Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия

Точность воспроизведения генетически заданной структуры белков зависит от способности аминоацил-тРНК-синтетаз (aaRS) узнавать и эффективно аминоацилировать соответствующую тРНК. Правильный отбор и аминоацилирование тРНК достигается благодаря взаимодействиям aaRS с определенным набором нуклеотидных остатков тРНК, называемых «элементами идентичности» («identity elements») или «элементами узнавания» («recognition elements»). В настоящее время известны элементы идентичности для всех 20 систем тРНК-aaRS из Е. coli и для нескольких систем из дрожжей, Thermus thermophilus и высших эукариот, включая человека [1]. Аминоацилирование тРНК — это многостадийный процесс, который включает первоначальное связывание субстратов, конформационную перестройку фермент-субстратного комплекса, химическую реакцию в активном центре и освобождение продуктов. Несмотря на многочисленные исследования по проблеме «узнавания» тРНК, выполненные преимущественно с использованием генетических методов in vivo и кинетических экспериментов in vitro с мутантными тРНК [1,2], данные об уровне распознавания тРНК на стадии связывания и последующих этапах каталитического превращения получены для ограниченного числа систем. Взаимодействия аспартил-тРНК-синтетазы (AspRS) дрожжей и гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS) Е. coli с антикодоном специфичных тРНК вносят основной вклад в прочность соответствующих комплексов и обеспечивают специфичность отбора на стадии связывания [3, 4]. Многочисленные биохимические и структурные исследования дрожжевой AspRS и ее взаимодействия с субстратами позволили установить, что связывание tPHKAsp инициируется узнаванием антикодоновой петли, и что все элементы ее узнавания участвуют в формировании каталитически активного комплекса [5]. Селективность отбора tPHKHis на стадии связывания усиливается взаимодействием HisRS с устойчивым аналогом гистидиладенилата [4]. В то же время идентичность тРНКТгр определяет преимущественно скорость переноса на нее активированной аминокислоты [6]. Нарушения взаимодействий глутаминил-тРНК-синтетазы Е. coli с элементами идентичности тРНК01″ влияют на эффективность узнавания глутамина [7]. Способность тРНК оптимизировать взаимодействие фермента со специфичной аминокислотой обнаружена и для тРНК-независимых триптофанили серил-тРНК-синтетаз (катализирующих реакцию активации в отсутствие тРНК) [6, 8]. Уменьшение каталитической эффективности аминоацилирования тРНКРЬе дрожжевой фенилаланил-тРНК-синтетазой в результате мутаций нуклеотидов, стабилизирующих третичную структуру, обусловлено в значительной мере ингибированием диссоциации пирофосфата.

9]. Таким образом, индивидуальность систем проявляется не только в наборе элементов узнавания, но и выполняемых ими функциях.

Основной целью данной работы было изучение функциональной роли элементов узнавания тРНК на разных этапах взаимодействия: на стадии первоначального связывания тРНК синтетазой и последующих перестройках комплекса в каталитически активную форму, в том числе индуцируемых низкомолекулярными субстратами. В качестве объекта исследования была выбрана фенилаланин-специфичная система из Thermus thermophilus.

Фенилаланил-тРНК-синтетаза (PheRS) — один из наиболее сложноорганизованных ферментов семейства аминоацил-тРНК-синтетаз: субъединичная структура цитоплазматического фермента (аР)2-типа эволюционно консервативна [10]. Согласно своим структурным характеристикам PheRS принадлежит к так называемому классу II синтетаз, но использует 2'-гидроксил концевой рибозы тРНК для переноса аминокислоты, подобно ферментам класса I [11−13]. Трехмерная структура PheRS Т. thermophilus и ее комплексов с отдельными субстратами (фенилаланином, тРНКРЬе) и фенилаланиладенилатом (Phe-AMP) установлена с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) [10, 14−16]. Взаимодействие PheRS Т. thermophilus с тРНКРЬе изучено с помощью биохимических методов [17, 18]. Идентифицированы элементы узнавания тРНК№е в эволюционно различных организмах [19−26]. Структурные исследования ряда комплексов aaRS с тРНК на атомном уровне позволили понять молекулярную основу специфичности их взаимодействия, но для большинства систем не решена проблема продуктивного связывания акцепторного конца тРНК. Данные РСА комплексов с правильной ориентацией ССА-конца получены пока для глутаминил-, глутамили аргинил-тРНК-синтетаз (GlnRS, GluRS и ArgRS) класса I, аспартил-, треонили серил-тРНК-синтетаз (AspRS, ThrRS и SerRS) класса II [5,27−33]. Присутствие малых субстратов в активном центре является необходимым условием функционального связывания 3'-конца тРНК не только для тРНК-зависимых aaRS (GlnRS, GluRS и ArgRS, не синтезирующих аминоациладенилат в отсутствие тРНК). Для Aspи Ser-специфичных ферментов класса II показано, что правильная ориентация акцепторного конца тРНК, необходимая для катализа, достигается только в присутствии АТР и аминокислоты [30, 31, 33]. Необходимость существования аналогичного механизма контроля для PheRS следует из анализа структуры комплексов фермента с отдельными субстратами (низкомолекулярными или TPHKPhe): перекрывание участков связывания концевого аденозина и фенилаланина создает серьезные препятствия для продуктивного взаимодействия [16]. Получение комплексов aaRS со всеми субстратами является большой удачей из-за ограничений, накладываемых условиями кристаллизации и возможного протекания второй стадии реакции аминоацилирования в кристаллах [29]. С другой стороны, использование негидролизуемых аналогов аденилатов не всегда способствует связыванию и функциональной ориентации акцепторного конца тРНК. Так, в комплексах лизили пролил-тРНК-синтетаз, сокристаллизованных со специфичными тРНК в присутствии устойчивых аналогов аминоациладенилата, ССА-конец остается неупорядоченным [34, 35]. Альтернативным подходом к изучению структурной динамики взаимодействия с тРНК представляется метод аффинной модификации, применявшийся в основном в ранних исследованиях aaRS [36, 37].

