Изучение безопасности, реактогенности и антигенной активности рекомбинантной бивакцины против оспы и гепатита В орального применения

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Титрование вируса на ХАО РКЭ. Титрование ВВ на ХАО РКЭ проводили по ранее описанной методике. При этом подготовку РКЭ проводили в темной комнате. Каждый эмбрион просматривали в луче света от местного источника освещения, например, осветителя микроскопа. Свет должен падать на тупой конец яйца. Браковали РКЭ с погибшим эмбрионом или с кровоизлияниями под оболочкой. В центре воздушного мешка… Читать ещё >

Изучение безопасности, реактогенности и антигенной активности рекомбинантной бивакцины против оспы и гепатита В орального применения (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

Обозначения и сокращения
1. Обзор литературы
- 1. 1. Краткая характеристика вируса натуральной оспы и вируса вакцины
- 1. 2. Современное состояние вакцинопрофилактики против натуральной ос- 16 пы
- 1. 3. Иммунная реакция на вакцинацию против оспы
- 1. 4. Гепатит В — опасное вирусное заболевание
- 1. 5. Вакцинопрофилактика гепатита В
- 1. 6. Живые рекомбинантные вакцины против гепатита В

Актуальность исследования. Прошло уже более четверти века с тех пор, как была успешно завершена программа глобальной ликвидации оспы путем иммунизации большей части населения Земли против данного заболевания. В результате сегодня в мире сложилась опасная ситуация, связанная с тем, что более половины населения Земли не имеет иммунитета против оспы. И с каждым годом количество иммунных людей будет уменьшаться. Подтверждением высокой степени незащищенности населения от ортопоксвирусов является самая масштабная за последние годы вспышка оспы обезьян среди людей, зарегистрированная в 1996;97 гг. в Демократической республике Конго [Hutin et al., 2001; Learned et al., 2005] и 71 случай заболевания в 6 штатах США в 2003 г. [Likos et al., 2005]. В различных странах Европы было зарегистрировано увеличение числа случаев заболеваний людей в результате заражения вирусом оспы коров [Lewis-Jones et al., 2004; Frey and Belshe, 2004].

Более того, существует угроза появления оспоподобного заболевания, о чем свидетельствуют многочисленные вспышки заболевания людей оспой обезьян (Заир, США), оспой буйволов (Индия) и оспой коров (Германия, Украина) [Ладный, 1985; Маренникова и Щелкунов, 1998; Lewis-Jones et al., 2004]. После событий сентября 2001 года ВНО рассматривается зарубежными экспертами в качестве одного из наиболее вероятных объектов применения в биотеррористических акциях [Онищенко и др., 2003; Мауг, 2003]. Реальность нависшей над миром угрозы биотерроризма несомненна и наглядно подтверждена применением спор сибирской язвы против населения США в октябре 2001 г. для террора и шантажа. В сложившихся условиях ортопоксвирусы (натуральная оспа и оспа животных) являются наиболее опасным биологическим агентом [Henderson et al., 1999аO'Toole, 1999; Онищенко и др., 2003; Мауг, 2003].

В этих условиях существующие накожные оспенные вакцины имеют столько ограничений для применения, что практически не могут широко использоваться в иммунопрофилактике, например, они смертельно опасны для людей с синдромом иммунодефицитного состояния и людей, страдающих кожными дерматитами [Lane and Goldstein, 2003]. При проведении добровольной иммунизации гражданского населения в 2002;2003 гг. в 43 штатах США зарегистрировано большое количество осложнений с частотой 1:713, включая два летальных случая [Mahoney et al., 2003].

Реактогенность и количество поствакцинальных осложнений живых вирусных вакцин (главный недостаток противооспенных вакцин) зависят от остаточной вирулентности используемых вирусных штаммов [Маренникова и Щелкунов, 1998; Медуницын, 2004]. В связи с этим разрабатываемые новые кандидатные вакцины можно разделить на 2 группы. Первая — вакцины, для приготовления которых используются такие проверенные штаммы как NYCBOH, реактогенность таких вакцин (АСАМ 1000 и АСАМ2000) не сильно отличается от реактогеиности вакцины Dryvax [Artenstein, 2005]. И вакцины, для приготовления которых используются высоко аттеиуированные штаммы, такие как MVA и др. [Slifka, 2005]. Вакцины на основе штамма MVA являются максимально безопасными, но при этом протективные свойства таких вакцин вызывают сомнения [Enserink, 2002]. Наиболее разумным выходом из этой ситуации является использование двукратной вакцинации — первая вакцинация производится вакциной, приготовленной на основе штамма MVA, и далее следует или повторная вакцинация такой же вакциной, или вакцинация обычной вакциной, такой как Dryvax [Belya-kov, 2003].

Другим способом увеличения безопасности противооспенных вакцин может быть применение мукозальной иммунизации при вакцинации против оспы. При этом формирующийся иммунитет, как по серологическим показателям, так и по продолжительности не уступает иммунитету, создаваемому после внутрикожной прививки [Воробьев и др., 2002]. Физиоло-гичность введения препарата, отсутствие травматизации кожи, безопасность как для вакцинируемых, так и для окружащих, высокая производительность при проведении массовой вакцинации — основные достоинства этого метода иммунизации [Воробьев и др., 1996аВоробьев и др., 2002].

Глобальная ликвидация оспы в 1980 году удивительным образом совпала с началом исследований по получению рекомбинантных штаммов ВВ [Moss, 1996а]. Особенностью ре-комбииантных штаммов ВВ является способность индуцировать in vivo выраженный иммунный ответ, особенно Т клеточный [Ramirez et al., 2000bGherardi and Esteban, 2005; Zavala et al., 2005]. Существенно усилить иммунный ответ на белок, кодируемый встроенным в геном ВВ чужеродным геном, позволяет использование прайм-бустерной стратегии иммунизации [Ramshaw and Ramsay, 2000; Gherardi and Esteban, 2005]. Причем показано, что во многих случаях оптимальной является мукозальная иммунизация рекомбинантным ВВ на стадии бустер-вакцинации [Ramshaw and Ramsay, 2000; Gherardi and Esteban, 2005]. При этом было обнаружено, что мукозальная иммунизация рекомбинантным ВВ позволяет преодолевать иммунитет, созданный предварительной парентеральной иммунизацией ВВ [Belyakov et al., 1999]. Этот эффект выражается в том, что у предварительно иммунизированных скарифика-ционным способом ВВ мышей, иммунный ответ на чужеродный белок, экспрессируемый в составе рекомбинантного ВВ, существенно выше при последующей мукозальной иммунизации рекомбинантным ВВ, чем парентеральной [Belyakov et al., 1999].

Возможность применения пероральной иммунизации для вакцинации против, НО и опыт эффективного использования мукозальной иммунизации для индукции иммунного ответа на чужеродные белки, экспрессируемые в составе генома рекомбинантных ВВ, дают основания говорить о возможности разработки мукозальной (пероральной) рекомбинантной вакцины на основе ВВ.

Ранее в РФ двумя группами исследователей была получены рекомбинантные живые вакцина против, НО и ГВ для накожного применения на основе рекомбинантных штаммов ВВ в ген тимидинкиназы которых был встроен фрагмент ДНК вируса ГВ, кодирующий синтез белков HBsAg [Черное, 1990] и HBsAg и preS2-S [Муратов, 1993]. В проведенных клинических исследованиях на ограниченной группе волонтеров с использованием скарификаци-онной иммунизации были показаны безопасность, хорошая иммуногенность к ВВ, но выраженного иммунного ответа на HBsAg получить не удалось [Черное, 1990; Муратов, 1993]. Одной из возможных причин отсутствия иммунного ответа на HBsAg мог быть иммунитет к ВВ, так как в исследовании принимали участие волонтеры, ранее вакцинированные против оспы [Бектемиров, 2002]. Использование же мукозальной иммунизации, как уже отмечалось, позволяет преодолевать системный иммунитет к ВВ, созданный при предшествующей иммунизации.

Все это делает актуальной разработку пероральной вакцины, которая была бы безвредной, эффективной, технологичной и позволяла бы в короткие сроки вакцинировать большие контингенты людей и не только против НО, но и ГВ. Такая вакцина может быть использована в Вооруженных Силах, милиции, службах безопасности, где люди находятся в условиях скученности и экстремальных ситуациях (ранения, контакты с чужой кровыо, экстренные переливания крови и др.).

Цель и задачи исследования

Целью нашего исследования было проведение клиниче ских испытаний бивакцины оспы и ГВ эмбриональной, живой рекомбинантной, таблетки «Ре вакс-ВТ» на ограниченной группе добровольцев.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить качество приготовленных серий бивакцины в соответствии с требованиями, заложенными в ФСП.

2. Провести отбор волонтеров для проведения клинических испытаний в соответствии с требованиями, заложенными в Программе клинических испытаний.

3. Изучить безопасность, реактогенность и иммуногенность бивакцины при однократной оральной вакцинации.

4. Изучить безопасность, реактогенность и иммуногенность бивакцины при двукратной оральной вакцинации.

5. Оценить возможность выделения вируса в окружающую среду у привитых бивакци-ной волонтеров.

Научная новизна работы. Впервые показано, что бивакцина в дозе 6,9 lg ООЕ ареак-тогенна при однократной вакцинации добровольцев, ранее вакцинированных против оспы.

Отмечена значительная реактогенность бивакцины при ее однократном оральном применении в дозах 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ на добровольцах, ранее невакцинированных против натуральной оспы (в 25 и 50% случаев соответственно), а также в дозе 7,6 lg ООЕ на добровольцах, ранее вакцинированных против натуральной оспы (у 40% добровольцев).

Установлено, что выраженный гуморальный иммунный ответ к ВВ может быть получен у волонтеров, однократно привитых в условиях первичной и отдаленной вакцинации только дозой бивакцины 7,6 lg ООЕ (83% и 90% соответственно).

Показано, что гуморальный иммунитет к ВВ, создаваемый оральной бивакциной при однократной иммунизации, является менее напряженным и продолжительным, чем при ска-рификационной иммунизации.

Показано, что двукратное введение бивакцины дозах 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ с различными интервалами между ними (1, 2 недели- 1, 3−6 месяцев) добровольцам в условиях отдаленной вакцинации в максимальном варианте дает лишь в легкой степени выраженности местные и общие реакции.

Показано, что у добровольцев, иммунизированных двукратно бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ с интервалом между введениями 1 — 2 недели) в условиях отдаленной ревакцинации, в 90−100% случаев формируется защитный уровень антител к вирусу вакцины. Увеличение интервала между введениями до 1 или 3−6 месяцев снижает сероконверсию до 55% и 50%) соответственно.

Показано, что гуморальный иммунитет к ВВ, создаваемый при двукратной иммунизации оральной бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ с интервалом между введениями 1 — 2 недели является более напряженным и продолжительным, чем таковой, создаваемый при однократной иммунизации оральной бивакциной.

Показано, что однократная и двукратная оральная иммунизация бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и/или 7,6 lg ООЕ добровольцев в условиях первичной и отдаленной вакцинации не приводит к формированию значимого уровня гуморального иммунного ответа на маркер ВГВ (иммунная прослойка среди привитых волонтеров была существенно менее 70%).

Показано, что при однократной и двукратной оральной иммунизации бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и/или 7,6 lg ООЕ добровольцев в условиях первичной и отдаленной вакцинации (даже когда наблюдались местная и общая реакции у добровольцев) не удается зарегистрировать наличие рекомбинантного ВВ в исследуемых пробах крови, слюны, мочи, взятых от привитых добровольцев.

Основные положения, выносимые назащиту.

1. Использование двукратной оральной иммунизации сначала дозой бивакцины 6,9 lg ООЕ и далее дозой 7,6 Ig ООЕ с интервалом в 1 или 2 недели позволяет свести к минимуму проявления реактогенности.

2. Формирование иммунной прослойки к оспе (>70%) в течение не менее 6 месяцев у добровольцев, двукратно орально иммунизированных бивакциной сначала дозой бивакцины 6,9 lg ООЕ и далее дозой 7,6 lg ООЕ с интервалом в 1 или 2 недели, в условиях отдаленной вакцинации против этой инфекции.

