Морфология лимфоидных клеток при спонтанном и экспериментальном гемобластозах крупного рогатого скота: Электронно-микроскопические исследования

Содержание

• Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на отчетных научных конференциях Московской ветеринарной академии им. К. И. Скрябина (1976−1996 гг.), на координационныхвещаниях программы по решению НТП 0.69.05 «Лейкозы человека и животных» Государственного комитета по науке и технике (1976−1990), на VIII, IX Всесоюзных научно-методических конференциях по патологической анатомии-х. животных (Витебск, 1981- Казань, 1984), на Международноммпозиуме поавнительному изучению лейкемии и родственных заболеваний (Пицунда, 1979) — Всесоюзной конференции «Иммунология и иммунотерапия животных» (Самарканд, 1984) — Всесоюзноммпозиуме «Первично-локализованные опухоли кроветворной ткани приматов и

9 t' «i > с л человека, пути генерализации» (Сухуми, 1986) — II Всесоюзномезде гематологов и трансфузиологов (Львов, 1985) — Всемирном ветеринарном конгрессе (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 1991) — Всероссийской научно-методической конференции по патологической анатомии-х. животных (Воронеж, 1993), Международная научно-практическая конференция, посвященная 40-летию ВНИИВВиМ (Покров, 1998)

Результаты работы экспонировались на

ВДНХ СССР 1983 г., в 1987 г. Главным комитетом ВДНХ награждены бронзовой медалью (Постановление от 23.07.87).

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования служили 237 гол. крупного рогатого скота [ерно-пестрой (210 гол.), костромской (14 гол.) и бушуевской (13 гол.) пород. Животные были разделены на следующие группы: 74 коровы клинически здоровые, серологически отрицательных в реакции имму-нодиффузии (РИД) к антигенам ВЛКРС- 77 гол. серологически положительных, 86 коров больных различными формами гемобластозов, серологически положительных к антигенам ВЛКРС.

Диагноз поставлен на основании клинико-гематологических (Петровский Г. С.), вирусологических (Крикун В.А.) и патолого-морфологических (Сноз Г. В.) исследований, проведенных в динамике развития лейкозного процесса, при убое животных или их гибели с характерными признаками лейкоза. Животные обследовались гематологически: в крови у здоровых коров 4,5−9,0 тыс/мкл лейкоцитов (50−60% лимфоцитов), больных животных 16,5−365,0 тыс/мкл лейкоцитов (8090% лимфоцитов), в лимфе 4,5−16,0 тыс/мкл лейкоцитов (95% лимфоцитов).

В качестве контроля были взяты нативные и культивированные лимфоциты крупного рогатого скота с индуцированной аденовирусной инфекцией (5 телят в возрасте 1 мес.)* и болезнями незаразной этиологии: маститы, эндометриты, травматический ретикулит, бронхопневмония. В крови данных животных было 12,5−36,0 тыс/мкл лейкоцитов с 5075% лимфоцитов (15 гол).

Экспериментальными моделями служили крупный рогатый скот: 3 гол. бурой латвийской породы, 9 гол. черно-пестрой и 3 гол. бушуевской пород- гетерологичные виды: овцы — 16 гол. романовской и 22 гол. каракульской пород и 5 гол. породы меринос- козы — 5 гол.- кролики — 10 гол.

Все животные подбирались по принципу аналогов со сходной зоотехнической характеристикой: порода, пол, возраст. В качестве материала для заражения крупного рогатого скота (телята в

Материал любезно предоставлен профессором Белоусовой Р. В, возрасте 1 год) использовали культуральную жидкость 48-часовой культуры лейкоцитов крови лейкозной коровы, содержавшую ВЛКРС, вводили внутрибрюшинно в дозе 100,0 мл. Кроме того использовали очищенный онкорнавирус и цельную кровь коровы, больной лейкозом. Ягнят в возрасте 3-х месяцев, свободных от онкорнавирусной инфекции заражали дважды с интервалом 3 месяца нативными лимфоцитами крови коровы, больной XJIJI, дозами 625×10б клеток в объеме 1 мл внутрибрюшинно, внутривенно, внутрикожно (Салимов Х.С., Крикун В.А.).

