Актуальность исследования.
В современных науках о жизни значительное место занимают проблемы изучения белковых молекул, связи структуры и функции белков. Наибольшее внимание при этом привлекают каталитически активные белки — ферменты. Одним из основных направлений является исследование механизмов ферментативного катализа, представляющее значительный интерес как с фундаментальной точки зрения, так и для развития биотехнологии. Важнейшим этапом функционирования ферментов является специфическое распознавание и связывание молекул субстрата. Понимание механизмов, лежащих в основе субстратной специфичности белков, позволяет управлять активностью природных ферментов, в частности, в медицинских целях. Кроме того, знание закономерностей распознавания субстрата позволяет конструировать белки с модифицированной, заданной субстратной специфичностью.
Удобной моделью для исследования механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются протеолитические ферменты. Внутри этого класса ферментов можно выделить ряды родственных белков, по-разному взаимодействующих с различными аминонокислотными остатками субстрата. Таким образом, становится возможным проанализировать изменения в структуре ферментов, приводящие к различиям в субстратной специфичности.
Среди протеаз особый интерес вызывают ферменты с узкой субстратной специфичностью, распознающие, например, только положительно или только отрицательно заряженные остатки. Подобные ферменты нашли широкое применение в современных биомедицинских технологиях, благодаря их способности осуществлять ограниченный гидролиз белков и пептидов. Это делает протеазы с узкой специфичностью незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии протеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов.
Моделью в наших исследованиях служит глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins (BIGEP) — сериновая протеаза, с высокой специфичностью гидролизующая пептидные связи, образованные а-карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот. Подобная специфичность выделяет глутамилэндопептидазы 5.
ГЭПазы) в ряду химотрипсинподобных протеаз. Несмотря на то, что BIGEP относится к хорошо изученному структурному семейству химотрипсина, а для самого фермента установлена пространственная структура и проведен направленный мутагенез субстратсвязывающего сайта, механизм, определяющий субстратную специфичность BIGEP, как и других глутамилэндопептидаз, неизвестен. Изучение закономерностей, обеспечивающих распознавание отрицательно заряженных остатков субстрата ГЭПазами на примере BIGEP, и последующее сравнение с таковыми других ферментов семейства, позволит проанализировать эволюционные изменения, обеспечивающие разнообразие субстратных предпочтений химотрипсинподобных протеаз.
Цели и задачи исследования.
Основной целыо данного исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей BIGEP, обеспечивающих предпочтение фермента к связям, образованным остатками глугаминовой кислоты. Для этого в работе решались следующие задачи:
1) изучение механизма созревания предшественника BIGEP;
2) получение зрелой BIGEP без N-концевых аминокислотных остатков и анализ ее специфичности.
Научная новизна исследования.
В представленной работе впервые продемонстрировано, что модификация сайта процессинга BIGEP влияет на продукцию активного белка клетками В. subtilis. Впервые исследован механизм созревания рекомбинантной BIGEP in vitro, и показана необходимость пропептида BIGEP для формирования активного фермента. Получен вариант зрелой BIGEP с делецией трех N-концевых аминокислотных остатков, что позволило впервые продемонстрировать важность N-концевого района для функционирования фермента.
Практическая значимость исследования.
Полученные в работе данные о влиянии модификации сайта процессинга на продукцию активной BIGEP могут быть использованы для создания эффективных продуцентов протеаз с узкой субстратной специфичностью. В частности, в работе предложен новый подход к получению BIGEP в гетерологической экспрессионной системе, заключающийся в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
МЕХАНИЗМЫ РАСПОЗНАВАНИЯ ЗАРЯЖЕННЫХ СУБСТРАТОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ.
2.1.
Введение
.
Исследование механизмов, лежащих в основе ферментативного катализа, является одним из важнейших направлений современной науки. Это связано как с исключительной важностью биологических функций ферментов, так и с их широчайшим биотсхпологическим применением.
Одним из основных элементов, определяющих эффективность функционирования любого фермента, является точность и сила его взаимодействия с субстратом — то есть его специфичность. С одной стороны, правильное позиционирование молекулы субстрата в активном центре необходимо для эффективного ферментативного катализа. С другой стороны, способность к тонкому распознаванию субстрата обеспечивает избирательность фермента. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе специфического взаимодействия с субстратами, может позволить нам изменять как эффективность работы ферментов, так и их специфичность.
Удобной моделью для изучения механизмов фермент-субстратного взаимодействия являются протеолитические ферменты. Все протеазы взаимодействуют с одним и тем же субстратом — полипептидной цепью. В то же время существует огромное разнообразие протеолитических ферментов (эти белки встречаются абсолютно у всех известных организмов). При этом многие заметно отличающиеся по структуре протеазы взаимодействуют с одними и теми же участками полипептидной цепи, и наоборот, часто структурно близкие ферменты заметно различаются по специфичности. Таким образом, изучение закономерностей, лежащих в основе взаимодействия протеаз с субстратом, заметно приблизит нас к пониманию механизмов, определяющих субстратную специфичность ферментов.
