Исследование факторов, определяющих длительную потенциацию N-метил-D-аспартат зависимого компонента возбуждающего постсинаптического потенциала в CA1 области гиппокампа крыс

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Обучение и память являются важнейшими функциями мозга, полноценная реализация которых обеспечивает адаптацию и выживание организма в постоянно менящихся условиях внешней среды.

В основе механизмов обучения и памяти лежит пластичность синаптического аппарата нейронов. Наиболее широко распространенным типом синапсов центральной нервной системы являются глутаматные синапсы, эти синапсы представлены в таких областях, как новая кора головного мозга, гиппокамп, полосатое тело, гипоталамус. Нисходящие глутаматергические пути обнаружены практически во всех структурах головного мозга, проекции которых идут от коры к подкорковым структурам (Ашмарин с соавт. 1999). Ключевую роль в процессах памяти и обучения играет гиппокамп (Виноградова 1975). Как отмечалось (Магазаник с соавт. 1997), «гиппокамп является излюбленным и благодарным объектом для исследования возбуждающих и тормозных влияний, а также механизмов долговременной пластичности». Возбуждающие влияния в гиппокампе передаются через рецепторы глутамата. Выброс глутамата из пресинаптической терминалы приводит к активации нескольких типов ионотропных (управляющих ионными каналами) и мегаботропных (возбуждающих системы вторичных мессенджеров) рецепторов, находящихся на мембране постсинаптического нейрона (Nakanishi et al. 1998). Активация ионотропных рецепторов приводит к генерации в постсинаптическом нейроне возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП). В соответствии с различием физических свойств и роли в процессе передачи нервного импульса, ионотропные рецепторы разделяют на две основные группы (Collingridge and Singer 1991; Headley and Grillner 1991), названных по соответсвующим синтетическим селективным агонистам а-амино-З-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоте (АМПА рецепторы), каинату (каинатные рецепторы) и Н-метил-Д-аспартату (НМДА рецепторы) (Watkins et al. 1991). АМПА и каинатные рецепторы в связи с отсутствие существенных различий объединяют в группу АМПА рецепторов. АМПА рецепторы, имеющие быструю кинетику и связанные с каналами, проницаемы для ионов Na+ и К+. Основная роль этих рецепторов состоит в передаче через синаптическое соединение нервного импульса, поскольку при их активации возникает быстрый ВПСП (АМПА-ВПСП), составляющий в нормальных условиях в пирамидных нейронах области СА1 гиппокампа основную часть (около 98% площади) суммарного ВПСП (Collingridge et al. 1983). Другая группа ионотропных рецепторов, так называемые НМДА-рецепторы, связаны с каналами, проницаемыми не только для ионов Na+ и К+, но и Са2+ (Krebs 1992; MacDermott et al. 1986; Monyer et al. 1994; Moriyoshi et al. 1991), проницаемость для Ca2+ в 70 раз выше, чем для Na+ (Mayer and Miller 1991). Вход в постсинаптический нейрон кальция, являющегося одним из основных вторичных посредников, активирует ряд внутриклеточных процессов, направленных на изменение эффективности синаптической передачи. Синаптическая пластичность, связанная с активацией НМДА-рецепторов, играет важную роль в процессах обучения и памяти, в развитии нервной системы, а также лежит в основе ряда паталогических процессов, приводящих к нарушению обучения и памяти (Cain 1997; McEachern and Shaw 1996).

Одним из видов экспериментально вызываемой синаптической пластичности, используемой для изучения клеточных основ обучения и памяти, является длительная потенциация (ДП) (Воронин 1982; Клещевников 1998; Bliss and Lomo 1973; Bliss and Collingridge 1993). Многолетние исследования, начатые после открытия этого феномена в гиппокампальных структурах (Брагин и Виноградова 1973; Воронин и др. 1974; Bliss and Lomo 1973), позволили выявить основные механизмы вызова ДП, включая важную роль рецепторов НМДА типа (Perkel et al. 1993). Синаптическая пластичность этого вида может лежать также в основе ряда паталогических процессов в нервной системе, приводящих к нарушению функций обучения и памяти (Bliss and Collingridge 1993; McEachern and Shaw 1996). Посттетаническая ДП состоит в длительном увеличении эффективности синаптической передачи после кратковременной интенсивной активации (тетанизации) афферентных волокон. Различают два этапа в развитии ДП — индукцию и поддержание. В области СА1 гиппокампа индукция ДП определяется активацией НМДА-рецепторов и не зависит от возбуждения рецепторов АМПА и каинатного типов (Bliss and Collingridge 1993). Поддержание ДП, напротив, определяется в основном увеличением АМПА-зависимого компонента ВПСП, поскольку в нормальных условиях он составляет основную часть суммарного ВПСП. Вопрос об участии в поддержании ДП НМДА-рецепторов, несмотря на их незначительный вклад в ВПСП на одиночный стимул, имеет принципиальное значение. Решение этого вопроса важно, в частности, для выявления локализации механизмов ДП, поскольку другие подходы (применение квантового анализа, изучение окклюзии ДП с пресинаптически локализованной парной фасилитацией) дают противоречивые результаты (Воронин 1982; Kleschevnikov et al.