Козлят в возрасте 14−36 дней заражали 45 мл крови больной овцематки (L — 560 тыс/мкл, 99% лимфоцитов) и кровью лейкозной коровы (L 190,0 тыс/мкл) 20 мл подкожно (Андриян Е.А.). В процессе исследований были использованы клетки линии тимуса эмбриона крупного рогатого скота — МВА-76 «продуцента» онкорнавируса типа С (ТЭК МВА-76) (Крикун В.А. и соавт., 1978).

Материалом для трансмиссионной и растровой электронной мик роскопии служили нативные лимфоциты крови и лимфы и культивированные in vitro. Пробы крови брали из яремной вены, лимфу от коров получали сразу после выведения грудного протока или на 2-ой день после операции (Иткин Б.З., Петраков К.А.), в количестве 100−150 мл. Культуры лимфоцитов готовили по общепринятой методике. Лимфоциты лимфы выделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Выделение лимфоцитов и их подготовку к электронной микроскопии проводили по методу Anderson (1969) в нашей модификации. Из лимфоцитов периферической крови и центральной лимфы крупного рогатого скота, овец, коз и кроликов подготовлено и изучено 5820 блоков. Исследовано 325 краткосрочных культур лейкоцитов и одна перевиваемая вируспродуцирующая культура ТЭК МВА-76 на разных пассажах. Ультратонкие срезы контрастировали уранилаце-татом и цитратом свинца. Препараты изучали в электронном микроскопе JEM 100 С при 80 кв.

Для растровой электронной микроскопии препараты готовили по стандартной методике, изучали и фотографировали на пленку при увеличении 5×10 000 раз в электронном микроскопе JEM 100С со сканирующей приставкой. В каждом препарате просматривали не менее 250 клеток. Всего проанализировано более 15 000 снимков.

Результаты экспериментов обработаны статистически, достовер ность различий оценивали по Стьюденту.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Электронно-микроскопическое исследование лимфоидных клеток крови и лимфы клинически здорового крупного рогатого скота.

2.1.1. Ультраструктура лимфоцитов крови здорового крупного рогатого скота из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств.

Комплексное изучение свойств лейкозных клеток при спонтанном и экспериментальном лейкозах человека, крупного рогатого скота и лабораторных животных позволило выявить достоверные качественные и количественные ультраструктурные отличия их от нормальных клеток той же степени дифференцировки.

Ультраструктура нормальных, интактных лимфоцитов изучалась ла 54 гол. крупного рогатого скота трех пород: черно-пестрой, костромской, бушуевской. Все животные имели нормальные гемограммы и были клинически здоровы.

Изучение клеток лимфоидного ряда в электронном микроскопе показало, что по размерам и морфологии они неоднородны. Наиболее приемлема для крупного рогатого скота, на наш взгляд, классификация, разработанная для лимфоцитов крови человека Э. И. Терентьевой и Г. И. Козинцом (1972). Взяв за основу данную классификацию мы выделили и описали лимфоидные клетки у здорового крупного рогатого скота.

Малые светлые лимфоциты у здоровых, неинфицированных ВЛКРС животных представляли самую большую, в процентном соотношении, группу клеток. Они имели ровную или с небольшим количеством ворсинок и выступов клеточную поверхность, высокое ядерно-цитоплазматическое отношение. Большую часть клетки занимало округлое, иногда с глубокими выпячиваниями, ядро, окруженное узким или широким ободком цитоплазмы. Гетерохроматин ядер плотный, распределен в виде конденсированных глыбок у ядерной мембраны. Основную часть ядра занимал мелкозернистый или аморфный эухроматин. В некоторых клетках обнаруживали: омпактное ядрышко. Цитоплазма электронно-светлая, бедна «рганеллами, содержала 1−3 митохондрии конденсированного типа. Эндоплазматическая сеть слабо развита, в виде небольших канальцев и вакуолей. Аппарат Гольджи выявляли редко, он состоял, как правило, из мелких пузырьков и единичных цистерн.

