Изучение элементов «скрытого» метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

актуальность проблемы.

Всем ферментам в той или иной степени присуще наличие альтернативных субстратов. Именно это свойство определяет гибкость метаболических путей и обеспечивает замечательную приспособляемость микроорганизмов к изменяющимся условиям роста. Зачастую в новых условиях могут возникать целые альтернативные метаболические пути, так называемые пути «скрытого» метаболизма, которые обусловливают способность клеток к утилизации новых источников питания или к катаболизму токсичных агентов экзогенного или эндогенного происхождения [1]. Изучение таких путей становится особенно актуальным при создании на основе микроорганизмов штаммов-продуцентов различных метаболитов, в частности, аминокислот. Стандартным подходом в такой работе является усиление метаболических потоков, приводящих к синтезу целевого продукта, и блокирование «ненужных» путей. Это достигается путем увеличения или уменьшения экспрессии соответствующих генов, что может приводить к внутриклеточному накоплению интермедиатов биосинтеза. В результате чего могут включаться «скрытые» метаболические пути, катаболизирующие эти интермедиаты, причем соответствующие метаболические потоки могут быть весьма значительными, что может отрицательно сказаться на выходе целевого продукта и приводить к накоплению примесей.

Мы столкнулись с явлением «скрытого» метаболизма при конструировании на основе Escherichia coli штамма-продуцента изолейцина. Известно, что изолейцин образуется из треонина (Рис. 1.1), поэтому при создании штамма-продуцента изолейцина необходимо в первую очередь усилить биосинтез треонина и блокировать его деградацию. Кроме того, для эффективной конверсии треонина в изолейцин очень важно подобрать оптимальный уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза изолейцинабиосинтетической треониндезаминазы (IlvA), осуществляющей превращение треонина в 2-кетобутират, и синтаз ацетогидроксикислот (AH AS), которые катализируют конденсацию 2-кетобутирата с пируватом с образованием 2-ацето-2-гидроксибутиратапредшественника изолейцина.

При создании штамма-продуцента изолейцина мы обнаружили, что усиление синтеза треонина в ряде случаев приводило к резкому снижению уровня синтеза изолейцина и накоплению в среде значительного количества пропионата. Мы предположили, что это явление связано главным образом с деградацией треонина, поэтому основной задачей работы стало изучение ранее неизвестных путей аэробной деградации треонина. транспорт из клетки включение в белки.

2-аминоTdh.

3-кетобутират f КоА НАДН НАД+ Ч.

TdcB.

КЫ.

IlvA ацетил-КоА.

L-глицин у—L-треонин —^ -ч^ f NH3 рпв.

Ч NH3 TdcE 9.

AHAS Г КоА С02.

1*4 со,.

2-кетобутират ч.

КоА.

2-кетобутират пируват.

НСООН пропионил-КоА Рн ч анаэробные условия.

Pta.

2-ацето-2-гидрокси-бутират.

I I I.

L-изолейцин.

КоА пропионилфосфат АДФ АТФ пропионат.

АскА TdcD.

Рис. 1.1. Метаболизм L-треонина в Е. coli.

Tdh — треониндегидрогеназа, КЫ — 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза, IlvA треониндезаминаза (биосинтетическая), AHAS — сингазы ацетогидроксикислотTdcBтреониндезаминаза (катаболитная), PflB — пируватформиатлиаза, TdcE — 2-кетобутират-формиатлиаза, Pta — фосфотрансацетилаза, AckA, TdcD — пропионаткиназы.

К настоящему времени в клетках Е. coli охарактеризованы два пути катаболизма треонина — превращение треонина в глицин, в котором участвуют треониндегидрогеназа (Tdh) и 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза (КЫ) [2], и анаэробная деградация до пропионата [3] (Рис. 1.1). Показано, что на первом этапе анаэробного пути деградации треонин превращается в 2-кетобутират под действием биодеградативной треониндезаминазы (TdcB). Затем 2-кетобутират неокислительно декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА фомиатлиазами кетокислот PflB и TdcE, которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях. В дальнейшем превращении пропионил-КоА в пропионат через пропионилфосфат принимают участие фосфотрансацетилаза (Pta) и пропионаткиназы — TdcD и АскА. Другие пути деградации треонина в клетках Е. coli к настоящему времени не охарактеризованы. цели и задачи работы.

Данная работа является продолжением исследований, проводимых в ЗАО «АГРИ» и направленных на конструирование высокоэффективных штаммов-продуцентов треонина и изолейцина. Основной целью настоящей работы являлось изучение путей аэробного метаболизма треонина в клетках Е. coli, связанных с образованием 2-кетобутирата.

В процессе работы решались следующие задачи:

— изучение путей аэробной деградации треонина в клетках Е. coli идентификация ферментов, участвующих в аэробной деградации треонина в клетках Е. coli создание коллекции генетических конструкций, несущих гены, кодирующие изоферменты синтаз ацетогидроксикислот (AHAS) из Е. coli и Methylophilis methylotrophus для дальнейшего применения при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислотисследование роли ферментов биосинтеза лейцина в образовании неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из 2-кетобутирата;

— изучение возможности сверхсинтеза норвалина и норлейцина в Е. coli. научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе изучена аэробная деградация L-треонина, однородно меченного изотопами 14С и 13С, в модельном штамме Е. coli ITP290−3. Этот штамм накапливает треонин в отсутствие экспрессии гена ilvAIleR, кодирующего биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию, и изолейцин в условиях экспрессии гена ilvAIleR. Показано, что в клетках Е. coli в аэробных условиях происходит деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират в случае, когда треонин эффективно дезаминируется треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию, с образованием 2-кетобутирата. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным.

Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е. coli и М. methylotrophus. Получены варианты оперона ilvG603M и ilvBN Е. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией. Полученные конструкции в дальнейшем могут применяться при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот.

Получен штамм Е. coli с делениями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы с выходом 8%. На примере данного штамма подтвержден предполагаемый механизм образования норвалина и норлейцина в клетках Е. coli из 2-кетобутирата или пирувата ферментами пути биосинтеза лейцина.

выводы.

1. Изучена аэробная деградация треонина, однородно меченного изотопами 14С и 13С, в штамме Е. coli ITP290−3 с контролируемой экспрессией устойчивой к ретроингибированию треониндезаминазы. Обнаружено, что при сверхэкспрессии данного фермента в аэробных условиях в клетках Е. coli происходит превращение 2-кетобутирата, образовавшегося из треонина, в пропионат и 2-аминобутират.

2. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата не является значительным.

3. Создана коллекция генетических конструкций, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е. coli и М. methylotrophus. Получены варианты оперонов ilvG603M и ilvBN Е. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией.

4. Показано, что в клетках Е. coli с блокированной функцией синтаз ацетогидроксикислот в условиях дерепрессии генов биосинтеза лейцина происходит утилизация 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина, что приводит к образованию' неканонических аминокислот норвалина и норлейцина.

5. Получен штамм Е. coli, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы. Данный штамм можно рассматривать как потенциальный продуцент норвалина и норлейцина.