей собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 152 источников, из них 25 отечественных и 127 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 34 рисунками.

Выводы.

1. Определено влияние условий получения тромбопластина на его активность и чувствительность в тесте протромбинового времени. Установлено, что существует прямая зависимость между Международным Индексом Чувствительности выделяемых препаратов и концентрацией различных детергентов, используемых для экстракции тромбопластина.

2. Разработано два метода получения кроличьего тромбопластина, имеющего как высокую так и среднюю чувствительность к факторам внешнего пути свертывания. Показана возможность их применения для контроля за различными патологиями, вызывающими изменение протромбинового времени.

3. Разработан метод выделения фосфолипидов из тканей различного происхождения: эритроцитарных стром, мозга кролика и бобов сои. Установлено, что эритроцитарные и смешанные фосфолипиды обладают свойствами, необходимыми для создания на их основе АЧТВ-реагента с каолином в качестве активатора (Патент СССР № 1 790 604 АЗ, 1993).

4. Разработан метод получения АЧТВ-реагентов на основе мозговых и соевых фосфолипидов и активатора эллаговой кислоты. Показано, что их чувствительность к дефициту факторов VIII и IX и к гепарину зависит как от природы фосфолипидов, так и от ионов двухвалентных переходных металлов, используемых для придания эллаговой кислоте свойств активатора внутреннего пути свертывания.

5. Разработан метод получения стабильного высокоактивного препарата тромбина из криосупернатанта человеческой плазмы. Для стабилизации раствора оригинально применен этиленгликоль, что позволило увеличить время хранения в жидком виде препарата тромбина до одного месяца без заметного снижения активности.

6. Показано, что тромбин обладает чувствительностью к содержанию фибриногена и продуктов его деградации в плазме. Кроме этого, установлено, что чувствительность тромбина к гепарину позволяет использовать его для контроля за гепаринотерапией.

7. Разработаны, прошли медицинские испытания, утверждены Министерством Здравоохранения РФ и разрешены к производству наборы реактивов для определения: протромбинового времени «Диагем-П» (ТУ 9398−254−5 595 541−97, Регистрационное Удостоверение № 29/25 081 296/0345−00 от 23.05.2000 г.). активированного частичного тромбопластинового времени «Коагуло-тест» (ТУ 9398−237−5 595 541−96, Регистрационное Удостоверение № 29/25 020 396/0362−00 от 23.05.2000 г.). активности факторов VIII и IX (ТУ 9398−233−55 955 541−99 и ТУ 9398−234 055 955 541−99, Регистрационные Удостоверения № 292/1099/99−2-½ и № 292/1099/99−2-1/1) тромбинового времени «Тромбин-тест» (ТУ 9398−234−55 955 541−99, Регистрационное Удостоверение № 29/25 010 197/0344−00 от 23.05.2000 г.). концентрации фибриногена в плазме «Фибриноген-тест» (ТУ 9398−26 405 595 541−97, Регистрационное Удостоверение № 292/0999/97−2-3 от 23.05.2000 г.).

Организовано и успешно функционирует производство этих наборов, что позволило внедрить их в широкую практику здравоохранения.

Заключение

.

Настоящее исследование посвящено разработке методов выделения и изучению свойств биологически активных соединений (тромбопластина, АЧТВ-реагента и тромбина), необходимых для диагностики четырех базовых коагуляционных тестов: протромбинового времени, активированного частичного тромбопластинового времени, тромбинового времени и определения фибриногена по методу Клаусса. Эти тесты должны быть основой любого первичного коагулологического обследования пациента, поскольку моделируют in vitro процессы, происходящие in vivo на всех стадиях коагуляционного каскада.

