Изучение, разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации уреплазм

Уреаплазменная инфекция продолжает оставаться одной из актуальных проблем клинической микробиологии. Возбудители — Ureaplasma urealyticum и Ureaplasma parvum, относящиеся к семейству Mycoplasmataceae класса Mollicutes, часто колонизируют урогенитальную систему человека. Обычно наблюдается скрытое, бессимптомное носительство уреаплазм среди клинически здоровых лиц. Вместе с тем, уреаплазменная инфекция может сопровождаться развитием патологических процессов, в числе которых негонококковый уретрит, хориоамнионит, преждевременные роды, поражение дыхательной системы и ЦНС у преждевременно родившихся маловесных детей, артриты у лиц со сниженным иммунитетом и др. [15, 33, 44, 204, 221, 233, 253]. В связи с этим, существует необходимость в объективном и достоверном выявлении Ureaplasma spp. в клиническом материале.

Лабораторные методы исследований играют решающую роль в диагностике уреаплазменной инфекции вследствие отсутствия четких клинических проявлений, широкого распространения бессимптомного носительства и частого сочетания уреаплазм с другими инфекционными агентами.

Наибольшую диагностическую ценность имеют прямые методы выявления микроорганизмов, их антигенов и генетического материала, являющихся специфическими микробными маркерами. Арсенал прямых методов диагностики уреаплазменной* инфекции включает в себя [33, 34]:

1) иммуноморфологический метод (РИФ) — обнаружение в клиническом материале антигенов Ureaplasma spp. с помощью антител, меченных флюорохромом;

2) молекулярно-биологические методы, в том числе ПЦР — методы идентификации генетического материала микроорганизмов, основанные на обнаружении специфических для микроба последовательностей ДНК;

3) микробиологический метод — наиболее объективный метод в диагностике инфекций, поскольку обладает высокой, чувствительностью и специфичностью («золотой стандарт» диагностики инфекций). Основан на выделении чистой культуры возбудителя из клинического материала и последующей идентификации на основе изучения морфологических, культуральных, биохимических и других свойств.

Несмотря на широкое применение в последнее время молекулярно-биологических методов диагностики, уреаплазменной инфекции, микробиологический метод не утратил своего1 значения. При одинаковой чувствительности и специфичности молекулярно-биологических и микробиологического методов [40], последний имеет несомненные преимущества, так как является наиболее информативным методом, позволяющим определить степень обсемененности микроорганизмом исследуемого материала, а также чувствительность выделенных штаммов микроба к антибактериальным препаратам [20, 33, 248]. Кроме того, микробиологический метод является методом выбора для оценки эффективности проведенного лечения.

Культивирование уреаплазм, чрезвычайно требовательных к составу питательных сред, связано с рядом трудностей, в числе которых отсутствие сред определенного составасложность состава среднеобходимость максимального соответствия состава питательным потребностям Ureaplasma [17, 33, 248]. В классическом исполнении микробиологическое исследование — трудоемкий процесс, проводящийся в несколько этапов, включая большую подготовительную работу, требующий большого количества дифференциально-диагностических сред, реактивов, стерильной посуды, а также затрат труда. Результат при этом удается получить не ранее, чем через 3 суток. Микробиологическая диагностика уреаплазменной инфекции в практических лабораториях сопряжена с трудоемкостью приготовления питательных сред, требующих строгого соблюдения заданных физико-химических условий. Достоверность результатов исследования при этом зависит от квалифицированного приготовления сред, а также качества используемых компонентов сред. Контроль качества каждого компонента среды — необходимый этап приготовления сред в лаборатории. Кроме того, необходимо проводить оценку ростовых свойств каждых новых серий питательной среды [248].

В настоящее время отмечается тенденция перехода от классических, многоступенчатых исследований к современным, унифицированным технологиям анализапри этом большее значение придается оптимизации и стандартизации, воспроизводимости, надежности, а также упрощению и автоматизации метода. Весьма перспективным является использование микротест-систем, избавляющих практических микробиологов от трудоемких работ и позволяющих получить стандартные, воспроизводимые результаты [35].