3. Иммунизация вакциной против гепатита В с последующей двукратной оральной иммунизацией бивакциной позволяет получить выраженный иммунный ответ к HBsAg у 50% привитых волонтеров, тогда как иммунизация вакциной против гепатита В после двукратной оральной иммунизацией бивакциной позволяет получить иммунную прослойку к HBsAg у 30% привитых.

4. Оральная однократная и двукратная иммунизация добровольцев бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и/или 7,6 lg ООЕ, соответственно в условиях первичной и отдаленной вакцинаций, в том числе при наличии местных и общих реакций у волонтёров, является безопасной для окружающих, так как исключает выделение рекомбинантного вируса в окружающую среду.

Практическая значимость работы. После проведения Государственных клинических испытаний на расширенной группе добровольцев бивакцина может быть использована в качестве противооспенной вакцины для лиц, вакцинированных против НО. Возможно применение в качестве бивакцины для лиц, ранее вакцинированных против, НО и ГВ. Для лиц ранее невакцинированных против, НО или вакцинированных, но у которых срок от предыдущей вакцинации превышает 20−25 лет, возможно, использовать бивакцину в качестве противооспенной вакцины, но в этом случае необходимо применение двукратной иммунизации.

Результаты, полученные в исследованиях (зависимость проявлений реактогенности и формирования гуморального иммунного ответа от иммунизирующей дозы, выбор оптимальной схемы двукратной иммунизации), могут оказать существенную помощь при проведении работ по изучению и разработке новых противооспенных вакцин и рекомбинантных вакцин, созданных на основе ВВ.

Апробации работы. Результаты работы были доложены на конференциях: Biological Medical Defense Conference 2004, Munich, Germany, October 20−21 2004, P. 98, 2-я Международная конференция «Наука — Бизнес — Образование Биотехнология — биомедицина — Окружающая среда», тезисы докладов — 10 — 13 мая 2005 г., Пущино, С. 91 — 92, XIII International Congress of Virology, San Francisco, California, USA, July 23 — 28, 2005. — 181-V-416, P. 164, VI.

Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ, 13−14 сентября 2005 г., Волгоград, С. 286−287- Biological Medical Defense Conference 2005, Munich, Germany, October 26−27 2005, P. 115.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая положительное решение на выдачу патента РФ, а также подана 1 заявка на патент.

Личный вклад соискателя: участие в организации проведения клинических испытаний бивакцины против оспы и гепатита В, экспериментальные исследования по паспортизации приготовленных серий бивакцины, изучение гуморального иммунного ответа к вирусу вакцины у вакцинированных добровольцев, вирусологические исследования проб крови, слюны и мочи от вакцинированных волонтеров и обработка полученных результатов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Выводы:

1. Установлено, что ни в одном случае при однократной и двукратной оральной иммунизации бивакциной добровольцев в условиях первичной и отдаленной вакцинации не был обнаружен рекомбинантный вирус вакцины в исследуемых пробах крови, слюны, мочи в течение 14 дней (срок наблюдения).

2. Показано, что бивакцина ареактогенна в дозе 6,9 lg ООЕ при оральной иммунизации волонтеров, ранее вакцинированных против оспы, тогда как при оральной иммунизации волонтеров, ранее не вакцинированных против НО, отмечена реактогенность у 25% привитых волонтеров. Увеличение же иммунизирующей дозы до 7,6 lg ООЕ вызывает реактогенность у 40% добровольцев, ранее вакцинированных против оспы, и у 50% добровольцев, ранее не вакцинированных против оспы.

3. Последовательная вакцинация добровольцев, ранее вакцинированных против оспы, дозами оральной бивакцины — 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ, с различными интервалами между иммуни-зациями -1,2 недели, 1, 3 и 6 месяцев, вызывает местные и общие реакции лишь легкой степени выраженности.

4. Однократная оральная иммунизация бивациной дозой 7,6 lg ООЕ создает защитный уровень антител к вирусу вакцины у 90% волонтеров, ранее вакцинированных против оспы, и у 83% волонтеров, ранее не вакцинированных против оспы. Но при этом не удается достигнуть защитного уровня антител к HBsAg даже при помощи дополнительной иммунизации вакциной против гепатита В.

5. Показано, что последовательная оральная иммунизация бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ с интервалом между введениями в 1 или 2 недели приводит к формированию иммунитета к вирусу вакцины у 95% привитых добровольцев, тогда как увеличение данного интервала с 1 до 6 месяцев приводит к формированию 50% иммунной прослойки.

6. Установлено, что последовательная оральная иммунизация бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ с интервалом 1 или 2 недели обеспечивает напряженный иммунитет к вирусу вакцины в течение 6 месяцев (срок наблюдения), при этом только дополнительная иммунизация вакциной против гепатита В приводит к формированию 30% иммунной прослойки к HBsAg.

7. 50% иммунной прослойки к HBsAg удается достичь только при иммунизации вакциной против гепатита В с последующей двукратной оральной иммунизацией сначала бивакциной дозой 6,9 lg ООЕ и затем бивакциной в дозе 7,6 lg ООЕ, при этом интервал между введениями составляет 1 месяц.

8. Результаты исследований реализованы при разработке Экспериментально-производственного регламента на бивакцину.

Заключение

Иммунизация ВВ позволяет создать защиту не только против, НО но и других патогенных для человека ортпоксвирусов, при этом индуцируется как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. При этом обе формы индуцируемого иммунитета играют важную роль в создании протективности против НО. Однако использование вакцин, применявшихся во время кампании по ликвидации оспы, в настоящее время является нецелесообразным. В первую очередь это связано с появлением большого контингента лиц с различными нарушениями иммунной системы — больные СПИД, пациенты после пересадки органов, а также люди с кожными и аллергическими заболеваниями.

Одним из путей повышения безопасности вакцинации против, НО является создание вакцин на основе высокоаттенуированных штаммов ВВ, таких как MVA. Но, учитывая низкую антигенную активность таких штаммов ВВ, оптимальным будет применение комбинированных схем вакцинации: первая иммунизация — вакциной, приготовленной из высокоаттенуированных штаммов, и вторая этой же вакциной или вакциной, приготовленной из штаммов с остаточной вирулентностью, таких как Wyeth или Lister. Другим способом повышения безопасности вакцинации против, НО является применение мукозалыюй иммунизации. Основными достоинствами этого подхода является физиологичность введения антигена, отсутствие травматизации кожи, а также способность индуцировать как мукозальный, так и системный иммунитет.

Другим важным направлением повышения безопасности вакцин против, НО является создание рекомбинантных вакцин на основе ВВ. Такие вакцины позволяют создавать иммунитет не только против НО, но и индуцируют иммунный ответ против чужеродного вирусного белка, экспрессируемого в составе генома ВВ. Мукозальная иммунизация рекомбинант-ными ВВ приводит к индукции системного и мукозального иммунитета, как против ВВ, так и чужеродного белка, экспрессируемого в составе генома ВВ. К тому, же мукозальная иммунизация рекомбинантным ВВ позволяет преодолевать иммунитет, созданный предварительной парентеральной иммунизацией ВВ. Этот эффект выражается в том, что у предварительно иммунизированных скарификационным способом ВВ мышей, иммунный ответ на чужеродный белок, экспрессируемый в составе рекомбинантного ВВ, существенно выше при последующей мукозалыюй иммунизации рекомбинантным ВВ, чем при парентеральной.

Одними из первых были получены рекомбинантные штаммы ВВ, экспрессирующие HBsAg ВГВ. Это связано с тем, что проблема заболеваемости ГВ является одной из ключевых проблем здравоохранения в мире, в том числе и для России. Профилактика ГВ в мире на сегодняшний день ведется в основном с помощью субъединичных вакцин, гарантирующих в подавляющем большинстве случаев создание иммунитета против ГВ. Недостатками этих вакцин является дороговизна и необходимость многократной вакцинации для создания про-тективного иммунитета, а также сложность выделения рекомбинантного HBsAg и не натив-ный характер гликозилирования. Создание же рекомбинантных вакцин против ГВ на основе рекомбинантного ВВ позволило бы существенно упростить производство и снизить стоимость вакцины. В этой связи в ГНЦ ВБ «Вектор» разрабатывалась рекомбинантная живая вакцина против, НО и ГВ для накожного применения на основе рекомбинантного штамма b7,5S2-S ВВ, полученного путем встройки в ген тимидинкиназы штамма ЛИВ-П ВВ фрагмента ДНК вируса ГВ, кодирующего синтез белков HBs и preS2-S. Показана ее иммуногенность на людях в виде индукции гуморального и клеточного ответа на ВВ и HBs-антиген.

Обращает на себя внимание ее выраженная иммунологическая безопасность и сниженная по сравнению с исходным штаммом ВВ (Л-ИВП) реактогенность. Однако этот препарат также как и другие, разрабатываемые за рубежом, имеет существенные недостатки, ассоциированные с инъекционным применением.

Все это делает актуальной разработку пероральной рекомбинантной вакцины, которая была бы безвредной, эффективной, технологичной и позволяла бы экспрессно в короткие сроки прививать большие контипгенты людей и не только против НО, но и ГВ. В этой связи в рамках данной диссертационной работы наши усилия были сфокусированы на реализацию именно этого направления исследований.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Вирусы. В работе использовали разработанный в ГНЦ ВБ «Вектор» в 1988 году ре-комбинантный штамм b7,5S2-S ВВ, который был получен путем встройки в ген тимидинки-назы ВВ (штамм Л-ИВП) фрагмента ДНК вируса ГВ, кодирующий синтез белков HBs и preS2 (Патент РФ N1575576, 1988). Для проведения РН использовали ВВ штамм ЛИВП (с0355 к0602), полученный из Института вирусных препаратов АМН РФ, г. Москва, в 1986 году, прошедший 10 пассажей на развивающихся куриных эмбрионах.

2.2 Вакцины. Бивакцина представляет собой рВВ, штамм b7,5S2-S, выращенный на ХАО и высушенный со стабилизатором (пептон, 5%), без консерванта, спрессованный с наполнителем в таблетки. Причем наработку бивакцины проводили на основе производственного штамма b7,5S2-S, полученного на РКЭ (Венгрия), свободных от посторонней микрофлоры. В таблетке содержится от МО6 до 4−107 ООЕ ВВ, что составляет одну прививочную дозу. Производство бивакцины проводили на базе Вирусологического центра НИИМ МО РФ.

В работе использовали две серии «Бивакцины оспы и гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной, таблетки (Ревакс-ВТ)» № 10 и № 11 с концентрацией ВВ 3,9×107 и 7,6×106 ООЕ/таблетку соответственно, приготовленные согласно проекта ЭПР в соответствии ранее описанного метода (Патент РФ № 2 076 735, 1997), прошедшие контроль качества согласно требованиям проекта ФСП в ОБТК ВЦ НИИМ МО РФ, ГНЦ ВБ «Вектор» и аттестованные в ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Паспорта на эти серии бивакцины представлены в приложении 2.

Для усиления иммунного ответа к HBsAg использовали коммерческую рекомбинант-ную дрожжевую жидкую вакцину против гепатита В «Комбиотех».

2.3 Культуры клеток. Для титрования вируссодержащего материала, а также для определения титров вируснейтрализующих антител к ВВ использовали культуру клеток 4647. Культура клеток 4647 (перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки) является высокочувствительной к ВВ [Сергеев, 2004]. Линия клеток 4647 получена из ткани почки африканской зеленой мартышки в 1974 году в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН, г. Москва (Вопросы вирусологии). В ГНЦ ВБ «Вектор» линия клеток поступила 19.04.87 г. из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН, г. Москва. Рабочий и посевной банки этой культуры клеток были аттестованы в комитете МИБП (протокол N 9 от 20.11.2003) и в ГИСК им. Л. А. Тарасевича (протокол N 14 от 28.10.2003).

Для определения уровня экспресии HBsAg ВГВ использовали перевиваемую культуру клеток Vero.

2.4 Куриные эмбрионы. Для оценки концентрации ВВ в различных пробах, а также для определения титров вируснейтрализующих антител к ВВ использовали 11 — 13-дневные РКЭ породы кросс «Белый Леггорн», ГОСТ 27 583–88.

2.5 Животные. Для определения токсичности препаратов бивакцины использовали беспородных белых мышей массой 16 — 20 г и морских свинок массой 250 — 300 г.