Малые темные лимфоциты имели структуру аналогичную малым светлым лимфоцитам, но в цитоплазме находили визуально значительно больше свободных рибосом, которые придавали клетке темный вид, и крупные митохондрии (5−6) с хорошо выраженным рисунком крист.

Большие лимфоциты встречались редко, имели ровную или извилистую клеточную поверхность, низкое ядерно-цитоплазматическое отношение.

Ядро округлое или овальное располагалось эксцентрично, аморфно зернистый

Таблица №

Характеристика животных

Группа животных Серология (РИД) Количество лейкоцитов, тыс/мкл % встречаемости ЯК (250 кл на 1 гол.)

Животные из благополучных по лейкозу хозяйств

1. Клинически здоровые (п=51) 4,7−8,

Животные из неблагополучных по лейкозу хозяйств

2. Клинически здоровые (п=26) 3,2 — 6,2 0,57 ±0,

3. а) инфицированные ВЛКРС до 2% ЯК, (п=27) б) инфицированные ВЛКРС до 4% ЯК, (п=30) в) инфицированные

ВЛКРС ЯК выше 4%, (п=24) + + + 5,3−7,5 5,3 — 9,2 5,8−11,6 1,13 ±0,24 2,95 ± 0,95 6,67 ± 1,

4. Начальная стадия ХЛЛ, (п=15) + 16,6 — 32,5 7,13 ± 1, хроматин располагался неравномерно с участками уплотнения в центре и у ядерной мембраны.

Лимфоплазмациты встречались крайне редко и характеризовала хорошо развитой сетью гранулярного эндоплазматического ретикулу-ма. Общим для всех четырех видов клеток было отсутствие патологических изменений в ядре: ядерных карманов и ядерных инвагинатов. Нами проведены исследования клинически здоровых, серонегативных коров (26 гол.) из неблагополучного по лейкозу хозяйства. Лимфоциты крови были представлены в основном малыми светлыми и единичными большими лимфоцитами по ультраструктуре однотипными с подобными клетками здоровых животных из благополучных по лейкозу хозяйств. Однако некоторые животные имели в ядрах лимфоидных клеток ядерные карманы. Данные аномалии находили в среднем у 0,57 ± 0,14% клеток с колебаниями от 0,4 до 0,8% (табл. 1).

Таким образом лимфоциты коров серологически отрицательных в РИД из благополучных по лейкозу хозяйств не имеют изменений в структуре клеточных органелл. Они появляются у аналогичных животных из неблагополучных по лейкозу хозяйств, в среднем 1%.

2.1.2. Ультраструктура лимфоцитов лимфы клинически здорового крупного рогатого скота.

Наименее изученным звеном в системе лимфопоэза остается ультраструктура лимфоцитов лимфы крупного рогатого скота. Анализ литературных данных показал, что до настоящего момента не было специальных исследований по сравнительному изучению лимфоидных леток периферической крови и центральной лимфы крупного рогатого кота. Вопрос изучения клеточного субстрата лимфы здоровых животных остается важным, так как является отправным моментом изучения патогенеза лейкозов.

При электронно-микроскопическом изучении морфологии клеточного состава лимфы крупного рогатого скота из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств установлено, что клеточная популяция лимфы здоровых животных содержит несколько вариантов, различающихся по ультраструктуре, клеток лимфоидного ряда с небольшой примесью эритроцитов, полиморфно-ядерных лейкоцитов и гранулоцитов.

Первым, доминирующим типом клеток были лимфоциты диаметром 4−6 мкм, с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, которое было в пределах 0,83−0,92. Такие клетки имели крупное, округлое или овальное ядро, располагающееся в центре клетки, часто с узкими глубокими впячиваниями.