Наиболее распространенными методиками, применяемыми для анализа механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются рентген о-структурный анализ молекул фермента (чаще в комплексе с субстратом или его аналогом) и генно-инженерная модификация белка. Первый метод позволяет визуализировать фермент-субстратное взаимодействие, и дает возможность выдвинуть предположение о роли отдельных структурных элементов фермента. С помощью второго подхода возможно 7 вносить изменения в структуру белка, а последующий анализ наблюдаемого эффекта позволяет судить об участии модифицированных элементов в функционировании фермента. Совместное применение этих методов позволяет формулировать гипотезы о механизмах, лежащих в основе специфичности того или иного белка, в том числе протеазы.
Аминокислотные остатки, образующие пептидную цепь, можно разделить на различные группы. Одно из наиболее очевидных делений — на заряженные и нейтральные. К первым относятся имеющие отрицательный заряд остатки дикарбоновых кислот: аспарагиновой и глутаминовой, а также положительно заряженные лизин и аргинин. Протеолитические ферменты, специфически взаимодействующие с участками полипептидной цепи, несущими заряд, играют заметную роль в биологических процессах. Достаточно упомянуть каспазы, играющие ключевую роль в процессе апоптоза, факторы свертывания крови и комплемента, пищеварительные ферменты эукариот и факторы патогенности микроорганизмов. Ниже представлен обзор данных, существующих для различных протеолитических ферментов, относительно механизмов, лежащих в основе специфического взаимодействия протеаз с заряженными субстратами.
По каталитическому механизму протеазы принято делить на четыре типа в зависимости от природы нуклеофильного агента, участвующего в реакции. Это аспаргильные, сериновые, цистеиновые и металлопротеазы. Эта классификация использована нами далее при анализе данных о механизмах, определяющих предпочтение различных протеолитических ферментов к заряженным субстратам.
выводы.
1) Впервые продемонстрировано влияние (-1) остатка на формирование активной глутамилэндопептидазы В. intermedius (BIGEP) и продукцию активной протеиназы бактериальными клетками. Показано, что, в зависимости от природы аминокислотных остатков, формирующих сайт процессинга, BIGEP активируется различными ферментами. Возможно, модификация (-1) положения служит эволюционным механизмом изменения уровня продукции глутамилэндопептидаз.
2) Предложен новый подход для создания эффективных рекомбинантных продуцентов протеиназ с узкой субстратной специфичностью, заключающийся в модификации их сайта процессинга. С использованием этого подхода на основе клеток Е. coli сконструирован продуцент BIGEP.
3) Впервые исследовано созревание BIGEP с собственным пропептидом in cis и in trans, а также без пропоследовательности и показано, что пропептид BIGEP необходим для формирования активного фермента.
4) Продемонстрировано, что отсутствие свободной а-аминогруппы Vail в предшественнике BIGEP не влияет на его способность распознавать отрицательно заряженные остатки.
5) Впервые получен вариант зрелой BIGEP с удаленными тремя N-концевыми аминокислотными остатками и продемонстрировано, что эти остатки важны для функционирования фермента.
4.4.
Заключение
.
Таким образом, как полученные нами, так и литературные данные говорято важности N-концевых остатков бациллярных и кокковых ГЭПаз в функционироватьии фермента. В то же время предшественник BIGEP, по-видимому, обладает характерной ГЭПаз специфичностью до формирования свободной аминогруппы Vail. Этот подразумевает, что а-аминогруппа Vail является как минимум не единствен.
Ым элементом, определяющим субстратную специфичности ГЭПаз. Подтверждают та.^^^^^ трактовку данные о ГЭПазах Str. griseus [83] и nsp4 вируса артериита [82], чьи: ^ концевые районы удалены от субстратсвязывающего участка ферментов.
Итак, ГЭПазы с высокой избирательностью распознают отрицательно заряжетз^^^ остатки. В то же время, ни свободная аминогруппа, ни абсолютно консервативиь.^.^ ГЭПаз остаток His213 [90], видимо, не являются элементами, целиком определяюгхд—-^.
-•^МИ субстратные предпочтения фермента. Можно предположить, что специфичен.
Кое взаимодействие с отрицательно заряженными остатками осуществляется благо суммарному эффекту целой группы положительно заряженных остатков ГЭПаз. В случае ни один из остатков не является единственным «компенсатором» отрицагел того заряда и, следовательно, критическим для распознавания субстрата. Тогда централ ^^^ роль в механизме, определяющем специфичность, должна играть геом субстратсвязывающего района ГЭПаз, обеспечивающая точное распознавание ос*: гков глутаминовой кислоты. Следовательно, можно предполагать, что ГЭПазы спосо^> ^ ы с низкой эффективностью распознавать и близкие по структуре, но нейтральные ос^-^ глутамина. Хотя для большинства ферментов этой группы таких данных нет, способ ^ атки ость гидролизовать связи, образованные остатками глутамина, описана для протеаз V8 nsp4 in vivo [87, 118]. Исходя из этого, возможно предположение, что Vail является в.
Лрвую очередь важнейшим структурным элементом, необходимым для формир<^>^ правильной геометрии субстратсвязывающего района BIGEP, в то время как ~ аряд свободной аминогруппы важен в значительно меньшей степени.