2.6 Методы определения концентрации вируса вакцины.

2.6.1 Титрование вируса на ХАО РКЭ. Титрование ВВ на ХАО РКЭ проводили по ранее описанной методике [Лярски, 1980]. При этом подготовку РКЭ проводили в темной комнате. Каждый эмбрион просматривали в луче света от местного источника освещения, например, осветителя микроскопа. Свет должен падать на тупой конец яйца. Браковали РКЭ с погибшим эмбрионом или с кровоизлияниями под оболочкой. В центре воздушного мешка и на боковой поверхности яйца (на участке между сосудами) карандашом делали отметку. В отмеченных местах оспопрививательным пером или другим инструментом делали отверстие диаметром 1 — 3 мм, не повреждая оболочку. На боковую поверхность яйца в отверстие наносили каплю стерильного раствора Хэнкса, подогретого до 50 °C. Из отверстия в центре воздушного мешка резиновой грушей осторожно отсасывали воздух до полного опускания ХАО. РКЭ с опущенной ХАО помещали на лотки отверстием вверх и выдерживали при температуре 37,0 °С. Через 2 час проводили овоскопию и браковали РКЭ, имеющие кровоизлияния, воздушные мешки под ХАО или неопущенную ХАО, и заклеивают парафином отверстие в тупом конце ХАО. Десятикратные разведения вируссодержащего материала вводили шприцами вместимостью 1,0 мл, снабженными иглами с притуплёнными концами. Объем дозы, вводимой на ХАО КЭ, составлял 0,10 мл. На каждое разведение брали 6 РКЭ. РКЭ, инфицированные вирусом, инкубировали при температуре 37,0 °С в течение 48 часов. После окончания инкубирования РКЭ вскрывали, изолировали ХАО, промывали ее в воде и подсчитывали количество специфических образований (оспин) на ХАО на темном поле. Из опыта исключали РКЭ с поврежденной ХАО и погибшие.

2.6.2 Титрование ВВ на культуре клеток. Титрование ВВ на культуре клеток 4647 проводили по методике, описанной в работе [Leparc-Goffart, 2005]. Для этого готовили клеточную суспензию посевной концентрации — 200 000 кл./мл. После чего в каждую лунку (титрование проводили в 24-луночных планшетах) вносили по 0,7 мл приготовленной суспензии. Выращивание культур клеток 4647 на ростовой среде (среда RPMI-1640 с 10% эмбриональной сыворотки, бензилпенициллина натриевая соль до концентрации 100 ед./мл и стрептомицина сульфат до 100 мкг/мл) проводили при 37 °C в течение 1 — 2 суток до образования мопослоя клеток. Готовность монослоя оценивали с помощью инвертированного микроскопа. В работу брали планшеты со сформированным 90−100%-м монослоем в лунках. Десятикратные разведения вируссодержащего материала готовили на растворе Хэнкса с 2% инактивированной эмбриональной сыворотки (сыворотку предварительно инактивируют в водяной бане при 56 °C в течение 30 минут). Из лунок со сформировавшимся монослоем удаляли ростовую среду и добавляли разведения вируса. Клетки инкубировали с вирусом в течение 60 минут при 37 °C, после чего удаляли неадсорбировавшийся вирус и добавляли по 0,7 мл поддерживающей среды (среда RPMI-1640 с 2% эмбриональной сыворотки, бензил-пенициллина натриевая соль до концентрации 100 ед./мл и стрептомицина сульфат до 100 мкг/мл). Зараженные клетки инкубировали в течение 48−72 часов при температуре 37 °C в атмосфере 5% -ной объемной долей углекислого газа. После чего в каждую лунку вносили по 0,2 мл раствора красителя в фиксирующем растворе. Для окраски клеточного монослоя готовили раствор генциана фиолетового. Для этого 1 г геицианового фиолетового растворяли в 50 мл этилового спирта, добавляли 700 мл дистиллированной воды и 300 мл формалина. Через 30 минут экспозиции при комнатной температуре раствор генциана фиолетового удаляли, отмывая трехкратно дистиллированной водой с помощью автоматической пипетки, заливая в каждую лунку по 1 — 2 мл дистиллированной воды, и оставляли планшету открытой для высушивания. Подсчет количества бляшек в лунках проводили визуально.

2.7 Определение титров вируснейтрализуннцих анител к ВВ в реакции нейтрализации.

2.7.1 Определение вируснсйтрализующих антител к ВВ в реакции нейтрализации на ХАО РКЭ. Метод анализа основан на способности специфических антител сыворотки крови нейтрализовать репродукцию ВВ на ХАО РКЭ. Это действие проявляется в уменьшении числа оспин на ХАО в сравнении с контролем [Справочник, 1967]. Для этого на растворе Хэнкса с 2% инактивированной эмбриональной сыворотки (сыворотку предварительно инактивируют в водяной бане при 56 °C в течение 30 минут) готовили пятикратные разведения исследуемой сыворотки: 1:5, 1:25, 1:125 и т. д. Перед постановкой РН исследуемые сыворотки инактивировали в водяной бане при 56 °C в течение 30 минут. Приготовленные пятикратные разведения исследуемой сыворотки смешивали с рабочим разведением Аг, в качестве Аг использовали штамм Л-ИВП ВВ. Рабочее разведение Аг готовили на разводящей жидкости с учетом предварительного его титрования на ХАО РКЭ. Рабочим разведением антигена Аг считали разведение, которое образует от 30 до 60 оспин на ХАО. Полученные смеси рабочего разведения антигена Аг и разведений сывороток инкубировали в течение 1 часа при 37 °C. Проинкубированные смеси антигена Аг и разведений сывороток наносили на заранее приготовленные ХАО РКЭ. В качестве контроля ставили рабочее разведение антигена Аг. Подготовку РКЭ и все последующие манипуляции проводили, как описано в разделе 2.6.1. На каждое разведение сыворотки брали от 4 до 6 РКЭ. На каждое контрольное разведение антигеиа Аг вируса использовали 6 шт. РКЭ. За титр сыворотки принимали ее конечное разведение, подавляющее рост более 50% оспин по сравнению с контролем рабочего разведения антигена Аг.

2.7.2 Определение вируснейтрализующих антител к ВВ в реакции нейтрализации на культуре клеток по методу бляшек. Реакция нейтрализации на культуре клеток с использованием метода бляшек предназначена для определения титра антител к ВВ в биопробах, взятых у людей и экспериментальных животных. Метод анализа основан на способности специфических антител сыворотки крови нейтрализовать репродукцию ВВ на культуре клеток. Это действие проявляется в уменьшении числа бляшек на культуре клеток в сравнении с контролем [Leparc-Goffart, 2005]. Основные манипуляции, используемые при проведении этой методики, описаны в разделах 2.6.2 и 2.7.1. Рабочим разведением Аг считали разведение, которое давало от 30 до 60 бляшек на лунку с монослоем культуры клеток 4647. За титр сыворотки принимали ее конечное разведение, подавляющее рост более 50% бляшек по сравнению с контролем рабочего разведения Аг.

2.7.3 Определение маркеров к ВГВ. Выявление антител к HBsAg, наличия HBsAg и антител к HBCor Ag в сыворотках крови людей регистрировали с помощью сертифицированных в МЗ России иммуноферментных тест-систем «Векто HBs Ag-антитела-стрип», с Ag"PeKOMaTren В-стрип" и «Векто HBCor-антитела-стрип» (производство ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская область, п. Кольцово). Чувствительность последней тест-системы по ОСО ГИСК — 0,2 нг/мл. Общепринято, что защитные концентрации антител к HBsAg в сыворотках крови человека составляют >10 мМЕ/мл.

2.8 Методы контроля качества препаратов бивакцины 2.8.1 Таблетка без оболочки (оральная бивакцина) Состав:

1. Сухой вируссодержащий материал — не более 0,3;

2. Наполнитель — не менее 0,7.

Доля компонентов наполнителя:

1) лактоза (ТУ 6−09−2293−77), стабилизатор и наполнитель — 0,878;

2) сахароза (ГОСТ 5833−75), стабилизатор и органолептик — 0,100;

3) стеарат кальция (ТУ 6−09−4233−76), скользящая добавка — 0,020;

4) ванилин (ГОСТ 16 599−71), органолептик — 0,002.

2.8.1 Внешний вид. Этот показатель оценивали при визуальном осмотре на 20 таблетках. Согласно проекта ФСП таблетки должны быть круглой двояковыпуклой формы (с цельными краями) диаметром 6−12 мм серо-белого или темно-коричневого цвета, зависящего от вида защитного покрытия, имеющие на изломе серо-белую мелкозернистую поверхность. Препарат должен обладать сладким вкусом и иметь запах ванилина.

2.8.2 Подлинность. Контроль проводили одновременно с определением специфической активности при подсчете не менее 1000 оспин (ФС 42−3133−95). Согласно проекта ФСП би-вакцина должна вызывать на ХАО РКЭ однотипные ООЕ диаметром от 0,5 до 3,0 мм.

2.8.3 Прочность на истирание. Определение проводили по НТД (ГФ XI, вып. 2, с. 156 159). Для таблеток без покрытия прочность на истирание должна быть не менее 97%.

2.8.4 Средним масса и отклонение от средней массы. Определение проводили по НТД (ГФ XI, вып.2, с. 156). Средняя масса таблеток должна быть от 0,1 до 1,0 г. Отклонение от средней массы — не более 15%.

2.8.5 Потерн в массе при высушивании. Определение проводили согласно НТД (ФС 42−3874−99). Потеря в массе при высушивании должна быть не более 3%. Для двух параллельных анализов используют 6 таблеток.

2.8.6 Микробиологическая чистота. Определение микробиологической чистоты проводили на питательных средах с соблюдением правил асептики согласно требованиям НТД (ГФ XI, вып.2, с. 196−201, 208−209 и Изменению № 1). В таблетке допускается наличие не более 1000 непатогенных бактерий и 100 дрожжевых и плесневых грибов (суммарно), должны отсутствовать бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.

Количество исследуемых таблеток по массе должно быть не менее 3 г. Таблетки брали стерильным пинцетом и помещали в стерильную фарфоровую ступку с пестиком, растирали и суспендировали в стерильном растворе Хэнкса в соотношении 1:10 (1 г в 10 мл).

2.8.7 Токсичность. Определение проводили по НТД (МУК 4.¼.2.588−96). Препарат должен быть нетоксичен (безвреден) для морских свинок в дозе 1 таблетка и белых мышей в дозе 1/25 таблетки. Для определения токсичности брали 3 таблетки одной серии, растирали в стерильной ступке, суспендировали в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида (5 мл на таблетку) и после отстаивания в течение 45−60 мин надосадочную жидкость вводили подкожно по 5 мл каждой из двух морских свинок массой 250−300 г, (по 2,5 мл в каждый бок), и по 0,2 мл пяти беспородным белым мышам массой 16−20 г в холку. Наблюдение за животными проводили в течение 5 сут. В случае развития абсцесса или гибели хотя бы одного животного производили повторный анализ на удвоенном количестве животных. Если при повторном анализе вновь регистрировали вышеперечисленные явления, серию препарата браковали.

2.8.8 Специфическая активность. Определение специфической активности проводили методом титрования на ХАО 12−13 суточных РКЭ. Метод титрования описан в разделе 2.6.1 В одной таблетке препарата должно содержаться от МО6 до 4−107 ООЕ вируса вакцины. Объем выборки составлял не менее 7 таблеток.

2.8.9 Индуцирование поверхностного Аг ВГВ на культуре клеток Vero. Монослой клеток Vero в 24-луночных планшетах инфицировали суспензией бивакцины с множественностью 5−20 ООЕ на клетку. Далее проводили адсорбцию вируса при температуре 37 °C в течение 1 часа, после чего удаляли неадсорбировавшийся вирус. Монослой промывали средой Игла MEM, в каждую лунку добавляли по 1 мл среды Игла MEM, содержащей 2% эмбриональной сыворотки крови телят. Зараженные клетки инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 °C в присутствии 5% -ной объемной доли углекислого газа в СОг-инкубаторе, после чего, для разрушения клеток, планшеты двукратно замораживали до образования кристаллической массы и оттаивали до температуры не ниже 0 °C. После чего клеточную суспензию обрабатывали ультразвуком два раза по 30 с при максимальной частоте ультразвука. Полученный гомогенат тестировали на наличие HBsAg в ИФА при помощи тест-системы «Рекоматгеп В», производства «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия (либо другой не менее чувствительной). Концентрация HBsAg в исследуемых образцах должна быть не менее 50 нг/106 клеток.