Стремление к усовершенствованию и стандартизации микробиологического метода реализовано разработкой и внедрением в практику за рубежом ряда диагностических наборов для выявления и идентификации урогенитальных микоплазм, определения их количества и чувствительности к антибактериальным препаратам, в числе которых «Mycoplasma Lyo», «Mycoplasma 1ST» (bioMerieux, Франция) — «Mycoplasma Duo», «Mycoplasma SIR» (Bio-Rad, Франция) — «Mycofast All-in», «Mycofast Evolution 2», «Mycofast US» (International Microbio, Франция). Показано, что перечисленные выше наборы обладают высокой диагностической эффективностью [18, 40, 41, 66, 168, 220]. Однако в России указанные диагностические наборы имеют ограниченное использование, прежде всего, в связи с их достаточно высокой ценойнекоторые из них недоступны вообще.

В нашей стране еще недостаточно решена проблема микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, хотя имеются питательные среды лабораторного изготовления для выявления Ureaplasma spp., однако, производственный выпуск данных препаратов, разрешенных для использования в Российской Федерации, отсутствует.

В свете сказанного, несомненно важнейшей задачей является совершенствование микробиологического метода как основного, наиболее объективного и информативного метода диагностики уреаплазменной инфекции.

Перечисленные выше предпосылки позволили сформулировать цель и определить задачи работы.

Цель настоящей работы — разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp.

В соответствии с целью задачами данного исследования являлись:

1. Разработать селективную питательную среду для культивирования Ureaplasma spp. Изучить рост штаммов уреаплазм на предложенной среде. Оценить селективные свойства среды и пригодность для выявления уреаплазм в образцах клинического материала.

2. Разработать транспортную среду для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала.

3. Разработать метод оценки роста уреаплазм на основе измерения оптической плотности культур в процессе роста на предложенной питательной среде.

4. Разработать методику оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в лабораторных условиях.

5. Создать микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. и внедрить ее в практику здравоохранения.

6. Разработать методику оценки качества микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. в клинико-эпидемиологических испытаниях.

7. Разработать программу проведения государственных испытаний микротест-системы совместно с ГИСК им. JI.A. Тарасевича и Комитетом МИБП.

Научная новизна.

В связи с необходимостью усовершенствования микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, нами разработаны селективная питательная среда для культивирования и выявления Ureaplasma spp. и транспортная среда для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала. На основе разработанных сред впервые предложена микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. — «Уреаплазма Микротест».

Использование микротест-системы позволяет: 1) выявлять и идентифицировать бактерии рода Ureaplasma- 2) определять обсемененность исследуемого материала уреаплазмами, что важно для оценки их этиологической роли в развитии патологических процессов в урогенитальной системе- 3) оценивать чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам, являющуюся основанием для рационального выбора антибактериальной терапии и одновременно дифференциально-диагностическим критерием идентификации (по отношению штаммов Ureaplasma spp. к антибиотикам групп макролидов и линкозамидов).

Впервые предложен оригинальный метод определения концентрации уреаплазменных культур в экспоненциальной фазе роста по измерению оптической^ плотности среды, что позволило разработать метод строгой оценки ростовых свойств питательной среды в условиях лаборатории и стандартизовать инокулят при определении чувствительности штаммов Ureaplasma к антибактериальным препаратам.

Впервые разработан метод оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp., основанный’на анализе кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в средах сравнения и испытуемой.

Разработана программа клинико-эпидемиологических испытаний диагностической микротест-системы с использованием принципов доказательной медицины. Показана высокая диагностическая эффективность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.

Теоретическая и практическая значимость работы.

В теоретическом плане проведенные исследования расширяют представления о биологических свойствах бактерий рода Ureaplasmaпозволяют оптимизировать методические подходы к количественному определению уреаплазм в клиническом материале и стандартизовать процесс выявлениям идентификации Ureaplasma spp.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработана технология производства микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест». Разработаны и утверждены фармакопейная статья предприятия ФСП № 42−115 624 405 на микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест" — инструкция по применению препарата № 01−041/135−05 и производственный регламент № 1 897 593−805.

Получен патент 2 265 656 на разработанную питательную среду для выявления Ureaplasma spp. и предложенный способ диагностики уреаплазменной инфекции.

Полученный фактический материал представляет интерес при конструировании препаратов для диагностики микоплазмозов другой этиологии, например, вызванных Mycoplasma hominis.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Предложенная микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест» обеспечивает стандартизацию микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции.