В настоящее время большое значение уделяется свойствам тромбопластина и его стандартизации с целью повышения точности определения протромбинового времени — простого и наиболее широко применяемого метода оценки действия пероральных антикоагулянтов. В связи с этим было изучено влияние условий получения тромбопластина на его активность и чувствительность к факторам внешнего пути свертывания. Установлено, что существует зависимость между концентрацией различных детергентов и хелатирующих агентов, используемых для экстракции тромбопластина, и чувствительностью выделяемых препаратов к факторам протромбинового комплекса, а также Международным Индексом Чувствительности, что позволяет получать тромбо-пластин с заранее заданными свойствами. Чувствительность тромбопластина повышается с повышением концентрации в экстрагирующем буфере неино-генного детергента, что соответствует данным литературы (29), одновременно уменьшается его активность. В то же время необходимо отметить, что в отличие от данных, опубликованных Jering Н. et al в 1984 г. (71) та же зависимость наблюдалась при использовании для экстракции ионогенного детергента. Кроме того, не подтверждаются данные (63) о повышении чувствительности тромбопластина при увеличении температуры экстракции. В нашем исследовании это приводило к заметной потере активности препаратов тромбопластина, причем их чувствительность практически не изменялась.

Проведенные исследования позволили разработать методы получения кроличьего тромбопластина, имеющего высокую и среднюю чувствительность к факторам внешнего пути свертывания. Тромбопластин со средней чувствительностью был получен экстракцией АПМК буфером, содержащим 0.1% не-иногенного детергента тритона Х-100 и 0.05М хаотропного агента — изотио-цианата натрия. Чувствительность этого препарата к VII фактору свертывания, рассчитанная как отношение протромбинового времени субстрат дефицитной и нормальной плазмы, составляла 3.0+0.1. Более чувствительные препараты были получены при экстракции буфером, содержащим 0.2% ионогенного детергента. Этот тромбопластин содержал, кроме того, 0.125М ионов кальция, что делает его полностью готовым для использования в тесте протромбинового времени. Чувствительность такого препарата к VII фактору свертывания составляла величину 3.7+0.1. Следует отметить, что в отличие от методов, описанных в работах (63, 71), нами были применены более высокие концентрации детергентов для достижения необходимого результата.

Лечение и профилактика расстройств, сопровождающихся тромбообра-зованием с использованием пероральных антикоагулянтов типа кумарина (варфарина) широко распространено в медицинской практике. Дозу этих лекарственных препаратов для каждого больного следует периодически контролировать, для того чтобы обеспечить адекватный, но не избыточный уровень антикоагуляции. Такая коррекция проводится на основании результатов теста на протромбиновое время (140, 146). Это возможно лишь при правильной калибровке препаратов тромбопластина. В связи с этим ВОЗ ввел понятие Международного Индекса Чувствительности (МИЧ), позволяющего сопоставлять активности различных тромбопластинов (26, 87, 140).

В соответствии с рекомендациями ВОЗ, препараты тромбопластина, полученные по разработанной нами технологии, были аттестованы по МИЧ. Величина МИЧ для тромбопластина со средней чувствительностью составила 1.50±0.05, а для более чувствительного препарата ТКС — 1.07±0.03. По данным литературы (113, 140) для мониторинга антикоагулянтной терапии предпочтительнее использовать препараты тромбопластина с МИЧ<1.2. Таким образом, разработанная нами технология, позволяет получать тромбопластин, пригодный для этих целей.

Следует отметить, что препарат тромбопластина с МИЧ 1.5 имеет чувствительность к дефициту фактора VII, сравнимую с чувствительностью зарубежных аналогов, и может быть с успехом использован для контроля за различными патологиями, вызывающими изменение ПВ, например при заболеваниях печени.