2.9 Контингент п порядок проведения испытаний.

2.9.1 Подбор контингента, формирование групп волонтеров и проведение испытаний проводили согласно «Программе ограниченных клинических испытаний реактогенно-сти, безопасности и иммуногеипости бивакцины оспы и гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной, таблетки („Ревакс-ВТ“)», которая представлена в приложении 1.

2.9.2 Изучение безопасности и реактогенности проводили согласно «Программе ограниченных клинических испытаний реактогенности, безопасности и иммуногенности бивакцины оспы и гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной, таблетки („Ревакс-ВТ“)», которая представлена в приложении 1.

2.9.3 Метод изучения безопасности бивакцины для окружающих. Безопасность вакцины для окружающих оценивали путем определения ВВ в пробах слюны, плазмы и мочи, полученных от привитых волонтеров в течение 14 суток после проведенной вакцинации. Для предупреждения бактериального и грибкового пророста в пробы слюны и мочи после забора добавляли нистатин (20 ед./мл), стрептомицина сульфат (100 мкг/мл) и бензилпенициллина натриевую соль (100 ед./мл). Пробы центрифугировали, и осветленные пробы брали в работу [Лярски, 1980]. Наличие ВВ в осветленных пробах анализировали путем титрования методом оспин на ХАО РКЭ или путем титрования методом бляшек на культуре клеток, как описано в разделах 2.6.1. и 2.6.2.

2.9.5 Изучение специфической иммуногеипости. Титры антител к ВВ в образцах крови (до и через 30 суток, 6 и 9 месяцев после вакцинации) привитых людей оценивали в РН так, как описано в разделах 2.7.1. и 2.7.2. Общепринято, что защитные титры антител к ВВ в сыворотке крови человека составляют >1:25. Выявление антител к HBsAg в сыворотках крови привитых людей (до и через 30 суток, 6 и 9 месяцев после вакцинации) проводили согласно разделу 2.7.3. Считается, что минимальные защитные концентрации антител к HBsAg, определяемые методом ИФА, в сыворотках крови человека составляют >10 мМЕ/мл.

2.9.6 Обработка результатов испытаний. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами [Ашмарин и Воробьев, 1962; Закс, 1976].

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Исследования проводились в соответствии «Программой ограниченных клинических испытаний реактогенности, безопасности и иммуногенности бивакцины оспы и гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной, таблетки („Ревакс-ВТ“)», утвержденной председателем Комитета МИБП МЗ РФ. Базовыми организациями для исследования явились НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН, ГНЦ ВБ «Вектор» МЗ РФ и ВЦ НИИ микробиологии МО РФ. Полный текст программы приведен в приложении 1.

3. Клинические испытания бивакцины осны и гепатита В эмбриональной 'живой рекомбинантной.

3.1 Паспортизация и аттестация экспериментально-производственных серий бивакцины.

В соответствии с требованиями Фармакологической статьи предприятия и согласно экспериментально-производственному регламенту было произведено и паспортизовано совместно с Вирусологическим центром научно-исследовательского института микробиологии Минобороны России две серии (№ 10 и 11) бивакцины для проведения клинического испытания этого препарата на ограниченной группе добровольцев.

3.1.1 Изучение физико-химических и биологических свойств серий бивакцины.

В соответствии с требованиями ранее разработанного нами проекта ФСП приготовленные серии бивакцины должны контролироваться по ряду физико-химических и биологических свойств. В связи с этим нами были изучены серии бивакцины № 10 и № 11 по этим показателям, используя методики, предложенные ГФ-XI. Результаты этих исследований представлены в таблицах 1 и 2. Полученные результаты показали, что все приготовленные серии бивакцины соответствовали требованиям, предъявляемым к данному препарату в проекте ФСП.