2. Методы определения наиболее вероятного количества бактерий и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяют определить концентрацию уреаплазм в исследуемом материале.

3. Изменение оптической плотности среды в экспоненциальной фазе роста культуры Ureaplasma spp. в стандартных условиях культивирования отражает накопление жизнеспособных клеток уреаплазм.

4. Анализ кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста культур тест-штамма в средах сравнения и испытуемой в стандартных условиях позволяет оценить ростовые свойства испытуемой среды.

5. Критерий диагностической эффективности U-U{P) позволяет в клинико-эпидемиологических испытаниях определить ценность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 39 таблицамисостоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, списка и приложения. В работе использовано 39 отечественных и 223 зарубежных источников литературы.

153 ВЫВОДЫ.

1. Разработаны питательная среда для культивирования бактерий рода Ureaplasma, обладающая высокими ростовыми и селективными свойствами, и транспортная среда, обеспечивающая оптимальные условия для сохранения жизнеспособности уреаплазм. Использование сред позволяет эффективно выявлять Ureaplasma spp. в образцах клинического материала.

2. Показано, что примененные для Ureaplasma spp. методы наиболее вероятного количества бактерий и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени могут быть использованы для определения концентрации уреаплазм в исследуемом материале.

3. Показано, что изменение оптической плотности среды в процессе роста бактерий рода Ureaplasma в стандартных условиях культивирования на разработанной питательной среде отражает накопление жизнеспособных клеток уреаплазм в поздней экспоненциальной фазе роста культур.

4. Разработан метод оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. на основе анализа кривых изменения оптическойплотности среды в процессе роста тест-штамма в стандартных условиях культивирования в средах сравнения и испытуемой. Метод позволяет дифференцировать ростовые свойства разных серий указанной среды, а также отдельных ее компонентов.

5. Предложен микрометод определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам, являющийся модификацией метода серийных разведений в жидкой питательной среде, с использованием пограничных концентраций.

6. Разработана микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma urealyticum (Ureaplasma spp.) «Уреаплазма микротест», обеспечивающая стандартизацию выявления, оценки количества и определения чувствительности бактерий рода Ureaplasma к антибактериальным препаратам.

7. Разработана методика оценки качества микротест-системы «Уреаплазма микротест» в клинико-эпидемиологических испытаниях, позволяющая определить диагностическую эффективность препарата, предназначенного для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий.

Заключение

.

Этиологическая структура урогенитальных инфекций постоянно меняется. В последнее время значительно возросла частота микоплазменных инфекций, борьба с которыми представляет значительные трудности в связи с развивающейся устойчивостью к антибиотикам и особенностями ответных реакций организма. Особое место среди них занимает уреаплазменная инфекция. Бактерии рода Ureaplasma — U. urealyticum и U. parvum часто колонизируют урогенитальную систему человека, при этом обычно наблюдается скрытое, бессимптомное носительство уреаплазм среди клинически здоровых лиц. Вместе с тем, в ряде случаев уреаплазменная инфекция может сопровождаться развитием патологических процессов, в числе которых неспецифические воспалительные заболевания, патология плода и новорожденных. Лабораторные методы исследования играют решающую"* роль в диагностике уреаплазменной инфекции вследствие отсутствия четких клинических проявлений, широкого распространения бессимптомного носительства уреаплазм и частого сочетания их с другими инфекционными агентами. В связи с этим, существует необходимость в объективном и достоверном выявлении Ureaplasma spp. в клиническом материале. Несмотря на широкое применение в последнее время молекулярно-биологических методов диагностики уреаплазменной инфекции, микробиологический метод не утратил своего значения. Стремление к усовершенствованию и стандартизации микробиологического метода реализовано в разработке за рубежом ряда диагностических наборов для выявления и идентификации урогенитальных микоплазм, определения их титра и чувствительности к антибиотикам. В России еще недостаточно решена проблема микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, хотя имеются питательные среды лабораторного изготовления. В* связи с изложенным несомненно актуальными являются исследования, направленные на разработку, совершенствование и стандартизацию микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции. Совершенно не освещены вопросы количественной оценки роста уреаплазм и определения концентрации клеток в образцах клинического материалаотсутствует информация о стандартизации питательных сред и препаратов для диагностики уреаплазменной инфекции. Решению этих проблем и посвящена настоящая работа.

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.1. Штаммы микроорганизмов.