1997; Kullmann 1994; Voronin 1994). Преи пост-синаптическая гипотезы локализации ДП приводят к разным предсказаниям относительно сходства/различия величины ДП АМПАи НМДА-ВПСП (Kullmann 1994). В случае пресинаптической локализации механизмов ДП (увеличение выброса медиатора) оба компонента ВПСП должны увеличиваться после тетанизации одинаковым образом. Если же механизмы ДП локализованы постсинаптически (то есть связаны с изменением чувствительности рецепторов или их количества), характер изменения АМПАи НМДАВПСП скорее всего будет различным. Еще одной причиной для изучения механизмов длительной потенциации НМДА-ВПСП является их возможная связь с паталогическими процессами, вызываемыми действием аноксии, эпилепсии и других факторов, в основе которых лежит гиперактивация НМДА-рецепторов (Crepel et al. 1993; Li et al. 1996; Mody et al. 1992). Возможно, что повышение эффективности НМДА рецепторов в результате кратковременного аноксического воздействия служит причиной перевозбуждения и отсроченной пост-аноксической гибели пирамидных нейронов области СА1.

Сравнение величин АМПА и НМДА-компонентов удобно проводить на так называемых «двухкомпонентных» ВПСП, вклад в которые АМПАи НМДА-зависимых компонентов сравним по величине (Asztely et al. 1992; O’Connor et al. 1995; Xiao et al. 1995; Xiao et al. 1996). Величина АМПА-компонента при этом оценивается по величине начального наклона «двухкомпонентного» ВПСП, а НМДА-компонента по амплитуде ответа при латентности, большей чем латентность АМПА-компонента (в диапозоне от 20 до 100 мс) (Xiao et al. 1995). Для получения «двухкомпонентных» ВПСП вклад НМДА-ВПСП увеличивают путем понижения внеклеточной концентрации магния (O'Connor et al. 1995). Иногда, для уменьшения вклада АМПА-ВПСП в раствор добавляют небольшую концентрацию антагонистов АМПА-рецепторов (Xiao et al. 1995).

Многочисленые экспериментальные данные об участии НМДА компонента ВПСП в поддержании ДП, полученные в ряде нейрофизиологических лабораторий мира не всегда были однозначны: так, в СА1 области вклад НМДА рецепторов в поддержание ДП может быть меньше (Kauer et al. 1988; Muller and Lynch 1990; O’Connor et al. 1994; Durant et al. 1996), выше (Clark et al. 1993; Aniksztein and Ben Ari 1995) или равным (Clark and Collingridge 1995; O’Connor et al. 1995; Xiao et al. 1996) no отношению к вкладу АМПА рецепторов. Такая вариабельность экспериментальных данных предполагает, что результаты могут зависеть от многих физиологических и главным образом методологических факторов, которые различаются у разных исследователей. Изучение пластичности НМДА компонента ВПСП осложняется трудностями его наблюдения и связаннного с этим отсутствия единых общепринятых методик его измерения.

Недостатком ранних работ (Kauer et al. 1988; Kullman 1994; Muller et al. 1989), являлось то, что в них регистрировались ответы, вызываемые активацией большого числа афферентных волокон. Действительно, соотношение количества рецепторов разного типа в разных синапсах варьирует, также как и величина ДП, что может привести к различиям в потенциации АМПА и НМДА компонент суммарных ответов даже при равной потенциации обоих компонентов в отдельных синапсах (Клещевников 1998). Более того, применявшиеся методы не позволяли достаточно точно измерять отдельные компоненты. В ряде работ регистрировались минимальные ВПСТ, вызываемые активацией ограниченного количества пресинаптических волокон (Durand et al. 1996; Isaac et al. 1995; Liao et al. 1995; Malenka andNicoll 1999), однако имелись другие недостатки. В частности, использовалась высокая частота тестирования, например, 1−1,6 Гц (Isaac et al. 1995; Liao et al. 1995), которая могла приводить к депрессии выброса передатчика (Gasparini et al. 2000), или использовались крысы первых дней онтогенеза (Durand et al. 1996), в которых такая депрессия особенно хорошо выражена (Gasparini et al. 2000). В этих работах (Durand et al. 1996; Isaac et al. 1995; Liao et al. 1995) исследовалась не «стандартная» ДП, вызываемая афферентной тетанизацией, а потенциация, вызывавшаяся сочетанием низкочастотной афферентной активации с искусственной постсинаптической деполяризацией. Более того, потенциация наблюдалась в течение короткого времени (до 5 мин, реже до 20−30 мин) после ее вызова. Измерение АМПА и НМДА компонентов производилось не параллельно, а при разных уровнях мембранного потенциала, что могло существенно влиять на полученные результаты.

Таким образом, в настоящее время в литературе нет однозначных результатов, объясняющих поведение НМДА компонента ВПСП: во-первых, при вызове ДПво-вторых при заболеваниях, связанных с перевозбуждением НМДА рецепторов.

Актуальность изучения поведения НМДА компонента ВПСП в процессе поддержания ДП определили постановку следующих цели и задач.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Целью исследования являлось выяснение основных факторов, определяющих величину долговременной посттетанической потенциации НМДА зависимого компонента ВПСП в области СА1 гиппокампа.

В этой связи были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способы измерения величины НМДА компонента ВПСП в составе «двухкомпонентного» вызванного ответа;

2. Изучить влияние торможения, опосредованного рецепторами гамма-аминомасляной кислоты проницаемыми для ионов хлора (ГАМКа), на степень выраженности и ДП НМДА компонента ВПСП;

3. Сравнить характеристики ДП НМДА и АМПА компонентов ВПСП в фокальных ответах в СА1 области гиппокампа, включая зависимость величины ДП этих компонентов от функциональной активности ГАМКа опосредованного торможения и силы активации афферентных волокон;

4. Сравнить характеристики ДП НМДА и АМПА компонентов в минимальных (генерируемых активацией отдельных синапсов) ВПСТ. Данная задача предполагает выяснение вопросов:

• локализованы ли НМДА и АМПА компоненты ВПСТ в одних и тех же синапсах;

• различается ли степень ДП АМПА и НМДА компонентов в случае генерации соответствующих им токов в одних и тех же синапсах.

НАУЧНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Величина потенциации НМДА компонента фокальных ответов и не-минимальных ВПСП в области СА1 гиппокампа определяется потенциацией синапсов локальных возбуждающих путей.

2. На уровне отдельных синапсов величина ДП АМПА и НМДА компонентов различается лишь в начальный период после тетанизации (до 15 мин) и не различается в более поздние периоды.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

1. Разработан способ одновременного измерения величин НМДА и АМПА компонентов ВПСП в составе «двухкомпонентных» гиппокампальных ответов.

2. Показано, что для адекватного измерения НМДА компонента ВПСП в условиях частичного подавления АМПА рецепторов требуется полное выключение быстрого торможения селективными антагонистами ГАМКа рецепторов.

3. Показано, что относительная величина потенциации АМПА и НМДА компонентов вызванных гиппокампальных ответов в СА1 области определяется силой афферентных стимулов во время тетанизации: использование низкой силы стмуляции во время тетанизации приводит к преимущественной потенциации АМПА компонента, тогда как при высокой силе стимуляции во время тетанизации благоприятствуют потенциации НМДА компонента ВПСП.

4. Впервые изучено изменение АМПА и НМДА ответов на уровне ограниченного количества синапсов при вызове минимальных ответов клеток СА1 области гиппокампа. Показано, что в случае ко-локализации АМПА и НМДА рецепторов, выражающейся в значительной корреляции между амплитудами АМПА и НМДА компонентов в ответах на одиночные стимулы, величина ДП этих компонентов не различается. Однако, на ранней фазе развития ДП (до 15 мин) величина роста АМПА компонента превосходит увеличение НМДА компонента.

Для объяснения результатов экспериментов предложена гипотеза, согласно которой величина ДП НМДА компонента ВПСП в области СА1 гиппокампа определяется в основном потенциацией синапсов локальных возбуждающих путей, содержащих значительное количество НМДА рецепторов, тогда как потенциация АМПА компонента зависит в основном от потенциации синапсов колатерально-комиссурального входа. На уровне одного синапса степень ДП АМПА и НМДА компонентов ВПСП различается в течение первых 15 мин после тетанизации и не различается в более поздние периоды.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Результаты данной работы разрешили одно из существовавших в литературе противоречий, касающихся способности НМДА компонента ВПСП к пластическим изменениям. Предложенная гипотеза о потенциации синапсов локальных возбуждающих путей как основной причине роста НМДА компонента ВПСП способна и.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глутаматергическая передача и глутаматные рецепторы.

Ключевым звеном для передачи нервного сигнала от нейрона к нейрону является синаптический аппарат нейронов. В ходе эволюции на первый план выходят химические синапсы, в которых передача электрического сигнала между нейронами опосредуется химическим агентом, нейромедиатором.

Учитывая тот факт, что основным возбуждающим нейропередатчиком в синапсах ЦНС является глутамат, представляется необходимым детальное изучение глутаматергической передачи нервного сигнала. Глутаматергические пути широко представлены в областях мозга, обеспечивающих высшие функции, такие как обучение, память, внимание, управление тонкими произвольными движениями и т. п. Так, в новой коре, гиппокампе, зубчатой фасции, мозжечке и некоторых других областях глутаматергические синапсы составляют подавляющее большинство от общего количества химических контактов между нейронами.

По химической природе глутамат представляет собой аминокислоту. Глутамат обнаруживается во всех отделах ЦНС, очевидно, благодаря тому, что он является не только нейромедиатором, но и предшественником других аминокислот. Тела глутаматергических нейронов находятся в коре больших полушарий, обонятельных луковицах, гиппокампе, черной субстанции, мозжечке, сетчатке. Глутаматергические синапсы существуют в миндалине, стриатуме, на клетках-зернах мозжечка. В спинном мозге глутамат сосредоточен в первичных афферентных волокнах дорсальных корешков. Обнаруживается он также в нервно-мышечных синапсах ракообразных и насекомых.

Выброс глутамата из пресинаптической терминали приводит к активации нескольких типов ионотропных (управляющих ионными каналами) и метаботропных (возбуждающих системы вторичных мессенджеров) рецепторов, находящихся на мембране постсинаптического нейрона. Активация ионотропных рецепторов приводит к генерации в постсинаптическом нейроне возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП). В соответствии с различием физических свойств и роли в процессе передачи нервного импульса, ионотропные рецепторы можно разделить на две основные группы (Bochet and Rossier 1993; Collingridge et al. 1991; Headley et al. 1991), АМПА и НМДА рецепторы. Они названы, как указывалось выше, по.

Двукомпонентный ВПСП.

Рис. 1. Схема поперечного среза гиппокама и глутаматного синапса.

А — Поперечный срез гиппокампа с постановкой регистрирующего (Ol) и стимулирующего (С1) электродов. СА1, САЗ, ЗФ — области гиппокампа. Между СА1 и САЗ областями произведена перерезка для предотвращения возникновения полисинаптических ответов от САЗ области. Б — Схема глутаматного синапса. Выброс глутамата из пресинаптической терминали приводит к активации двух типов ионотропных рецепторов, находящихся на мембране постсинаптического нейрона, названных по соответствующим агонистам альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоте (АМПА) и Ы-метил-Б-аспартату (НМДА). АМПА рецепторы опосредуют «быстрый» ВПСП (АМПА-ВПСП), НМДА рецепторы опосредую «медленный» ВПСП (НМДА-ВПСП). При суммации АМПАи НМДА-ВПСП возникает двухкомпонентный ВПСП. АМПА-ВПСП вносит основной вклад в передний фронт, а НМДА-ВПСП в задний фронт двухкомпонентного ВПСП.