Показать весь текст

Список литературы

Акимкин В.Г. и др. // Военно мед. жури. — 1997. — № 12. — С.33−36.
Алътштейи АЛ. Вирусные инфекции и генетическая инженерия. // Биотехнология. -1987.-3(3).-С. 276−283.
Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL, 1962.
Безредка A.M. Антивирусотерапия. Л., 1932.
Бектемиров Т.А., Шенкман Л. С., Маренникова С. С. Интерферониндуцирующая способность штаммов вируса осповакцины, различающихся по патогенности. // Вопр. Вирусол.- 1971.-5.-С. 555−560.
Бектемиров Т.А., Подкуйко В. Н., Григорьева Л. В. и др. Сравнительное изучение безопасности вакцинального процесса при оральной и накожной противооспенной иммунизации. // Вопр. вирусол. 2002 — 4. — С. 9−13.
Бондарев В. Н., Войтинский Н. Я. Профилактика и лечение вакцинальных осложнений у детей. Л., 1972.
Брагинская В.Б., Соколова А. Ф. Активная иммунизация и профилактика поствакцинальных осложнений у детей. М., 1977.
Бургасов П.Н., Николаевский Г. П. 1972. Натуральная оспа. М.: Медицина. 208 С.
Бюллетень Всемирной организации здравоохранения. Женева. — 1985. — 64 (3). — С. 31−38.
Волегова Г. М., Хромова Г. В., Эйхнер Э. Э. и др. Вирусный гепатит В как профессиональное заболевание медицинских работников. // Экол, аспекты вирусных гепатитов в Пермской обл. // Перм. гос. мед. ин-т. 1991. — С. 58−61.
Воробьев А.А., Лебединский А. В. Массовые методы вакцинации. М., 1977.
Воробьев А.А., Патрикеев Т. Г., Абрамова Э. Ф. Итоги исследования по разработке и испытанию таблетированной пероральной оспенной вакцины // Журн. микробиол. -1978.-4.-С. 12−17.
Воробьев А.А. Физиологические пути введения антигенов и других биологически активных веществ в организм // Иммунология 1996а. — 5. — С. 4−8.
Воробьев А.А., Подкуйко В. Н., Михайлов В. В., Махлай А. А. Непарантеральые методы иммунизации против оспы // Журн. микробиол. 19 966. — 5. — С. 117−121.
Воробьев А.А., Подкуйко В. Н., Михайлов В. В. Итоги фундаментальных и прикладных исследований по пероральной иммунизации против натуральной оспы. // Журн. микробиол.-2002.- 1.-С. 12−18.
Дмитриев И.П., Муратов П. Ю., Беляев А. С. Штамм рекомбииаитного вируса оспо-вакцины v7,5C, экспрессирующего коровый антиген вируса гепатита В // Заявка N4928632/14.- приоритет от 17.04.91 г., положительное решение от 30.08.91 г.
Закс Л. Статистическое оценивание. М., 1976.
Каганов E.G., Гришина М.Е.а Мартынова М. И. и др. Частота выявления маркеров вирусного гепатита В при различных хронических заболеваниях у детей. // Педиатрия. 1992. — 1.-С. 51−55.
Ладный И.Д. 1985. Ликвидация оспы и предупреждение её возврата. М.: Медицина. 222 С.
Лебединский А.В. Ингаляционный (аэрогенный) метод вакцинации. М., 1971.
Лопарев Б.Н., Арасланов P.P., Митина И. Б. и др. Синтез частиц кор-антигена вируса гепатита В (HBcAg) рекомбинантным штаммом вируса осповакцины. // Молекул, ге-нет. микробиол. вирусол. 1990. — 10. — С. 18−22.
Маренникова С.С., Ташпулатов Г. М. Сравнительное изучение прививаемости, реакто-генностии антигенной эффективности оспенных вакцин, приготовленных из различных штаммов. // Вопр. вирусол. 1966. — 4. — С. 266−272.
Маренникова С.С., Щелкунов С. Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. КМК Scientific Press Ltd., 1998., С. 386.
Махлай А.А., Подкуйко В. П., Михайлов В. В. и др. Методические принципы испытания таблетированных вирусных препаратов. // Вопр. вирусол. 1997. — 5. — С. 238 239.
Мацевич Г. Р. Специфическая профилактика оспенной инфекции после отмены оспопрививания. Дисс. докт., 1983, М.
Медуницын Н.В. Вакцинология. 2004. М. Триада-Х. 446 С.
Муратов П.Ю. Изучение свойств рекомбинантной живой вакцины против гепатита В «Реваке В» и разработка технологии её производства: Дис.. канд. биол. наук -Кольцово, 1993.
Онищенко Г. Г., Сандахчиев Л. С., Нетесов С. В., Щелкунов С. В. Биотерроризм как национальная и глобальная угроза // Журн. микробиол. 2000. — 6. — С. 83−85.
Г. Г. Онищенко, Л. С. Сандахчиев, С. В. Нетесов, Р. А. Мартышок. БИОТЕРРОРИЗМ: НАЦИОНАЛЬНАЯ И ГЛОБАЛЬНАЯ УГРОЗА // Вест. РАН 2003.- 73. — 3. — С. 195 204.
Подкуйко В. П., Воробьев А. А., Краснянский В. П. и др. Пероральная иммунизация -способ повышения безопасности рекомбинантного вектора (вируса вакцины). // Вести. РАМН. 1993. — 2. — С. 39−45.
Подкуйко В. Н., Воробьев А. А., Максимов В. А. Оценка вакцинального процесса при накожной и пероральной иммунизации кроликов живыми оспенными вакцинами. // Жури, микробиол. 2005. — 5. — С. 40−45.
Пшеничнов В.А., Воробьев А. А., Бадаева Н. М. 1976. Аттенуация вирусов и бактерий. М.: Медицина. 192 С.
Руководство к применению вакцины против гепатита В «Engerix В», производство фирмы Smith-Kleine Biologicals (Риксенсарт, Бельгия).
Сергеев А.А., Сергеев А. Н., Петрищенко В. А. и др. Изучение реактогенности, безопасности и иммуногеипости рекомбинантной бивакцины против оспы и гепатита В на людях // Вопр. вирусол. 2004. — 5. — С. 22−26.
Соловьев В.Д., Мастюкова Ю. Н. Вирус вакцины и вопросы оспопрививания. 1961. М.: Медгиз. 312 С.
С.Н.Соринсон. Вирусные гепатиты. СПб, 1998. — С. 325.
Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. // Под ред. М. О. Биргера. М., Медицина, 1967.
Трясучев И.О., Злобина J1.B., Давыдов А. Г. и др. Частота выявления HBsAg в группах риска.// Тез. докл. 6 Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, Нижний Новгород.- 1991.- Т.1.- М.-1991.- с. 217.
Черепин С.Е., Грановский Н. Н., Арман И. П. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGGA7, кодирующая HBsAg ВГВ и штамм Sacharomyces cerevisiae продуцент. // А.с. N1623207 (СССР), 1990.
Черное В.И., Челяпов Н. В., Антонова Т. П. и др. Использование вируса осповакцины в качестве вектора для созданий живых генно-инженерных вакцин. // Вирусы и вирусные заболевания. 1990а. — 18. — С. 59−60.
Черное Н.В., Челяпов Т. П., Антонова Т. П. и др. Проверка безопасности, прививаемости, реактогенности и антигенных свойств живой рекомбинантной оспенно-гепатитной В-вакцины в опыте на добровольцах // Вопр. вирусол. 1990b. — 2. — С. 133−135.
Унанов С.С., Маренникова С. С., Акатова Э. М. и др. Сравнительная оценка оспенных вакцин. // Вопр. Вирусол. 1967. — 5. — С. 519−525.
Фодор И.И., ЧеркосВ.И., Бендукидзе К. А., Альтштейн А. Д. Живые рекомбинантные вакцины новое направление в биотехнологии. // Биотехнология.- 1987.- Т.З.- N.3.- с. 302−306.
Adamowicz P., Tron F., Vinas R. et al. Hepatitis В vaccine containingl the S and pre-S2 antigens produced in Chinese hamster-ovary cells. // In: Viral Hepatitis and Liver Disease. Alan R. LISS. 1988. — P. 1087−1090.
Ada G.L. How do vaccinia vectored vaccines fit into human immunization programmes? // Res.Virol. 1989. — 140 (5). — P. 470−473.
Ada G.L. Strategies on exploitingl the immune system in the design of vaccines. // Mol. Immunol. 1991.-28 (3). — P. 225−230.
Agromayor M., Ortiz P., Lopez-Estebaranz J.L. et al. Molecular epidemiology of molluscum contagiosum virus and analysis of the host-serum antibody response in Spanish HIV-negative patients. // J. Med. Virol. 2002. — 66. — P. 151−158.
Alvarez R., Rodriguez P., De la Fuente J., Herrera L. Use of the vaccinia virus as a vector for the expression of the hepatitis В surface antigen. // 1-st Iberoamer. Congr. Biotech. -1989.-Havana.-p.6−24.
Amara R.R., Villinger F., Altman J.D. et al. Control of a Mucosal Challenge and Prevention of AIDS by a Multiprotein DNA/MVA Vaccine. // Science 2001 (April). — 292. — P. 6974.
Amara R.R., Nigam P., Sharma S., et al. Long-Lived Poxvirus Immunity, Robust CD4 Help, and Better Persistence of CD4 than CD8 T Cells // J. Virol. 2004. — 78 (8). — P. 38 113 816.
Antonia G., Vagemans J. Assai de vaccination antivacinale cher le lapin. Introduction du vaccin per la voice gastrointestinal. // Compt. Rend. Soc. Biol. 1927. — 97. — P. 720−721.
Antoine G., Scheiflinger F., Dorner F and Falkner F. G. The Complete Genomic Sequence of the Modified Vaccinia Ankara Strain: Comparison with Other Orthopoxviruses // Virol. -1998.-244 (2).-P. 365−396.
Appleyard G., Hapel A.J., Boulter E.A. An antigenic difference between intracellular and extracellular rabbitpox virus. // J.Gen.Virol. 1971. — 13 (1). — P. 9−17.
Arita I. Duration of Immunity after Smallpox Vaccination: A Study Vaccination Policy against Smallpox Bioterrorism in Japan. // Jpn J. Infect. Dis. 2002. — 55. — P. 112−116.
Artenstein A.W., Johnson C., Marbury T.C., et al. A Novel, Cell Culture-Derived Smallpox Vaccine in Vaccinia-Naive Adults // Vaccine. 2005. — 23. — P. 3301−3309.
Ball L.A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. // J. Virol. -1987.-61 (6).-P. 1788.
Bectimirov Т., Lambert P.H., Tarriglia G. Vaccine development perspectives of the World Health Organisation. // J. Med. Virol. 1990. — 31 (1). — P. 62−64.
Belshe R.B., Newman F.K., Frey S.E., et al. Dose-Dependent Neutralizing-Antibody Responses to Vaccinia // J Inect Dis. 2004a. — 189. — P. 493−7.
Belshe R.B., Newman F.K., Frey S.E. et al. Dose-Dependent Neutralizing-Antybody Responses to Vaccinia. // J. Inf. Dis. 2004b. — 189. — P. 493−497.
Belyakov I.M., Moss В., Strober W., et al. Mucosal Vaccination Overcomes the Barrier to Recombinant Vaccinia Immunization Caused by Preexisting Poxvirus Immunity // Proc Nat Acad Sci U S A -1999. 96. — P. 4512−4517.
Belyakov I.M., Earl P., Dzutsev A. et. al. Shared modes of protection against poxvirus infection by attenuated and conventional smallpox vaccinia viruses // Proc. Nat. Acad. Sci. USA -2003. 100 (16). — P. 9458−9463.
Bender B.S., Rowe C.A., Taylor S.F., et al. Oral Immunization with a Replication-Deficient Recombinant Vaccinia Virus Protects Mice against Influenza // J Virol. 1996. — 70 (9). -P. 6418−6424.
Bertland A. et al.- Pat. N4017360. USA.
Benson J., Chougnet C., Robert-Guroff M. et al. Recombinant Vaccine- Induced Protection against the Highly Pathogenic Simian Immunodeficiency Virus SIV mac25i Dependence on Route of Challenge Exposure. // J. Virol. 1998 (May). — 72 (5). — P. 4170−4182.
Biogen, Merck, Smith Kline in hepatitis В cross-licensing deal // Biotechnol. News 1990. -10(10).-P.4−5.
Blumberg В., Millman I., Pat. N3636191. — USA.
Booss J., and Davis L.E. Smallpox and smallpox vaccination. Neurological implications // Neurol. 2003. — 60. — P.1241−1245.
Bryan J.P., Sjogren M.H., Perine P.L., Legters L.J. Low-dose intradermal and intramuscular vaccination against hepatitis B. // Clin. Jnfect. Dis. 1992. — 14 (3). — P. 697−707.
Buller R.M.L., Smith G.L., Gremer K. et al. Decreases virulence of recombinant vaccinia virus expression vectors is associated with a thymidine kinase-negative phenotype // Nature.1985.-317.-P.813−816.
Burrel C.J., Mackay P., Jreenaway P. J. et al. Expression in Echerichia coli of hepatitis В virus DNA sequense cloned in plasmid pBR 322. // Nature. 1979. — 279. — P. 43−47.
Canis F., Dupin I. Simposium international sur la vaccination contre 1 hepatite B: le point on 1989. // Option/Bio. 1989. — 9 — P. 1−4.
Carroll M.W., Moss B. Poxviruses as expression vectors. // Current Opin. Biotechnol. -1997.-8.-P.573−577.
Chakrabarti S., Sisler J.R. and Moss B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. // Bio Techniques. 1997. — 23. — P. 1094−1097.
Chelyapov N.P., Rakhlina L.E., Antonova T.P. et al. Two vaccinia virus recombinants expressing HBsAg with different concentration of a- and pre-S2 antigen determinants // Acta Virol. 1991.- 35 (5). — P.413−422.
Cheng K.C., Smith G.L., Moss B. Hepatitis В virus large surface protein is not secreted but is immunogenic when selectively expressed by recombinant vaccinia virus. // J. Virol.1986.-50(2).-P. 337−344.
Cheng K.C., Moss B. Selective synthesis and secretion of particles composed of the hepatitis В vaccinia virus: induction of antibodies to pre-S and S epitops. // J. Virol. 1987. — 61. -P. 1286−1290.