Первой задачей данной работы было изучение эффективности распознавания специфичной и отбраковки неспецифичных тРНК PheRS Т. thermophilus на стадии связывания. Для её решения были определены константы диссоциации комплексов фермента с тРНКР11е различного происхождения, рядом мутантных тРНКР1к Е. coli и неспецифичными тРНК и сопоставлены с известными кинетическими параметрами аминоацилирования.

Второй задачей было изучение функциональной роли фенилаланина и АТР в продуктивном связывании акцепторного конца тРНКРЬе с помощью аффинного мечения PheRS аналогами тРНКРЬе, содержащими различные реакционноспособные нуклеотиды на З'-конце.

Третьей задачей являлась оценка роли структурных элементов тРНКРЬе, определяющих специфичность системы, в функциональном связывании акцепторного конца, контролируемом низкомолекулярными субстратами. Для ее решения был проведен сравнительный анализ продуктов мечения субъединиц PheRS Т. thermophilus s4U76-замещенными аналогами тРНКРЬе и ее мутантов (содержащих нуклеотидные замены в различных участках структуры) в отсутствие либо в присутствии малых субстратов.

выводы.

1. Для выявления структурных элементов, ответственных за специфичность связывания и эффективность распознавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Т. thermophilus, измерены константы диссоциации комплексов фермента с тРНКРЬе, содержащими замены различных нуклеотидов, и неспецифичными тРНК. Показано, что.

— специфичность комплексообразования определяется в первую очередь идентичностью антикодона;

— нуклеотиды, образующие третичные взаимодействия G19-C56 и U45-G10-C25, вносят основной вклад в стабилизацию правильной трехмерной структуры тРНК, необходимой для оптимального связывания;

— U20 и нуклеотиды, образующие третичное взаимодействие A26-G44, важны для конформационной подстройки комплекса;

— неспецифические взаимодействия фермента с антикодоновым и акцепторным стеблями и с А73 не важны для распознавания тРНКРЬе в процессе комплексообразования;

— уменьшение эффективности комплексообразования с неспецифичными тРНК в 100−3000 раз по сравнению с тРНКРЬе обеспечивает их преимущественную отбраковку на уровне связывания.

2. Впервые с помощью аффинной модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus аналогами тРНК№е, содержащими различные реакционноспособные нуклеотиды в определенных позициях З'-концевой последовательности (окисленные периодатом натрия по концевой рибозе или фотоактивируемые), изучена конформационная динамика взаимодействия фермента с акцепторным концом тРНКРЬе.

— Показано, что взаимодействия фермента с фенилаланином и АТР влияют на ориентацию З'-концевого нуклеотида тРНКРЬеиндуцируемые нуклеотидным субстратом эффекты выражены значительно сильнее и зависят от структурных различий бактериальной и эукариотической тРНКРЬе в районах, не контактирующих с активным центром.

— На основе анализа полученных результатов и известных рентгеноструктурных данных высказано предположение, что взаимодействия с аминокислотным субстратом контролируют связывание З'-концевого аденозина тРНКРЬе в активном центре, а индуцируемые АТР более глубокие перестройки в структуре комплекса модулируют конформацию акцепторной ветви в целом.

3. Исследована роль различных элементов узнавания тРНКРЬе в обеспечении продуктивного связывания акцепторного конца с помощью фотоаффинного мечения фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus з4и-содержащими аналогами тРНКРЬе и ее мутантов (содержащих нуклеотидные замены в различных участках структуры) в отсутствие и в присутствии фенилаланина и АТР. Показано, что.

— взаимодействие фермента с тРНКРЬе на этапе, предшествующем каталитической стадии, требует тонкой конформационной подстройки комплекса: любые мутации оказывают более существенное влияние на ориентацию З'-концевого нуклеотида тРНКРЬе в присутствии фенилаланина и АТР, чем в их отсутствие;

— нарушение специфических взаимодействий с антикодоном наиболее критично для функциональной ориентации акцепторного конца, контролируемой малыми субстратами.