НМДА рецепторы и их свойства.

НМДА рецепторы и их роль в норме и патологии.

Вход в постсинаптический нейрон кальция активирует ряд внутриклеточных процессов, направленных на изменение эффективности синаптической передачи. Дисфункции глутаматергической передачи по данным обзора Doble A. (Doble 1995) могут приводит к лизису нервных клеток, играть ключевую роль при болезни Паркинсона, хорее Гентингтона, амиотрофическом боковом склерозе, гипогликемии, эпилепсии, хроническом болевом синдроме, алкогольной интоксикации и абстинентном синдроме, болезни Альцгеймера, а так же при энцефалопатии, вызванной СПИДом. Гиперактивация НМДА рецепторов приводит к не контролируемому повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция и в конечном счете обусловливает смерть нейронов. Подобный токсический эффект может наблюдатся при мозговых травмах, вирусных энцефалопатиях. Wikinski S.I.h Acosta G.B. (Wikinski and Acosta 1995) указывают так же на то, что глутамат может играть токсическую роль при ишемии. Они, кроме этого, предполагают, что наряду с нарушением дофаминергической передачи при шизофрении нарушается и глутаматергическая передача. Так же по мнению Antkiewicz-Michaluk. L (Antkiewicz-Michaluk 1995), чрезмерный вход кальция через NMDA рецепторы может быть важен в этиологии многих других психических растройств. Кроме того глутаматная цитотоксичность может проявляться не только через НМДА рецепторы, но так же и не-НМДА рецепторами. Показано, что при использовании селективных антагонистов НМДА и не — НМДА рецепторов глутаматная цитотоксичность опосредована обоими типами рецепторов, как НМДА, так и не-НМДА типа (Schousboe et al. 1994). Данные Meldrum B.S. (Meldrum 1992) также подтверждают, что оба типа рецепторов могут провоцировать цитотоксичность при чрезмерной активации этих рецепторов. Блокада селективными антагонистами обоих типов рецепторов при гипервозбуждении может иметь клиническое значение при эпилепсии, болезни Паркинсона, мозговой ишемии и травме, синдроме приобретенного иммунодефицита, энцефалопатии. По некоторым данным (Wikinski and Acosta 1995) предотвращение каскада событий, вызывающего нейротоксичность, может быть достигнуто НМДА антагонистами, но как только каскад запускается, он может быть прерван только удалением Са2+ из среды, с помощью нифедипина или при блокаде АМРА рецепторов селективным антагонистом.

CNQX. Для того, чтобы производить адекватное терапевтическое вмешательство при вышеуказанных патологиях или в норме для повышения эффективности обучения и запоминания, необходимо четко представлять степень вовлечения АМПА и НМДА компонентов в процесс синаптической пластичности.

Свойства НМДА рецепторов.

Предполагается, что НМДА рецептор представляет собой тетрамермолекулярный комплекс (Hollmann and Heinemann 1994; Williams 1993), состоящий из двух субъединиц типа NR1 и двух субъединиц типа NR2 (Корке et al. 1993; Mori and Mishina 1995; Omkumar et al. 1996; Pujic et al. 1993; Scatton 1993; Seeburg 1993; Sheng et al. 1994; Sommer and Seeburg 1992). По данным Li M (Li et al. 1998) возможно, что НМДА рецептор может состоять и из большего количества субъединиц. Данные иммуноцитохимических исследований показывают, что NR1 и NR2A/B преимущественно представлены на дендритах и дендритных шипиках (Aoki et al. 1994; Conti and Minelli 1996; Huntley et al. 1994). Присутствие в молекулярном комплексе субъединиц NR1 принципиально важно, поскольку именно на них находятся место связывания агониста и и они образуют трансмембранный домен, формирующий ионный канал (Meguro et al. 1992; Thomas et al. 1994). Субъединицы NR2 играют вспомогательную роль и служат в основном для модуляции чувствительности к агонисту и проводимости канала (Ishii et al. 1993; Krupp et al. 1996; Krupp et al. 1998).

В процессе онтогенеза наблюдается значительные изменения субъединичного состава НМДА рецепторов, вплоть до появления / исчезновения некоторых субъединиц, (Pujic et al. 1993; Flint et al. 1997; Stocca and Yicini 1998).

Пирамидные нейроны гиппокампа и неокортекса, гранулярные клетки зубчатой фасции, нейроны амигдалы, а также культуры клеток этих областей мозга содержат в основном рецепторы NR1/NR2А и NR1/NR2B. Гиппокамп содержит, по-видимому, больше субъединиц NR2B, чем NR2A, поскольку рекомбинантные рецепторы с субъединицей NR2B ближе по своим свойствам (чувствительность к глицину) к нативным рецепторам в области СА1 и ЗФ (Stern et al. 1992). Субъединица NR2C не выявляется в гиппокампе взрослых животных, однако присутствует у крыс в значительном количестве во время второй постнатальяой недели (Pollard et al. 1993).

Существует несколько регуляторных мест, воздействие на которые изменяет эффективность рецепторов. Основными среди них являются места связывания: 1) агониста- 2) глицина (Johnson and Ascher 1992) — 3) ионов Zn2+ (Christine and Choi 1990;

Xie et al. 1993) — 4) фенциклидина (Lodge and Johnson 1991) — 5) ионов Mg2+ внутри канала (Morrisett et al. 1990; Nowak et al. 1984; Wang and MacDonald 1995) — 6) редоксместа (Gozlan and Ben-Ari 1995) — 7) ионов H+ (Saybasili 1998, Traynelis et al. 1995) — 8) полиамина (Johnson 1996).

Роль НМДА рецепторов в индукции синаптической пластичности.