Combadiere В., Boissonnas A., Carcelain G., et al. Distinct Time Effects of Vaccination on Long-Term Proliferative and IFN-y-producing T Cell Memory to Smallpox in Humans // J.Exp.Med. 2004. — 199 (11). — P. 1585−1593.
Coulibaly S., Bruhl P., Mayrhofer J. et al. The nnonreplicating smallpox candidate vaccines defective vaccinia Lister (dVV-L) and modified vaccinia Ankara (MVA) elicit robust long-term protection// Virol. -2005. 341.-P. 91−101.
Courous A.-M. Epidemiologie des hepatitides virales А, В, C, D et E. // Rev. fr. lab. 1992.- 20 (234). P.39−42.
Coursaget P., Buisson Y., Bourdil С et al. Antibody response to pre-S 1 in hepatitis В virus- induced liver disease and after immunization. // Res.Virol. 1990. — 141 (5). — P. 563−570.
Cresswel P. Questions of presentation. //Nature. 1990. — 343. — P. 593−594.
Czerny C.-P., Eis-Hubinger A.M., Mayr A. et al. Animal poxviruses transmitted from cat to man: current event with lethal end // J. Vet. Med. 1991 — 38 (6). — P. 421−431.
Demkowicz W.E. avd Ennis F Vaccinia Virus Specific CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes in Humans // J. Virol. 1993. — 67 (3). — P. 1538−1544.
Demkowicz W.E., Littaua R.A., Wang J., et al. Human Cytotoxic T-Cell Memory: Long-Lived Responses to Vaccinia Virus // J. Virol. 1996. — 70 (4). — P. 2627−2631.
Diven D.G. An owrview of poxviruses. // J. Am. Acad. Dermatol. 2001. — 44. — P. 1−16.
Downie A.W., McCarthy K. The antibody response in man following infection with viruses of the pox group. // J. Hyg. 1958. — 56. — P. 479−487.
Drexler I., Staib K., Kastenmuller W. et al. Identification of vaccinia virus epitope-specific HLA-A*0201 -restricted T cells and comparative analysis of smallpox vaccines. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003 (Jan). 100 (1). — P. 217−222.
Earl P.L., Americo J.L., Wyatt L.S. et al Immunogenecity of a highly attenuated MVA smallpox vaccine and protection against monkeypox. // Nature 2004 (March). — 428. -P. 182−185.
Edghill-Smith Y, Golding H., Manischewitz J. et al. Smallpox vaccine-induced antibodies are necessary and sufficient for protection against monkeypox virus. // Nat. Med. -2005 (Jun). 11 (7). — P. 740−747.
Eichner M. Analysis of Historical Data Suggests Long-lasting Protective Effects of Smallpox Vaccination. // Amer.J. Epidem. 2003 (Oct). — 158 (8). — P. 717−723.
Ells R.V., Gerety R.S. Key issues in the selection of an expression system for vaccine antigens. // J. Med. Virol. 1990. — 31(1). — P.54−58.
Emini E.F., Ellis R.W., Miller W.J. et al. Production and immunological anallysis of recombinant hepatitis В vaccine. // J. Infect. Dis. 1986. — 13 (Suppl.A). — P. 3−9.
Ennis F., Cruz J., Demkovvicz W.E. et al. Primary Induction of Human CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes and Interferon-y-Producing T Cell after Smallpox Vaccination // J Inect Dis. 2002. — 185. — P. 1657−9
Enserink M. In Search a Kinder, Gentler Vaccine. // Science 2002 (May). — 296 (5573).-P. 1594.
Eo S.K., Gierynska M., Kamar A.A. et. al. Prime-Boost Immunization with DNA Vaccine: Mucosal Route of Administration Changes the Rules // J. Immunol. 2001. — 166. -P. 54 973−5479.
Esposito J.J., Murphy F.A. Infectious recombinant vectored vaccines // Advances in veterinary science and comparative medicine. 1989. — 33. — P. 195−247.
Evans D.II., Stuart D., McFadden G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. // J. Virol. 1988. — 62 (2). — P. 367−375.
Fenner, F., D. A. Henderon, I. Arita, Z. Jezek, and I. D. Ladnyi. 1988. Smallpox and Its Eradication. Geneva: World Health Organization. 1460 P.
Fenner, F., Wittek, R., and Dumbell, K.R. «The Orthopoxviruses». 1989. -Academic Press, Inc., San Diego.
Fogg C., Lustig J., Whiteback J.C. et al. Protective immunity to vaccinia virus induced by vaccination with multiple recombinant outer membrane proteins of intracellular and extracellular virions. // J. Virol. 2004. — 78. — P. 10 230−10 237.
Fox J. and Elveback L. Herd immunity: changing concepts // Viral Immunology and immunopathology / Ed. A. Notkins. New Iork, 1975. — P. 273−290.
Francis D.P., Feorino P.M., McDougal S. et al. The safety of the hepatitis В vaccine. Inaction of the Aids virus during routine vaccine manufacture. // JAMA. 1986. — 256. — P. 869−872.
Frey S.E., Couch R.B., Tackct С. O. et al. Clinical responses to undiluted and diluted smallpox vaccine. // N. Engl. J. Med. 2002. — 346 (17). — P. 1265- 1274.
Frey S.E. and Belshe R.B. Poxvirus zoonoses—putting pocks into context. // N. Engl. J. Med. 2004 (Jan). — 350 (4). — P. 324−327.
Frindale G.S., Fonseca F.G., Marques J.I. et al. Aracatuba virus: a vaccinia like virus associated with infection in human and cattle // Emerg. Infect. Dis. 2003. — 9 (2). — P. 155 160.
Gallwitz S., Schutzbank Т., Heberling R.L. et al. Smallpox: Residual antibody after Vaccination. // J. Clin. Microb. 2003 (Sept). — 41 (9). — P. 4068−4070.
Galmishe M.C., Goenaga J., Wittek R. et al. Neutralizing and protective antibodies directed vaccinia virus envelope antigens. // Virol. 1999. — 254. — P. 71−80.
Gani P. and Leach S. Transmission potential smallpox in contemporary populations. //Nature-2001.-414.-P. 748−751.
Gerety R.J. and West D.J. Current and future hepatitis В vaccines. // Progress in Hepatitis В immunization. Edc P. Coursaget, M.J. Tong. Colloque INSEFM/John Libbey Eurotext LTD. 1990. — 194. — P.215−225.
Chelyapov N.P., Rakhlina L.E., Antonova T.P. et al. Two vaccinia virus recombinants expressing HBsAg with different concentration of a- and pre-S2 antigen determinants // Acta Virol. 1991.-35 (5). — P. 413−422.
Gherardi M.M. and Esteban M. Mucosal and systemic immune responses induced after oral delivery of vaccinia virus recombinants. // Vaccine. 1999. — 17. — P. 1074−1883.
Gherardi M.M. and Esteban M. Recombinant poxviruses as mucosal vaccine vectors. // J. Gen. Virol. 2005. — 86. — P. 2925−2936.
Gillard S., Spehner D., Drillien R. Mapping of a vaccinia host range sequence by insertion into the viral thymidine kinase gene. // J. Virol. 1985. — V.53 (1). — P.316−318.
Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E. et al. The complete DNA sequense of vaccinia virus // Virol. 1990. — 179 (1). — P. 247−266.
Goh K.T., Tan K.L., Kong K.H., Oon C.J., Chan C.J. Comparison of the immune response of four different dosages of yeast recombinant hepatitis В vaccine in Singapore children: a four year follow-up study// Bull. WHO 1992. — 70 (2). — P. 233−239.
Greenberg R.N., Schosser R.H., Plummer E.A. et al. Urticaria, Exanthems, and Other Benign Dermatologic Reactions to Smallpox Vaccination in Adults. // CID. 2004. — 38. -P. 958−965.
Greenberg R.N., Kennedy J.S., Clanton D.J. et al. Safety and immunogenicity of new cell-cultured smallpox vaccine compared with calf-lymph derived vaccine: a blind, single-centre, randomised controlled trial. // Lancet 2005. — 365. — P. 398−409.
Gregoriadis G., Wang Z. s Francis U. Towards a liposome-based hepatitis В virus (HBV) oligipeptide vaccine: Pap. Brit. Pharmaceut. Conf.: Sci. Proc. 128th Meet. // J. Pharm. and Pharmacol. 1991. — 43. — Suppl. — P. 456.
Grotty S., Feigner P., Davies H., et al. Cutting Edge: Long Term В Cell Memory in Humans after Smallpox Vaccination // J Immunol. 2003. — 171. — P. 4969−4973.
Guo Z.S. and Bartlett D.L. Vaccinia as a vector for gene delivery. // Expert Opin. Biol. Ther. 2004 (Jun). — 4(6.) — P. 901−17.
Hammarland E., Lewis M.W., Hansen S.G. et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination // Nat Med. 2003. — 9 (9). — P. 1131−1136.
Hammond G.W., Parker J., Mimms L. et al. Comparison of immunogenicity of two yeast-derived recombinant hepatitis В vaccines. // Vaccine. 1991.-9 (2). — P. 97−100.
Hamory B.H. Hepatitis В vaccines: Who, when, why, andhow much? // Amer.J.of Infection Control. 1989. — 17 (3). — P. 119−120.
Harrington L.E., Robert van der Most, Whitton J.L., et al. Recombinant Vaccinia Virus Induced T-Cell Immunity: Quantitation of the Response to the Virus Vector and the Foreign Epitope // J. Virol. 2002. — 76 (7). — P. 3329−3337.
Hart S. Chimp test for oral hepatitis В vaccine. // Sci. News. 1989. — 136 (13). -P.199.
Hatakeyama S., Moriya K., Saijo M. et al. Persisting Humoral Antiviral Immunity within the Japanese Population after the Discontination in 1976 of Routine Smallpox Vaccinations. // Clin. Diagn. Lab. Immun. 2005 (Apr). — 12 (4). — P. 520−524.
Heermann К. H., Kruse F., Seifer M. and Gerlich V.H. Immunogenlcity of the gene S and pre-S domains in hepatitis В virions and HBsAg filaments. // Intervirology. 1987. -28.-P. 14−25.
Henderson D.A. The looming threat of bioterrorism. // Science. 1999a. — Vol.283. — 1279−1282.
Henderson D.A., Ingesby T.V., Barlett J.C. et al. Smallpox as a biological weapon: medical and public health management. //JAMA. 1999b. — 281. — P. 1300−1308.
Henderson D.A., Moss B. Smallpox and vaccinia. In Plotkin S.A., Orenstein W.A. eds. Vaccincs. Philadelphia: W.B. Saunders. 1999c. — P. 74−97.
Hepatitis B. //Infections diseases. Ed. By R.D.Hoeprich. Harper and Row Publishers, Philadelphia. 1985, p.714−728.
Hepatitis B. Ed. by Gerety R.J. Academic, New — York. — 1985. — P.470.
Hilleman M.R. Vaccines perspectives from the advantage of hepatitis B. // J. Vaccine Research 1992.- 1 (1).-P. 1−15.
Hochstein-Mintzel V., Stickl H., Huber H. -С V. // Zbl. Vet. Med. 1972. — 156. — P. 15−29.
Hochstein-Mintzel V. Smallpox vaccine, then and now. From the «cow lymphe» to the cell-culture vaccine. // Fortschr Med. 1977 — 95 (2) — P.79−84.
Hooper J.W., Custer D.M., Schmaljohn C.S. et al. DNA vaccination with vaccinia virus L1R and A33R genes protects mice against a lethal poxvirus challenge. // Virol. 2000. -266.-P. 329−339.
Hooper J.W., Custer D.M., and Thompson E. Four gene — combination DNA vaccine protects mice against a lethal vaccinia virus challenge and elicitis apptopriate antibody responses in nonhuman primates. // Virol. -2003. — 306. — P. 181−195.
Horton R.C. Hepatitis В vaccine: Extending immunogenicity. // Brit. J. Hosp. Wed. -1990.-43 (6).-P. 409−419.
Hung P.P. Live, oral adeno-recombinant virus vaccines against human hepatits В virus or human immunodeficiency virus infection. // 5th Int. Simp. Microb. Ecol. (ISME 5), Kyoto, 1989: Abstr. S.P. — 1990. — P.35.
Hutin Y.J., Williams R.J., Pebody R. et al. Outbreak of human monkeypox, Democratic Republic of Congo, 1996 to 1997. // Emerg. Infect. Dis. 2001 (May-Jun). — 7 (3). — P. 434−438
Jackson S.S., Ilyinskii P., Philippon V. et al. Role of Genes That Modulate Host Immune Responses in the Immunogenicity and Pathgenicity of Vaccinia Virus. // J. Virol. -2005 10.-P. 6554−6559.
Jakobson J.M., Dienstag J.L. Identification of virus hepatitis B. // Ann.Rev.Med.-1985, — v.36.-p. 241−261.
Jahrling P.B. Production of cell culture and alternative vaccines for smallpox immunization. // WHO ad hoc Committee on Orthopoxvirus Infections, USAMRIID. 1999.
A. Jeffrey H., Symington S. Suspected reactions to hepatitis В vaccine. // Progress in Hepatitis В immunization. Edc P. Coursaget, M.J.Tong. Colloque INSERM/John Libbey Eurotext LTD. 1990. — 194.-P.254.
Jerlier D., Rabourdin Comble C. Antigen processing from cell biology to molecular interactions // Immunol, today. — 1989. — 10 (1). — P. 3−5.
Jilg W., Schmidt M., Deinhardt F. The immune response to hepatitis В vaccination: is there a genetic basis? // Progress in Hepatitis В immunization. Edc P. Coursaget, M.J.Tong. Colloque INSERM/John Libbey Eurotext LTD. 1990. — 194. — P.253.
Johanson B.E. et al. Intrahepatic, nucleocapsid antigen-specific T cells chronic active hepatitis B. //J. Immunol. 1987. — 139 (6). — P. 2015−2019.
Joklik W.K., Becker Y. The replication and coating of vaccinia DNA. // J.Mol.Biol. -1964. 10.-P. 452−474.
Jungers P., Chauveau P., Loubaris T. et al. Immune response to hepatitis В vaccine in chronic uremic patients. // Progress in Hepatitis В immunization. Edc P. Coursaget, M.J.Tong. Colloque INSERM/John Libbey Eurotext LTD. 1990. — 194 -- p. 187−194.