Одним из наиболее распространенных в настоящее время скрининговых коагуляционных тестов является тест активированного частичного тромбопла-стинового времени, моделирующий in vitro внутренний механизм свертывания крови. Этот тест широко применяется для контроля факторов контактной активации, а также для мониторинга лечения гепарином. Кроме того, Международный Комитет по Тромбозам и Гемостазу и Международный Комитет по Стандартизации в Гематологии рекомендовали АЧТВ-тест в качестве надежного метода определения уровней факторов VIII и IX как у пациентов, страдающих различными формами гемофилии, так и в лечебных препаратах, содержащих концентраты соответствующих факторов свертывания. Такая многоплановость использования теста АЧТВ в значительной мере затрудняет его стандартизацию. В настоящее время за рубежом нашел распространение целый спектр АЧТВ-реагентов, имеющий различное предназначение. К сожалению, в нашей стране до сих пор такие реагенты не производились, поэтому разработка метода получения реагентов для выполнения АЧТВ-теста представляется весьма актуальной.

Действующим началом любого АЧТВ-реагента являются фосфолипиды — заменитель тромбоцитарного фактора 3 и контактный активатор, запускающий внутренний механизм гемостаза. В настоящем исследовании нами был разработан метод выделения фосфолипидов, позволяющий экстрагировать их из различных тканей: эритроцитарных оболочек (21), мозга кролика и бобов сои, что дало возможность получать фосфолипиды с более низким индексом окисленности, чем при обычно применяемой технологии (30). В качестве контактных активаторов нами были исследованы эллаговая кислота и каолин. Известно, что раствор эллаговой кислоты сам по себе не вызывает активации фактора Хагемана (36, 121), это свойство она приобретает при добавлении ионов двухвалентных переходных металлов. Для активации эллаговой кислоты нами были применены ионы меди, цинка, никеля, марганца и кобальта. Разработанный нами метод позволил получить панель из десяти АЧТВ-реагентов на основе фосфолипидов мозга кролика и сои, с эллаговой кислотой, активированной ионами перечисленных металлов.

Проведенные исследования показали, что значения АЧТВ всех этих реагентов лежат в пределах от 25 до 36 секунд, что хорошо коррелирует с данными, полученными для аналогичных препаратов (79). Следует, однако, отметить, что определение величины АЧТВ отнюдь не достаточно для полной характеристики реагентов, применяемых для контроля внутреннего пути свертывания. Значительно большую информацию можно получить при определении их чувствительности к дефициту факторов VIII и IX, а также к гепарину. Исследования, проведенные нами, показали, что чувствительность АЧТВ-реагентов с активатором эллаговой кислотой сильно зависит от природы фосфолипидов. Реагенты, содержащие соевые фосфолипиды, обладали в целом большей чувствительностью к дефициту VIII и IX факторов и к присутствию гепарина, чем реагенты на основе фосфолипидов мозга. Это также находит подтверждение в данных литературы (35, 42, 137).

Гораздо большую вариабельность в значения чувствительности АЧТВ-реагентов к факторам свертывания вносит природа металлов, ионы которых были использованы для активации эллаговой кислоты. Реагенты, содержащие ионы марганца, кобальта и никеля обладали схожей чувствительностью, содержащие ионы меди были менее, а ионы цинка гораздо более чувствительны. Следует отметить, что чувствительность этих реагентов различалась более чем в 3 раза. В литературе мы не нашли подтверждения этим данным. Изучение чувствительности АЧТВ-реагентов к гепарину показало, что этот параметр сильно варьирует для нефракционированного гепарина, в то время как для низкомолекулярного (фраксипарина) практически не зависит от природы металла. Нам удалось получить реагенты как практически нечувствительные к присутствию в плазме гепарина (с ионами цинка), так и обладающие повышенной чувствительностью к нему (с ионами меди).