Синаптическая пластичность, связанная с активацией НМДА-рецепторов, играет важную роль в процессах обучения и памяти, в развитии нервной системы, а также лежит в основе ряда патологических процессов, приводящих к нарушению обучения и памяти (Cain et al. 1996). Длительная потенциация (ДП) является одним из видов экспериментально вызываемой синаптической пластичности, используемой для изучения клеточных основ обучения и памяти (Воронин 1982; Клещевников 1998; Bliss and Lomo 1973; Bliss and Collingridge 1993), а также ряда патологических процессов в нервной системе (Bliss and Collingridge 1993; McEachern et al. 1996). Посттетаническая, т. е. вызванная высокочастотной стимуляцией, ДП состоит в длительном увеличении эффективности синаптической передачи после кратковременной интенсивной активации (тетанизации) афферентных волокон. Различают два этапа в развитии ДПиндукцию и поддержание. В области СА1 гиппокампа индукция ДП определяется активацией НМДА-рецепторов и не зависит от возбуждения рецепторов АМПА и каинатного типов (Bliss and Collingridge 1993). Поддержание ДП, напротив, определяется в основном увеличением АМПА-зависимого компонента ВПСП, поскольку в нормальных условиях он составляет основную часть суммарного ВПСП. Вопрос об участии в поддержании ДП НМДА-рецепторов, несмотря на их незначительный вклад в ВПСП на одиночный стимул, имеет принципиальное значение. Решение этого вопроса важно, в частности, для выявления локализации механизмов ДП, так как другие подходы (применение квантового анализа, изучение окклюзии ДП с пресинаптически локализованной парной фасилитацией) дают противоречивые результаты (Воронин 1982; Kleschevnikov et al. 1997; Kullmann 1994; Voronin 1994). Преи пост-синаптическая гипотезы локализации ДП приводят к разным предсказаниям относительно сходства/различия величины ДП АМПАи НМДА-ВПСП (Kullmann 1994). В случае пресинаптической локализации механизмов ДП (увеличение выброса медиатора) оба компонента ВПСП должны увеличиваться после тетанизации одинаковым образом. При условии, что механизмы ДП локализованы постсинаптически (то есть связаны с изменением чувствительности рецепторов или их количества), характер изменения АМПАи НМДАВПСП скорее всего будет различным. Еще одной причиной для изучения механизмов длительной потенциации НМДА-ВПСП является, как указывалось выше, их возможная связь с патологическими процессами, вызываемыми действием аноксии, эпилепсии и других факторов, в основе которых лежит гиперактивация НМДА-рецепторов (Crepel et al. 1993аCrepel et al. 1993bLi et al. 1996; Mody et al. 1992).

Участие НМДА рецепторов в поддержании пластических перестроек.

Как отмечалось ранее, активация НМДА рецепторов принципиально важна для индукции ДП. Тогда как вопрос о вкладе этих рецепторов в поддержание ДП остается открытым и является предметом интенсивных исследований. Важность этого вопроса объясняется несколькими факторами. Во-первых, многочисленные экспериментальные данные показывают, что НМДА-чувствительные рецепторы глутамата и связанные с ними в едином молекулярном комплексе ионные каналы играют принципиально важную роль в процессах синаптической пластичности как во время развития животного, так и при обучении и формировании памятного следа (Bliss and Collingridge 1993). Во-вторых, чрезмерная активация НМДА-рецепторов является одной из основных причин развития патологий, приводящих к нарушению процессов обучения/памяти (Olverman et al. 1989; Choi 1988).

Потенциация НМДА-компонента ВПСП в «нормальных» условиях.

В первых экспериментах по изучению вклада НМДА-ВПСП в процесс поддержания ДП тетанизацию проводили в условиях, при которых вклад НМДА-компонента в ВПСП не был искусственно увеличен. Результаты незначительно варьировали в зависимости от способа измерения величины этого вклада. При измерениях с использованием фармакологической изоляции НМДА-ВПСП до и после тетанизации, величина НМДА-компонента не изменялась в результате тетанизации, вызывавшей значительную потенциацию АМПА-компонента (Kauer et al. 1988; Muller et al. 1988). В некоторых случаях тетанизация приводила даже к уменьшению НМДА-ВПСП (Bernard et al. 1995; Muller et al. 1989). При нахождении НМДА-ВПСП по разнице ответов до и после аппликации антагонистов НМДА-рецепторов обнаружено, что его величина была больше после тетанизации, однако в значительно меньшей степени, чем величина АМПА-компонента (например, ДП НМДА и АМПА-ВПСП составляла соответственно 15% и 65%) (Muller et al. 1990; Muller et al. 1992). Эти данные были подтверждены позднее в работах других авторов и при других способах измерения величины НМДА-компонента. Так, при использовании метода фиксации потенциала клетки и определении величины НМДА-ВПСП путем деполяризации нейрона до +40 мВ, индукция ДП путем сочетания низкочастотной афферентной активации с постсинаптической деполяризацией приводила к появлению АМПА-ВПСП в синапсах, имевших до тетанизации лишь НМДА-компонентвеличина НМДА-ВПСП при этом не изменялась (Durand et al. 1996; Isaac et al. 1995; Liao et al. 1995). По мнению авторов это свидетельствует о появлении функционально активных АМПА рецепторов в синапсах, содержавших до тетанизации лишь активные НМДА-рецепторы. Неизменность НМДА-ВПСП наблюдалась также после вызова ДП АМПА-компонента в латеральном пучке перфорантного входа в зубчатую фасцию (Wang et al. 1996). Величину АМПАи НМДА-ВПСП оценивали в этом случае без применения фармакологических блокаторов путем аппроксимации нисходящего фронта ВПСТ двумя экспонентами. После тетанизации коэффициент экспоненты, соответствующий амплитуде более быстрого ответа, увеличивался, в то время как коэффициент экспоненты более медленного ответа и временные константы экспонент не изменялись (Wang et al. 1996).