Kalus R.M., Kantor J.A., Gritz L. et al. The use of combination vaccinia vaccines and dual-gene vaccinia vaccines to enhance antigen-specific T-cell immunity via T-cell costimulation. // Vaccine. 1999 (Feb). — 26 (17.) — P. 893−903.
Keller M.A. and Stiehm E.R. Passive Immunity in Prevention and Treatment of Infectious Diseases. // Clin. Micrbiol. Rev. 2000 (Oct). — 13 (4). — P. 602−614
Kempe C.H. Studies on smallpox and complications of smallpox vaccination. // Pediatrics. -1960. 26. — P. 176−189.
Kempe C.H., Fulggeniti V., Minamitani M. et al. Smallpox vaccination of eczema patients with a strain of attenuated live vaccinia (CV-78). // Pediatrics. -1968. 42. — P. 980−989.
Kennedy J.S., Frey S.E., Yan L. et al. Induction of Human T Cell-Mediated Immune Responses after Primary and Secondary Smallpox Vaccination. // J. Inf. Dis. 2004. — 190. -P. 1286−1294.
Kidokoro M., Masato Tashiro M. and Hisatoshi Shida. Genetically stable and fully effective smallpox vaccinestrain constructed from highly attenuatedvaccinia LC16m8. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. — 102 (11). — P.4152−4157.
Klietmann W.F. and Ruoff K.L. Bioterrorism: implications for the clinical microbiologist.//Clin. Microbiol. Rev. 2001. — 14. — P. 364−381.
Kreuzfelder E., Gessernan K.M. Hepatitis-B-impfung. // Gene. 1992. — 13 (1). — P. 1−4.
Krone В., Gerlich W.H., Heerman K.H. et al. Significance of pre-S antigenes for hepatitis В vaccines. // Progress in Hepatitis В immunization. Edc. P. Coursaget, M.J.Tong. Colloque INSERM/John Libbey Eurotext LTD. 1990. — 194. — P. 21−33.
Kutinova L., Nemeckova S., Ilamsikova E. et al. A recombinant vaccinia virus expressing hepatitis В virus middle surface protein. Restricted expression of HBV antigens in human diploid cells. // Arch. Virol. 1990. — 112 (3−4). — P. 181−193.
Kutinova L., Ludvikova V., Simonova V. et al. Search for optimal parent for recombinant vaccinia virus vaccines. Study of three vaccinia virus vaccinal strains and several virus lines derived from them. // Vaccine. 1995 (Apr). -13(5). — P. 487−93.
Lamford F.E., Luckow V., Kennedy R.C. et al. Effective expression of hepatitis В virus surface antigen in recombinant baculovirus. // J. Virol. 1989. — 63 (4). -P. 1549−1557.
Lane J.M., Ruben F.L., Neff J.M. et al. Complications of smallpox vaccination. // N. Engl. J. Med. 1969. — 281. — P. 1201−1208.
Lane J.M., Ruben F.L., Abrutyn E. et al. Deaths attributable to smallpox vaccination, 1959 to 1966, and 1968.//JAMA. 1970. — 212. — P. 441−444.
Lane J.M., Millar J.D. Risks of smallpox vaccination complications in the USA. // Am. J. Epid. 1971.-93.-P.238.
Lane J.M. and Goldstein J. Adverse Events Occuring after Smallpox Vaccination // Sem. Ped. Inf. Dis. 2003. — 14 (3). — P. 189−195.
Law M., Piitz M.M. and Smith G.L. An investigation of the therapeutic value of vaccinia-immune IgG in a mouse pneumonia model. J. Gen. Virol. 86.-2005. — P. 991−1000.
Learned L.A., Reynolds M.G., Wassa D.W. et al. Extended interhuman transmission of monkeypox in a hospital community in the Republic of the Congo, 2003. // Am. J. Trop. Med/ Hyg. 2005 (Aug). — 73 (2). — P. 428−434.
Likos A.M., Sammons S.A., Olson V.A. et al. A tale of two clades: monkeypox viruses. // J Gen Virol. 86. — 2005. — P. 2661−2672
Lei H.-Y., Chao P.-L., Yu C.-K. Factors, influense to immune response to hepatitis В virus surface antigen in mice. // J. Formosan Med. Assoc. 1988. — 3. — P. 274−281.
Legrand F.A., Verardi P.H., Jones L.A. et al. Induction of Potent Humoral and Cell-Mediated Immune Responses by Attenuated Vaccinia Virus Vectors with Deleted Serpine Genes. // J. Virol. 2004 (Mar). — 78 (6). — P. 2770−2779.
Lewis-Jones S. Zoonotic poxvirus infections in humans. Current Opinion in Infectious Diseases. 2004 (Apr.). — 17(2) — P. 81 -89.
Liew F.Y. Sintetic vaccines against viral diseases new approaches. // Immunol. Letters. — 1988. — 19 (2). — P. 241−244.
Li P., Wang N., Zhou D. et al. Disruption of MHC Class II-Restricted Antigen Presentation by Vaccinia Virus. //J. of Immunol. 2005. — 175. — P. 6481−6488.
Littaua R.A., Takeda A., Cruz J. and Ennis F. A. Vaccinia virus-specific human CD4+ cytotoxic T-lymphocyte clones. // J. Virol. 1992. — 66. — P. 2274−2280.
Lofquist J.M., Weimer N.A., and Hayney M.S. Smallpox: A review of clinical disease and vaccination. // Am. J. Heath-Syst. Pharm. 2003 (Apr). — 60. — P. 749−756.
London W.T., Wang Wji Fine M. et al. Epidemiology, pathogenesis and prevention of hepatitis В and liver cancer. Sci. Rept.1988−1989 // Philadelphia. 1989. — 3. — P. 251 255.
Long E. O and Jacobson S. Pathways of viral antigenprocessing and presentation to CTL: defyned by the mode of virus entry. // Immun.today. 1989. — 10. (2). — P. 45−48.
Long E.O. Intracellular traffic and antigen processing. // Imm.today. 1989. — 10 (7). — P. 232−234.
Mack T.M., Noble Jr. J., Thomas D.B. A prospective study of serum antibody and protection against smallpox. // Am. J. Trop. Med. -1972. 21. — P. 214−218.
Machida A., Nakamura T. Hepatitis В vaccine. // Institute of Immunology Co., Ltd. Пат. 5 019 386 США. -1991. N.239 028.
Mahoney M.C., Symons A.B., Kimmel S.R. Smallpox: clinical highlights and considerations for vaccination. J. Postgrad. Med. -2003. 49 (2). — P. 141−147.
Marennikova S.S., Chimishkyan K.L., Maltseva N.N. et al. Characteristics of virus strains for production of smallpox vaccine // Proc. Symp. On Smallpox, 2 and 3 Sept. 1969.
Marennikova S.S. The use of hyperimmune antivaccinia gamma-globulin for the prevention and treatment of smallpox. // Bull. World Health Organ. 1962. — 27. — P. 325 330.
Mason B.B., Davis A.R., Bhat B.M. et al. Adenovirus vaccine vectors expressing hepatitis В surface antigen- importance of regulatory elements in the adenovirus major late intron. //Virol. 1990.- 177 (2). — P. 452−461.
Mayr A., Rath M., Danner K. // Zbl. Vet. Med. 1971. — 18. — P. 102−114.
Mayr A. Smallpox vaccination and bioterrorism with poxviruses. // Сотр. Imm. Microbiol. Inf. Dis 2003 (Oct). — 26 (5−6). — P. 423−430.
McAleer W.J., Buinak E.B., Maigetter R.Z. et al. Human hepatitis В vaccine from recombinant yeast. //Nature. 1984. — 307. — P.178−180.
McCurdy L.H., Larkin B.D., Martin J.E. and Graham B.S. Modified Vaccinia Ankara: Potential as an Alternative Smallpox vaccine. // Clin. Inf. Dis. 2004 — 38 — P. 17 491 753.
McFadden G. Poxvirus Tropism//Nat Rev. -2005.-3. -p. 201−213.
Meeting on the potential use of live viral and bacterial vectors for vaccines. // WHO. MIM/PVD/89.22. — 1989.
Merchlinsky M. Intramolecular homologous recombination in cells infectedwith temperature-sensitive mutants of vaccinia virus. // J. Virol. 1989. — 63 (5). — P. 2030−2035.
Meuer S.C., Dumann H., Meyer Zum Buschenfelde K.H. et al. Low-dose interleukin-2 induces systemic immune responses against. HBsAg in immunodeficient non-responders to hepatitis В vaccination. // Lancet. i.- 1989. — p. 15−17.
Milich D.R., Thornton G.B., Neurath A.R. et al. Enhanced immunogenecity of the pre-S region of hepatitis В virus surface antigen. // Science- 1985. 228. — P. 1195−1199.
Milich D.R., McLachlan A. et al. Antibodies production to nucleocapsid and surface of hepatitis В virus, priming sintetic T-cell site. // Nature. 1987. — 329 (6139). — P. 547 -549.
Milich D.R. Immune response to hepatitis В viral antigens: Application to vaccine development. // Cancer Bull. 1988. — 40 (5). — P. 266−275.
Mondelli M.U., Baldick J., McLachlan A., Chisari F.V.and Moss B. Expression of HBV envelope and nucleocapsid proteins in human cells using vaccinia virus vectors. // Ital. J. Gastroenterol. 1990. — 22 (3). — P. 115−117.
Morikawa S., Sakiyama Т., Hasegawa H. et al. An Attenuated LC16m8 Smallpox Vaccine: Analysis of Full-Genome Sequence and Induction of Immune Protection. // J. Virol. 2005 (Sep). -79 (18). — P. 11 873−11 891.
Mortimer P.P. Can Postexposure Vaccination against Smallpox Succeed? // Clin. Inf. Dis. 2003 (March). — 36. — P. 622−629.
Moss В., Smith G.L., Gerin J.L. and Purcell R.H. Live recombinant vaccinia virus protect chimpanzees against hepatitis B. // Nature. 1984. — 311. — P. 67−69.
Moss B. Vaccinia virus: a tool for research and vaccine development. // Science. -1991.-252. P. 1662−1667.
Moss B. Poxviruses as eukaryotic expression vector. // Seminars in virology. 1992. -3.-P. 277−283.
Moss B. Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996a. — 93. — P. 11 341−11 348.
Moss В. Poxviridae: The viruses and their replication. In «Virology» (B.N. Fields, D.M. Knipe, R.M. Chanock, T.P. Monath, P.M. Howley, J.L.Melnick, B. Roizman, and S.E. Straus, Eds.) 2. — 1996b. — Lippincott-Raven. Philadelphia, pp. 2637−2671.
Moss B. Regulation of Orthopoxvirus Gene Expression // Current Topics in Microbiology and Immunology. 163. — P. 41−70.
Murray K., Bruce. S.A., Hinnen A. et al. Hepatitis В virus antigens made in microbial cell immunise against viral infection. // EMBO J. 1984. — 3. — P. 645−650.
Murray K., Bruce S.A., Wingfield P. et al. Protective immunization against hepatitis В virus with on internal antigen of the virus. // J. Med. Virol.- 1987. 23 (2). — P. 101−107.
Neff J.M., Lane J.M., Pert J.M. et al. Complications of smallpox vaccination. I. National survey in the United States, 1963. // N. Engl. J.Med. 1967. — 276. — P. 125−132.
New report details the coming changes in hepatitis В markets // Biotechnol. News. -1990.- 10(1).-P.5.
Ober B.T., Bruhl P., Schmidt M., V. et al. Immunogenicity and Safety of Defective Vaccinia Virus Lister: Comparison with Modified Vaccinia Virus Ankara. // J. Virol. 2002 (Aug)-76 (15)-P. 7713−7723.
O’Connel C., Karzon D., Barron A. et al. Progressive vaccinia with normal antibodies. A case possibly due to deficient cellular immunity. // Ann. Intern. Med. 1964. — 60. -P. 282−289.
Ogra P.L., Faden H. and Welliver R.C., Vaccination Strategies for Mucosal Immune Responses // Clin Microb Rev 2001. — 14 (3). — P. 430−445.
Orr N., Forman M., Marcus II. et al. Clinical and Immune Responses after Revacci-nation of Israeli Adults with the Lister strain of Vaccinia Virus. // J. Inf. Dis. 2004 (Oct). -190.-P. 1295−1302.
O’Toole T. Smallpox: An Attack Scenario // Emerg. Infect. Dis. 1999. — 5 (4). — P. 540−546.
Paoletti E. Applications of poxvirus vectors to vaccination: an update. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. — 93. — P. l 1349−11 353.
Payne L. Polypeptide composition of extracellular enveloped vaccinia virus. J. Virol. 1978. — V. 27. -№ l.-P. 28−37.
Payne L.G. Significance of extracellular enveloped virus in the in vitro and in vivo dissemination of vaccinia. // J.Gen. Virol. 1980. — V. 50. -№ 1. — P.89−100.
Phillipotis R.J., Lescott Т., Gates A. J., et al. The Immune Response to Vaccinia Virus is Significantly Reduced after Scarification with TK- Recombinants as Compared to Wild Type Virus // Acta Virologica 2000. -44.- 151−156.
Pelkonen P.M., Tarvainen K., Hynnien A. et al. Cowpox with severe generalized eruption, Finland // Emerg. Inf. Dis. 2003. — Vol.9, n. 11.
Pennie R.A., O’Connor A.M., Dulberg C. S- et al. Low-cost hepatitis В vaccine improves uptake among self paying health-care students. // J. Med. Virol. — 1992. — 37. — P. 48−53.
Petre J., Wijnendaele F., de Neys B. et al. Development of a hepatitis В vaccine transformed yeast cells. // Postgrad. Med. J. 1987. — 63 (suppl.2). — P. 73−81.
Poland G.A. and Neff J.M. Smallpox vaccine: problems and prospects. // Immunol. Allergy Clin. North Am. 2003 (Nov). — 23(4). — P. 731−43.
Proposed requirement for hepatitis В vaccines made by recombinant DNA techniques. // Requirement for Biological Substances 1988. — 45. — Expert committee on biological standartization. — WHO. — Geneva.