Проанализировав полученные результаты, мы пришли к выводу, что по своим свойствам в наибольшей степени приближается к зарубежным аналогам АЧТВ-реагент, приготовленный на основе соевых фосфолипидов и содержащий ионы марганца в качестве активатора эллаговой кислоты. Использование этого реагента для определения АЧТВ, уровней факторов VIII и IX, для мониторинга гепаринотерапии дает результаты, сравнимые с результатами, полученными при использовании реагента Actin FS фирмы Dade Behring, США. Следует отметить, что реагенты с эллаговой кислотой, полученные по разработанной нами технологии, представляют собой слабо опалесцирующие и практически неседиментрующие эмульсии, что делает их удобными для работы на всех типах коагулометров, включая оптические. В настоящее время в России наиболее популярным активаторов для проведения теста АЧТВ является каолин. Несмотря на ряд недостатков, присущих ему, и в частности, необходимость постоянно перемешивать АЧТВ-реагент на его основе перед проведением определения, он имеет и ряд несомненных преимуществ. Так проведение исследований АЧТВ в ручном режиме значительно легче, поскольку присутствие каолина делает образующийся сгусток более контрастным и удобным для визуальной регистрации. Поскольку в нашей стране до сих пор большинство коагулологических исследований проводится без применения коагулометров, разработка методов получения реагентов для определения АЧТВ на основе каолина является актуальной задачей.

Наши исследования показали, что и в этом случае природа фосфолипи-дов также оказывает значительное влияние на свойства реагента. Однако, АЧТВ-реагенты, приготовленные на основе эритроцитарных фосфолипидов, а также смешанных фосфолипидов мозга и сои, имели близкие чувствительности к дефициту VIII и IX факторов свертывания и присутствию гепарина. Активность этих препаратов в тесте АЧТВ, определенная на плазмах 100 здоровых доноров, составила 37.1 ± 4.7 сек и 39.2 ± 4.8 сек (М±2ст, N=100) для смешанных и эритроцитарных фосфолипидов соответственно. Эти значения близки величинам, общепринятым для теста АЧТВ во всем мире. Кроме того, они были подобны препаратам, описанным в исследованиях (79, 42). Следует, однако, отметить, что поскольку тест АЧТВ до сих пор не является до конца стандартизованным, нормы АЧТВ каждая лаборатория, ведущая коагулологи-ческие исследования, должна устанавливать самостоятельно, ориентируясь при этом на поверенные контрольные препараты (14).

Тромбин является одним из важнейших реагентов для диагностики гемостаза. С его помощью определяют патологию не только конечного этапа свертывания крови, но и уровни гепарина и антитромбина III в плазме. В связи с этим получение активного, стабильного препарата тромбина является актуальной задачей.

В настоящем исследовании нами был разработан метод получения тромбина, основанный на хроматографическом выделении из криосупернатанта на-тивной плазмы фракции, содержащей протромбин, и последующей конверсии протромбина в тромбин в присутствии тромбопластина и ионов кальция. Установлено, что в этих условиях конверсия протекает быстро, в течение не более 30 минут, что согласуется с данными, опубликованными Baughman D.J. (33). Для очистки тромбина нами был применен оригинальный метод кальций фосфатного осаждения примесей, что дало возможность получить препарат с.

90 удельной активностью 87+14 Ш/мг при общем выходе.

75±-6×10 Ш/л криосупернатанта. Кроме того, нами впервые для стабилизации тромбина в жидком виде был применен этиленгликоль. Добавление 20%-ов стабилизатора к раствору белка позволяло хранить его при температуре 4 °C в течение месяца без заметной потери активности.

Исследование свойств полученного тромбина, показало, что этот препарат чувствителен к понижению содержания фибриногена в плазме, повышению уровня продуктов деградации фибрина и наличию антикоагулянта (гепарина). Другими словами полученный нами препарат тромбина может быть использован в тесте тромбинового иремени.

Определение концентрации фибриногена по методу Клаусса является в настоящее время наиболее распространенным в мире. Основное преимущество этого метода заключается в том, что им определяется только функционально активный полноценный фибриноген, участвующий в процессе свертывания. Проведение этого теста возможно только при наличии тромбина с активностью не менее 80 Ш/мл (14, 19). Сравнительные исследования показали, что зависимости времени свертывания от концентрации фибриногена, полученные с различными препаратами тромбина, имеют схожий характер. Они линейны в одном диапазоне концентраций фибриногена и параллельны между собой. Все это свидетельствует о возможности применения полученного нами тромбина для определения концентрации фибриногена по Клауссу.