Процесс поддержания ДП основан, по-видимому, на нескольких различных механизмах (Bliss and Collingridge 1993; Gozlan et al. 1995; Voronin et al. 1995). Можно предположить, что некоторые из этих механизмов связаны с изменением НМДА-ВПСП, в то время как другие не зависят от него. Поскольку вклад различных механизмов определяется, по-видимому, способом вызова ДП, вклад механизмов, связанных с изменением НМДА-ВПСП будет зависеть, в числе прочего, и от параметров афферентной активации. Сравнение эффективности двух типов тетанизации — высокочастотной активации афферентных волокон и сочетания низкочастотной афферентной активации с деполяризацией постсинаптического нейрона показало, что в первом случае вклад НМДА-ВПСП в поддержание ДП значительно больше, чем во втором (Kullmann et al. 1996). Это согласуется с данными других авторов об отсутствии потенциации НМДА-ВПСП после сочетания низкочастотной активации с деполяризацией одного нейрона (Durand et al. 1996; Isaac et al. 1995; Liao et al. 1995; O’Connor et al. 1994), а также после тета-подобной тетанизации, не требующей сильной афферентной активации (Muller et al. 1988; Muller et al. 1989).

Сила тока, используемого для тетанизации афферентных волокон, также является значимым фактором. Так, тетанизация с умеренной силой тока приводит к более значительной потенциации АМПА-ВПСП, в то время как тетанизация с повышенной силой может селективно потенциировать НМДА-ВПСП (Aniksztejn et al. 1995). Таким образом" при тетанизации афферентных волокон в условиях, когда АМПА-ВПСП составляет основную долю суммарного ВПСП, вклад НМДА-ВПСП в поддержание ДП незначителен. Величина этого вклада зависит, по-видимому, от способа индукции длительной потенциации и увеличивается при использовании длинных высокочастотных пачек «сильных» стимулов, то есть в условиях, благоприятствующих индукции гомосинаптической ДП. Напротив, при вызове ДП более «натуральными» стимулами, такими как тета-активация афферентных волокон или сочетание низкочастотной афферентной активации с постсинаптической деполяризацией, то есть в условиях, благоприятных для индукции ассоциативной ДП, вклад НМДА-ВПСП в поддержание ДП незначителен.

Потенциации фармакологически изолированного НМДА-ВПСП.

При проведении опытов с фармакологически изолированным НМДА-ВПСП была описана ДП этого компонента, не отличающаяся по внешним проявлениям от потенциации АМПА-ВПСП (Bashir et al. 1991; Bernard et al. 1995; Lin et al. 1993; Xie et al. 1992). По аналогии с обычной ДП, эта потенциация является НМДА-зависимой, то есть процесс индукции ДП может быть блокирован аппликацией в момент тетанизации селективных антагонистов этих рецепторов (Bashir et al. 1991). Длительность и временной ход поддержания ДП НМДА-ВПСП также не отличаются от аналогичных показателей при вызове «обычной» ДП (Bashir et al. 1991; Bernard et al. 1995). Отличительной особенностью потенциации НМДА-ВПСП, отмеченной в нескольких работах, является рост амплитуды ответов за счет увеличения латентности максимума, в то время как начальный наклон ВПСП изменяется слабо (Bernard et al. 1995; Muller et al. 1992). Следует отметить, что для вызова НМДА-ВПСП и, соответственно, для афферентной тетанизации в условиях блокады АМПА-ВПСП, силу стимулирующего тока значительно повышали по сравнению с нормальной (Bashir et al. 1991; Bernard et al. 1995). При тетанизации с умеренной силой тока, не вызывавшей потенциации фармакологически изолированного НМДА-ВПСП, после отмыва антагонистов АМПА-рецепторов наблюдалась потенциация АМПА-ВПСП (Muller et al. 1988), что согласуется, в принципе, с описанной в предыдущем разделе зависимостью ДП НМДА-ВПСП от силы афферентной стимуляции.

Потенциация НМДА-компонента в составе «двухкомпонентного» ВПСП.

Основным недостатком экспериментов с индукцией ДП в «нормальных» условиях является необходимость выделения НМДА-компонента ВПСП после тетанизации с целью измерения его величины, что достигается путем аппликации антагонистов глутаматных рецепторов либо деполяризацией постсинаптического нейрона. Эти манипуляции могут оказывать влияние на возбудимость пресинаптических терминалей и изменять пул активируемых синапсов. В результате измерение НМДА-ВПСП будет проводиться не в тех синапсах, которые подвергались тетанизации. Недостатком использования фармакологически изолированного НМДА-ВПСП, как и в предыдущем случае, является отсутствие возможности сравнения вклада АМПАи НМДАкомпонентов в процесс поддержания ДП без проведения смены перфузирующего раствора. Эти недостатки в значительной степени можно преодолеть использованием анализа «двухкомпонентных» ВПСП, состоящих из примерно одинаковых долей АМПА и НМДА-компонентов.

В первых опытах с применением двухкомпонентных ВПСП величина ДП НМДА компонента была примерно в три раза меньше ДП АМПА компонента ВПСП (Asztely et al. 1992). Однако, последующие опыты авторов из той же лаборатории показали, что величина ДП АМПА и НМДА компонентов ВПСП различается только в начальный период (0−30 мин) после тетанизации, а в более поздние сроки становится одинаковой (Xiao et al. 1996). Поскольку в этих экспериментах не использовали блокаторы торможения, причиной различий в ранний период после тетанизации могло быть вызванное тетанизацией изменение ТПСПа.