Piitz M.M., Alberini I., Midgley C.M. et al. Prevalence of antibodies to Vaccinia virus after smallpox vaccination in Italy. // J. Gen. Virol (2005). — 86. -P. 2955−2960.
Ramirez J.C., Gherardi M.M., Rodriges D. and Esteban M. Attenuated Modified Vaccinia Virus Ankara Can Be Used as an Immunizing Agent under Conditions of Preexisting Immunity to the Vector.// J. Virol. 2000a (Aug). — 74 (16). — P. 7651−7655.
Ramirez J.C., Finke D., Esteban M. et al. Tissue distribution of the Ankara strain of vaccinia virus (MVA) after mucosal or systemic administration. // Arch Virol. -2003 (May).- 148(5).-P. 827−39.
Ramshaw I.A. and Ramsay A.J. The Prime-Boost Strategy: exciting prospects for improved vaccination // Immunol Today. 2000. — 21 (4). — 163−165.
Requirement for hepatitis В vaccines made by recombinant DNA techniques in virus vaccine. Strategy of vaccination. // WHO Technical Report Series. 1987. — N.760. — Annex 5.-report N.37.-P.78−106.
Reynolds M.G., Cono J., Curns A. et al. Human monkeypox. Lancet Infect. Dis. -2004 (Oct). — 4 (10). — P. 604−605.
Rock M.T., Yolder S.M., Talbot T.R. et al. Adverse Events after Smallpox Immunizations Are Associated with Alterations in Systemic Cytokine Levels // J Inect Dis. 2004.- 189.-P. 1401−1410.
Rodriguez J.F., Janeczko R., and Esteban M. Isolation and Characterization of Neutralizing Monoclonal Antibodies to Vaccinia Virus. // J. Virol. 1985 (Nov). -56 (2). — P. 482−488.
Sarkar J.K., Mitra A.C., Mukherjee M.K. The minimum protective level of antibodies in smallpox. // Bull. World Health Organ. 1975. — 52. — P. 307−311.
Schlicht H.-J., Schaller H. The secretory core protein of human hepatitis В virus in expressed on the cell surface. // J. Virol. 1989. — 63 (12). — P. 5399−5404.
Schelkunov S.N., Massung R.F. and Esposito J.J. Comparison of genome DNA sequences of Bangladesh-1975 and India-1967 variola viruses. // Virus Res. 1995. — 36. — P. 107−118.
Schelkunov S.N., Totmenin A.V., Safronov P.F. et al. Alastrim smallpox variola minor virus genome DNA sequences. // Virol. 2000. — 266. — P. 361−386.
Schodel F., Enders G., Will H. Expression of hepatitis В virus core T-cell epitopes and pre-S2 B-cell epitope as fusion protein with LT-B in salmonella for oral vaccination. //
Progress in Hepatitis В immunization. Edc P. Coursaget, Ivl.J.Tong. Colloque IN-SERM/Jphn Libbey Eurotext LTD. 1990. — 194. — P.43−50.
Slifka M. K and Hanifin J.M. Smallpox: the basics. // Dermatol. Clin. 2004. — 22. -P. 263−274.
Slifka M.K. Immunological memory to viral infection. Commentary. // Curr Opin Immunol. 2004 (Aug). — 16(4). — P. 443−50.
Slifka M.K. The Future of Smallpox Vaccination: is MVA the key? // Med. Immun. -2005.-4(1).-P. 2−9.
Smith J.L., Mackett M., Moss B. Infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis В virus surface antigen. //Nature. 1983a. — 302. — P. 490−495.
Smith J.L., Moss B. Infectious poxviruses vectors have capacity for at least 25 000 base pairs of foreign DNA // Gene. 1983b — 25 (1). — P.21−28.
Smith S.A. and Kotwal G.J. Immune Response to Poxvirus Infections in various animals. // Critical Reviews in Microbiol. 2002. — 28 (3). — P. 149−185.
Stephan W., Prince A. and Brotman B. Protection of chimpanzees from hepatitis В virus infection after passive immunization with anti-HBe. // J. Virol. 1984. — 51. — P.420−424.
Stickl R. Smallpox Heute in der Welt. Weitslchtig. // Hautnach: Padiatrie. -1991.-3 (6).-P. 19−25.
Strikas R.A., Williams W.W. Immunization against infectious diseases. // South.Med.J. 1990. — 83 (10). — P. 25−30.
Sweitser I.L. Hepatitis-Associated Antigen (Australia antigen) in Mother and Infant. //New. Engl J. Med. 1970. — 283. — P. 570−572.
Takusei U., Hiroshi S. Hepatitis В vaccination.// World Health.- 1989.- Nov.- p. 2425.
Tartaglia J., Perkus M.E., Taylor J. et al. NYVAC: a highly attenuated strain of vaccinia virus.//Virol -1992 (May). -188(1).-P. 217−32.
Tartaglia J., Paoletti E. Live recombinant viral vaccines. // Immunochemistry of viruses II. The basis of serodiagnosis and vaccines. 1990. — Eds. M.H.V.van Regenmortel and Neurath. — P. 125−151.
Terajima M., Cruz J., Raines G. et al. Quantitation of CD8 T Cell Responses to Newly Identified HLA-A 0201-restricted T Cell Epitopes Conserved Among Vaccinia and Variola (Smallpox) Viruses. // J. Exp.Med. 2003 (Apr). -197 (7). — P. 927−932.
Tong M.J. The clinical consequences of perinatal infection of hepatitis В virus. // «Progress in Hepatitis В immunization. Edc P. Coursaget, M.J.Tong. Colloque INSERM // John Libbey Eurotext LTD. 1990. — V.194. — P.3−10.
Tscharke D.C., reading P.C. and Smith G.L. Dermal infection with vaccinia virus reveals roles for virus proteins not seen using other inoculation routes. // J. Gen. Virol. 2002. -83.-P. 1977−1986.
Tscharke D.C., Karupiah G., Zhou J. et al. Identification of poxvirus CD8+ T cell determinants to enable rational design and characterization of smallpox vaccines. // J. E. M. 2005 (Jan).-201 (l).-P. 95−104.
Vento S., Ranieri S., Williams E. et al. Prospective study of cellular immunity to hepatitis В virus antigen from the early incubation phase of acute hepatitis B. // Lancet. -1987.- 1 (8551). P.119−122.
Voegeli C. F. Production and use of smallpox egg vaccine // Int. Symp. On smallpox vaccine Symp. Series immunobiol. standard. Basel-Muenchen-paris-London-new-Iork-Sydney: S. Karger. -1973. 19. — P. 69−73.
Wang Yuan, Li Zai-ping, Han Ya-Rue et al. A subunit vaccine for hepatitis В produced by a recombinant vaccinia virus. // Vaccines 90: Mod. Approaches New Vaccines In-clud. Prev. AIDS. 1989.-1. -P. 187−191.
Wann mub erneut geg-en hepatitis В geimpft werden? // Dtsch. arrtebl. 1992. -89(19).-P.1072.
West D.J. Flexible injection schedule for hepatitis В vaccines-alternatives and implications. // 5th Eur. Congr. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1991. — 32.
Westwood J.C., Harris W.J., Zwartouvv H.T., Titmuss et al. Studies on the structure of vaccinia virus. // J.Gen.Microbiol. 1964. — 34. — P. 67−78.
Whitton JL, Slifka MK, Liu F, Nussbaum AK, Whitmire JK. The regulation and maturation of antiviral immune responses. // Adv. Virus Res. 2004. — 63. — P. 181−238.
Wierzbicki A., Kiszka I., Kaneko H. et al. Immunization strategies to augment oral vaccination with DNA and viral vectors expressing HIV envelope glycoprotein. // Vaccine -2002.-20.-P. 1295−1307.
Xu R., Johnson A.J., Liggitt D. et al. Cellular and Humoral Immunity against Vaccinia Virus Infection in Mice. // J. Immun. 2004. — 172. — P. 6265−6271.
Zhu 0., Duan S., Xu H. A six-year survey of immunogenecity and efficacy of hepatitis В vaccine in infants born to HBsAg carriers. // Chin. Med. J. 1992. — 105 (3). — P. 194 198.
Zavala F., Rodrigues M., Rodrigues D., et al. A Striking Property of Recombinant Poxviryses: Efficient Inducers of in Vivo Expansion of Primed CD8+ T cells. // Virol. -2001.-280.-P. 155−159.1. Утверждаю»
Согласовано" Зам. директора ГИСК ЧчА-< -им. JIj^/Гарасевича uctiCcc/Т.А. Бектимиров «Л-Г 2002 г. 1. ВВЕДЕНИЕ
В ходе доклинического (лабораторно-экспериментального) изучения бивакцины «Ре-вакс ВТ» были показаны ее безвредность, безопасность и иммуногенность, а также соответствие требованиям, предъявляемым к МИБП.
Таблетированная форма вакцины защищена патентом (Патент РФ № 2 076 735 от 23.03.94 г.).
Бивакцина «Ревакс-ВТ» обладает рядом преимуществ как перед накожным прототипом «Ревакс-В», так и перед другими гепатитными вакцинами.
Во-вторых, при проведении даже массовой иммунизации таблетированной формой вакцины не требуется создания асептических условий, использования специальных инструментов и привлечения квалифицированного медперсонала.
В-третьих, при пероральном введении вакцины происходит выраженное формирование иммунитета слизистых, которые при естественных путях передачи вируса гепатита В являются входными воротами инфекции.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель исследования целесообразность последующего изучения бивакцины оспы и гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной, таблетки «Ревакс-ВТ» в Государственных испытаниях.
Задачи исследования а) оценка реактогенных свойств вакцины-б) оценка безопасности вакцины- г) определение иммуногенных свойств вакцины-д) выбор оптимальной дозы вакцины по параметрам иммуногенности, реактогенности и безопасности.3. ИСПЫТУЕМЫЙ ПРЕПАРАТ
Наименование препарата. Бивакцина оспы и гепатита В эмбриональная живая ре-комбинантная, таблетки «Ревакс-ВТ».
ХАРАКТЕРИСТИКА КОНТИНГЕНТА И МЕТОДИКА ИСПЫТАНИЙ
Критерии исключения из исследования
A) Медицинские противопоказания (Приложение 4).
Б) Желание добровольца прекратить свое участие в исследованиях.
B) Несоблюдение добровольцем правил участия в исследованиях.
Д однократная (двукратная — при отсутствии сероконверсии) иммунизация вакциной «Комбиотех» против вирусного гепатита В — не менее 7 человек.
На II этапе эффективность и безопасность выбранной дозы «Ревакс-ВТ» сравнивается соответственно с вакциной «Комбиотех» и неиммуногенной дозой (I этап).
Группы имеют в составе обязательное и дополнительное (в скобках) число привитых, иммунизацию которых проводят при наличии в группе сероконверсии к вирусам гепатита или вакцины у 1 и более из 4 привитых.
При отсутствии сероконверсии по гепатитному компоненту привитые, имеющие иммунный ответ к вирусу вакцины будут привиты однократно вакциной «Комбиотех» против вирусного гепатита В.1. Методика иммунизации:
Иммунизация вакциной «Комбиотех» проводится по инструкции по ее применению.
Слабые повышение температуры тела до 37,5° С включительно-
Средние повышение температуры тела от 37,6 до 39,0° С включительно-
Сильные повышение температуры тела свыше 39,0° С.
Методы и сроки клинического и лабораторно-инструменталыюго обследования привитых бивакциной «Ревакс-ВТ"п/п Метод исследования Сроки обследования сутки месяцы0 7 14 21 28 3 6
Термометрия 2 раза в сутки 1 ежедневно 22 дня
Вирусологическое исследование слюны, мочи, кала5 Крови ежедневно 14 суток- + + + +
Регистрация артериального давления, пульса1 + + + + +
Аускультация сердца и легких1 + + + + +
Электрокардиография + +
Общий анализ мочи1: плотность, рН, белок, эритроциты, лейкоциты, соли + + + + +
Общий анализ крови1: эритроциты, гемоглобин, цветной показатель, лейкоциты, ПЯН, СЯН, эо-зинофилы, базофилы, моноциты, СОЭ, тромбоциты + + + + +
Биохимический анализ крови1: общий белок- альбумины- глобулины: А/Г индекс- ACT- AJIT- креатинкиназа2- глюкоза, мочевина- билирубин- ГГТП- протромбиновый индекс- фибриноген, холестерин, HDL-холестерол, триглицериды, С-реактивный белок + + + + +
Иммунологическое исследование крови: IgA- IgM- IgG- Т-лимфоциты: В-лимфоциты, лизоцим + + + + + + +
ИФА на маркеры вируса гепатита В +
ИФА на антитела к HbsAg + + + + + + +
Реакция нейтрализации с ВВ4 + + + + + + +
Метод оценки активности ГЗТ-эффекторов к HBsAg4 + + + +
Метод оценки активности ГЗТ-эффекторов к ВВ4 + + + +
Осмотр терапевта и сравнительный анализ заболеваемости по диспансерным карточкам + + + + + + +
Осмотр невропатолога1 + + +17 Осмотр стоматолога +
Осмотр оториноларинголога +17 Гастроскопия и УЗИ^
Примечания: 1 далее по необходимости (возможности), 2 по показаниям, 3 проводится в период с 4 по 7 сутки ежедневно, 4 кровь (3−5 мл) для анализов берут из вены, 5 при нарушениях со стороны пищеварительного тракта проводят бактериологическое обследование
ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ АКТИВНОСТИ
УЧРЕЖДЕНИЯ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ИСПЫТАНИЯХ ГНЦ ВБ «Вектор», Вирусологический центр НИИМ МО РФ, ГИСК им JI.A. Тарасеви-ча, Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН.
СРОКИ ПРОВЕДЕНИЯ ИСПЫТАНИЙ
Испытания проводятся в 2002—2003 гг. при условии их своевременного финансирования (при задержке сроки соответственно увеличиваются).

Заполнить форму текущей работой