Штаммы Ureaplasma spp.: 1) коллекционные, из коллекции живых культур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН (U. parvum серотип 1, U. urealyticum серотип 8) и авторской коллекции штаммов урогенитальных микоплазм, выделенных от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. И. М. Сеченова (U. parvum 455, 465, 468, 481 U. urealyticum IT, 2Т). 2) свежевыделенные от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. И. М. Сеченова.

Штаммы Mycoplasma hominis: 1) коллекционные, из коллекции живых культур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН (М. hominis Н-34) и авторской коллекции штаммов урогенитальных микоплазм, выделенных от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. И. М. Сеченова (М. hominis 199, 205, 233) 2) свежевыделенные от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. И. М. Сеченова.

Коллекционные штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий {Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Proteus morganii, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis), а также штамм Candida albicans получены из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

1.2. Культивирование микроорганизмов.

Питательные среды для культивирования микроорганизмов.

Для приготовления питательных сред для культивирования уреаплазм и других микроорганизмов использовали следующие компоненты: основа бульона для микоплазм (Becton Dickinson>microbiology systems, США, кат. № 255 420), сердечно-мозговая вытяжка (Becton Dickinson microbiology systems, США, кат. № 237 500), триптоза (Becton Dickinson microbiology systems, США, кат. № 211 709), дрожжевой экстракт (Becton Dickinson microbiology systems, США, кат. № 211 929), среда 199 сухая (Sigma, США, кат. № М 5017),.

L-цистеина гидрохлорид (Sigma, США, кат. № С 8277), феноловый красный (Sigma, США, кат. № Р 5530), мочевина (Sigma, США, кат. № U 4128),.

L-аргинина гидрохлорид (Sigma, США, кат. № U 4128), лошадиная сыворотка нормальная (Биолот, Россия), бензилпенициллина калиевая соль (Sigma, США, кат. № А 0166) ампициллина натриевая соль (Sigma, США, кат. № А 0166), ванкомицина гидрохлорид (Sigma, США, кат. № V 2002), амфотерицин В (Sigma, США, кат. № А 2411), линкомицина гидрохлорид (Sigma, США, кат. № L 2774), доксициклин (Sigma, США, кат. № D 9891), эритромицин (Sigma, США, кат. № Е 5389), азитромицин (Fluka, США, кат. № 75 199), кларитромицин (Клацид, Abbott Laboratories, Франция, per. № П 12 673/01−2001), линкомицин (Sigma, США, кат. № L 2774), клиндамицин (Sigma, США, кат. № С 6427), спирамицин (Fluka, США, кат. № 85 626), джозамицин (Fluka, США, кат. № 59 983), мидекамицин (Sigma, США, кат. № М 3143), ципрофлоксацин (HiMedia, Индия, кат. № RM 1891), офлоксацин (Sigma, США, кат. № О 8757).

GHL-трипептид (глицил-Е-гистидил-Е-лизипа ацетат) (Sigma, США, кат. № G 1887), обогащающая добавка CVA (Gibco, США, кат. № D-1000), обогащающая добавка IsoVitaleX (Becton Dickinson microbiology systems, США, кат. № 211 876), агар (Becton Dickinson microbiology systems, США, кат. № 214 220), соляная кислота концентрированная особо чистая (Химмед, Россия), натрия гидроксид химически чистый (Химмед, Россия), этанол (Химмед, Россия), метанол (Химмед, Россия).

Приготовление сред.

Стерилизацию стеклянной посуды проводили в сухожаровом шкафу ED53 (Binder, Германия) при температуре 160 °C в течение 2 часов.

Взвешивание компонентов сред проводили с помощью весов ВА210 и BA110S (Sartorius, Германия).

Измерение рН основ сред и готовых сред проводили с помощью рН-метра рН211 (Hanna Instruments, Германия).

Растворы добавок для сред стерилизовали фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм (Millipore, США).

Стерилизацию основ сред проводили в автоклаве ВК-75 (ТЗМО, Россия) при 0,5 атм в течение 15−30 мин.

Приготовление полных сред проводили в стерильных условиях в ламинарном боксе SG400 (The Baker Co., Inc., США).

Питательная и транспортная среда для выявления Ureaplasma spp. [39] Состав питательной и транспортной среды для выявления Ureaplasma spp. приведен в таблице 2.