В экспериментах с внутриклеточной регистрацией вызванной активности в режиме фиксации потенциала при полной блокаде быстрого и медленного торможения, напротив, было показано, что в ранний период после тетанизации НМДА-ВПСП потенциирован в большей степени, чем АМПА-ВПСП (Clark et al. 1993). В более поздней работе тех же авторов степень потенциации и временной ход ДП обоих компонентов совпадали (Clark et al. 1995). Аналогичные результаты были получены в работе других авторов, использовавших для анализа ДП АМПАи НМДА-ВПСП регистрацию двухкомпонентных ВПСТ в режиме фиксации потенциала постсинаптического нейрона (O'Connor et al. 1995).

Как следует из приведенных выше литературных данных, поведение обоих компонентов сильно варьирует в зависимости от условий проведения эксперимента и способа измерения компонентов. Такой разброс результатов может навести на мысль о том, что механизмы ДП АМПА и НМДА компонентов ВПСП, по-видимому, различаются. Но в то же время можно предполагать, что используемые методы выделения компонентов и их измерения не позволяли достаточно полно анализировать АМПА и НМДА компоненты в одном синапсе или одних и тех же пулах синапсов. Возможно производился анализ АМПА и НМДА компонентов не одного и того же синапса или одной группы синапсов, а компонентов, генерируемых в различных синапсах или синаптических пулах.

Наша работа предполагала изучение поведения АМПА и НМДА компонентов в условиях более вероятного сочетания этих компонентов в одном синапсе или группе актвируемых синапсов.

Анализ методов измерения, применявшихся в экспериментах по изучению.

ДП НМДА ВПСП.

Существует несколько способов измерения величины НМДА-ВПСП (в большинстве случаев для более точного измерения его вклад в суммарный ВПСП искусственно увеличивают с помощью растворов модифицированного состава (Asztely et al. 1992; Asztely et al. 1996; Crepel et al. 1993):

1) вычитание из суммарного ВПСП той его части, которая оставалась после воздействия селективных антагонистов НМДА-рецепторов (Muller et al. 1988). Поскольку доля НМДА-компонента в ответе на одиночный стимул ничтожно мала, в качестве тестирующего стимула применяли короткие высокочастотные пачки стимулов (Herron et al. 1986). Еще большего увеличения вклада НМДА-компонента добивались при использовании «праймирующей» стимуляции другого входа (Muller et al. 1989), подавляющей на несколько сотен миллисекунд быстрое торможение, в норме значительно уменьшающее НМДА-ответы. Недостатком такого измерения НМДА-ВПСП является необходимость использования пачечной активации и/или праймирующего стимула, так как при этом точность измерения зависит от неизменности парной фасилитации и эффекта «прайминга» .

2) измерения амплитуды или величины начального наклона фармакологически выделенного НМДА ВПСП (Collingridge G.L. 1996). Недостатком блокады торможения при одновременном использовании низких концентраций магния является дестабилизация системы локальных возбуждающих связей в СА1 области, провоцирующая судорожные разряды и активацию полисинаптических вызванных ответов (Crepel et al. 1997).

3) сравнение величин АМПА и НМДА-компонентов на так называемых «двухкомпонентных» ВПСП, вклад в которые АМПАи НМДА-зависимых компонентов сравним по величине (Asztely et al. 1992; O’Connor et al. 1995; Xiao et al. 1995; Xiao et al. 1996). Величина АМПА-компонента при этом оценивается по величине начального наклона двухкомпонентного" ВПСП, а НМДА-компонента по амплитуде ответа при латентности большей, чем латентность АМПА-компонента (в диапозоне от 20 до 100 мс) (Xiao et al. 1995). Для получения «двухкомпонентных» ВПСП вклад НМДА-ВПСП увеличивают путем понижения внеклеточной концентрации магния (O'Connor et al. 1995).Иногда, для уменьшения вклада АМПА-ВПСП в раствор добавляют небольшую концентрацию антагонистов АМПА-рецепторов (Xiao et al. 1995).

4) при использовании для регистрации метода фиксации потенциала нейрона, возможно проведение измерения НМДА компонента без глобального понижения концентрации Mg2+ в перфузирующем растворе. Для этого во время регистрации ответа нейрон деполяризуют до уровня, при котором устраняется магниевый блок НМДА-каналов, что повышает их проводимость (обычно, до -30 мВ или +40 мВ) (Durand et al. 1996; Isaac et al. 1995; Liao et al. 1995; O’Connor et al. 1994). Возможным недостатком такого измерения является влияние тока, деполяризующего нейрон, на возбудимость пресинаптической терминали, что может изменять квантовые параметры синаптической передачи (Voronin et al. 1995). Возможно, что продолжительная деполяризация нейрона может изменять также количество и свойства НМДА-рецепторов на постсинаптической мембране.

5) возможно также математическое разложение суммарного ответа на две составляющие, соответствующие НМДА-и АМПА-компонентам. Это достигается, например, путем аппроксимации заднего фронта возбуждающего постсинаптического тока (ВПСТ) двумя экспонентами, более медленная из которых принимается за НМДА, а более быстрая за АМПА-ВПСТ (Wang et al. 1996). Другой способ состоит в разложении ВПСП или ВПСТ на АМПАи НМДА-компоненты, исходя из кинетической модели АМПАи НМДА-рецепторов и связаных с ними ионных каналов (Xie et al. 1997). Этот метод применим, однако, только при достаточно большом по величине вкладе в ответ НМДА-компонента, что наблюдается, например, в медиальной части перфорантного входа в зубчатую фасцию (Wang et al. 1996). На наш взгляд, это перспективный метод, однако он нуждается в дальнейшей проверке.

Предварительная (0−120 мин до тетанизации) активация НМДА-рецепторов подавляет эффективность тетанизации в вызове ДП (Huang et al. 1992), активация в момент тетанизации является необходимым условием индукции ДП (Bliss et al. 1993), а активация после тетанизации дестабилизирует фазу поддержания ДП (Xiao et al. 1996). Поскольку активация НМДА-рецепторов инициирует также процессы депотенциации (Wagner et al. 1995) и длительной депрессии (Desmond et al. 1991; Malenka and Nicoll 1993), их активация на протяжении всего времени эксперимента может значительно влиять на характер изменения суммарных вызванных ответов после тетанизации. В результате упомянутых особенностей проведения экспериментов НМДАи АМПА-компоненты ВПСП могут по-разному изменяться после тетанизации афферентных волокон, даже если механизмы посттетанической ДП этих компонентов полностью совпадают.

Разногласия данных о степени потенциации НМДА-ВПСП.

Данные различных авторов относительно участия НМДА-компонента ВПСП в процессе поддержания ДП сильно различаются и зависят, по-видимому, от условий проведения эксперимента. Для удобства анализа можно разделить известные экспериментальные данные на три группы в зависимости от относительной величины АМПАи НМДА-ВПСП во время индукции ДП. В первую группу можно внести эксперименты, в которых во время тетанизации АМПА-компонент составлял основную часть ВПСП (условия, близкие к нормальным). Во второй группе при проведении тетанизации АМПА-компонент был подавлен селективными блокаторами, в результате чего основную часть ВПСП составлял НМДА-компонент (фармакологически изолированный НМДА-ВПСП). В третьей группе величина обоих компонентов была примерно одинакова («двухкомпонентные» ВПСП). Далее мы рассмотрим поведение обоих компонентов для этих случаев.

Экспериментальная ситуация, в которой проводят изучение вклада в поддержание длительной потенциации НМДА-ВПСП, имеет несколько принципиальных отличительных особенностей, объясняющих в значительной степени вариабельность результатов различных авторов. Во-первых, НМДА-рецептор и связанный с ним ионный канал имеют несколько регуляторных участков, на которые могут действовать эндогенные и экзогенные активные вещества (Gozlan et al. 1995;

Johnson 1996), контролировать концентрацию которых в эксперименте не всегда возможно. Такие вещества могут выделяться во время тетанизации или другого воздействия (при аноксии или во время эпилептического разряда) и изменять величину НМДА-ВПСП, что будет восприниматься, в зависимости от знака изменения, как потенциация или депрессия синаптической передачи. Во-вторых, ввиду влияния магниевого блока на проводимость НМДА-каналов (Nowak et al. 1984) величина НМДА-ВПСП в значительной степени зависит от мембранного потенциала и, следовательно, от величины тормозного постсинаптического потенциала (ТПСП). Поскольку полная блокада торможения приводит к развитию судорожной активности, во многих исследованиях его подавляют лишь частично (Asztely et al. 1992. Xiao et al. 1995; Xiao et al. 1995). Изменение торможения после тетанизации или иного воздействия в этом случае будет влиять на величину НМДА-компонента и может ошибочно трактоваться как изменение эффективности возбуждающей синаптической передачи. В-третьих, ввиду незначительной величины НМДА-компонента ВПСП в «нормальных» условиях (то есть при соотношении концентраций ионов Mg2+ и Са2+ как в цереброспинальной жидкости), его прямое измерение затруднено.

Нами впервые для анализа двухкомпонентных ВПСП был использован метод анализа главных компонентов (АГК) как для анализа ФП, так и для данных по внутриклеточным записям.

Так же был предложен новый способ определения величин АМПА и НМДА компонентов путем аппроксимации вызванных ответов суммой «базовых» компонентов по всему ходу эксперимента.

2. МЕТОДИКА.

ВЫВОДЫ.

1. Частичная блокада АМПА рецепторов, применяемая в эксперименах с так называемыми «двухкомпонентными» ВПСП в области СА1 гиппокампа, не подавляет полностью прямое быстрое торможение, в результате остаточное торможение влияет на величину измеряемого НМДА ВПСП и искажает данные о величине и временном ходе длительной потенциации этого компонента.

2. Быстрое ГАМКа опосредованное торможение способно существенно влиять на временной ход длительной потенциации НМДА компонента ВПСП в условиях слабой тетанизации афферентных входов. Подавление быстрых ТПСП селективным антагонистом ГАМКа рецепторов уменьшает величину длительной потенциации НМДА компонента ВПСП и способствует потенциации АМПА ВПСП.

3. Относительная величина длительной потенциации АМПА и НМДА рецепторзависимых компонентов ВПСП в области СА1 в значительной мере зависит от силы афферентной тетанизизации: слабая тетанизация вызывает селективную потенциацию АМПА компонента, тогда как более сильная способствует потенциации НМДА компонента.

4. На уровне одиночных синапсов АМПА и НМДА компоненты ВПСП потенциируется в одинаковой степени, что показали в экспериментах с регистрацией минимальных внутриклеточных ответов с фиксацией потенциала в конфигурации «целая клетка» .

5. Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу, согласно которой на уровне отдельных синапсов АМПА и НМДА рецепторы вносят примерно одинаковый вклад в процесс поддержания длительных синаптических перестроек, тогда как при регистрации фокальных ответов и/или составных (не-минимальных) ВПСП величина пост-тетанического изменения АМПА и НМДА компонентов зависит от относительной потенциации соответственно синапсов коллатерально-комиссурального или локального возбуждающего входов к пирамидным нейронам области СА1.