Цитоплазма отличалась повышенной электронной плотностью и была бедна органеллами, среди которых были лишь рибосомы, единичные пиноцитозные пузырьки и 1−2 мелкие митохондрии с электронно-светлым матриксом и четко очерченными кристами.

Второй тип клеток лимфоциты такого же или несколько боль-иего размера (до 7 мкм), но с более широким ободком цитоплазмы. Ядерно-цитоплазматическое отношение 0,65−0,73. По сравнению с узко-цитоплазматическими лимфоцитами клетки с широким ободком цитоплазмы имели больше митохондрий (3−6), округлой или овальной формы. Аппарат Гольджи представлен расширенными мембранами диктиосом и вакуолями.

Третий тип клеток — большие лимфоциты с низким ядерно-цитоплазматическим отношением — 0,4−0,5, широким ободком цитоплазмы, где находили многочисленные митохондрии (8−10), развитый аппарат Гольджи, элементы гранулярного ретикулума, полирибосомы.

Четвертый тип — недифференцированные клетки размером 9−12 мкм, контуры которых обычно гладкие. Ядерно-цитоплазматическое отношение 0,4−0,5. Цитоплазма умеренной электронной плотности содержала свободные рибосомы, эндоплазматический ретикулум, различные вакуоли: Часто встречались фагосомы, цитосегресомы, мультивезикулярные тельца, единичные микротрубочки.

Клеточная популяция лимфы коров серологически отрицательных в РИД к антигенам ВЛКРС из неблагополучного по лейкозу хозяйства представлена всеми перечисленными выше клетками. Кроме того, довольно часто обнаруживали крупные клетки диаметром 9−11 мкм с ядерно-цитоплазматическим отношением 0,6 — 0,7, которые имели большое количество полисом и развитую (по сравнению с лимфоцитами) сеть эндоплазматического ретикулума. Ядро таких клеток крупное, расположено эксцентрично. Как правило, их называют «плазматизиро-ванные» лимфоциты.

В лимфоцитах лимфы животных из неблагополучного хозяйства наблюдали единичные ядерные карманы несложной архитектоники, которые представляли собой пузырьковидные образования, состоящие из фрагментов цитоплазмы, ограниченные ядерной мембраной.

В нашем случае обнаружение у некоторых животных (2 из 5) лим-фоплазмацитов и единичных клеток с ядерными карманами может свидетельствовать о скрытом, на данный момент, носительстве вируса лейкоза крупного рогатого скота.

2.2. Ультраструктурные особенности лимфоидных клеток крови и лимфы крупного рогатого скота в динамике лейкозного процесса.

Важным моментом взаимодействия онкогенных вирусов и клеток хозяина является причастность их к механизмам клеточной пролиферации. В настоящее время считают, что экспрессия ВЛКРС в организме крупного рогатого скота является антигенным стимулом, запускающим пролиферацию В-лимфоцитов.

На молекулярно-генетическом уровне установлена разница между инфицированными и опухолевыми клетками по локализации копий провируса в хромосомах лимфоидных клеток. Имеются сведения о различиях в экспрессии провируса ВЛКРС, лейкозоассоциированных анти генов, клеточного гена С-тус в процессе лейкозогенеза и в опухолях, индуцированных ВЛКРС (Gupta P. et al., 1986- Ruzmak J. et al, 1993, Tambasco A. et al, 1996, Levkut M. et al, 1996, Куделева Г. В., 1991- Чев-кина E.M., 1997). Остается неясным вопрос взаимосвязи молекулярно-генетических и иммунологических перестроек с изменениями морфологии основных клеточных органоидов клеток-мишеней в процессе лейкозогенеза.

2.2.1. Электронно-микроскопические особенности лимфоидных клеток крови при онкорнавируспой инфекции.

В связи с выяснением вопроса о том, являются ли серологически позитивные к антигенам ВЛКРС животные потенциальными претендентами в группу больных животных, нами исследованы коровы черно-пестрой породы, серологически положительных в РИД из неблагополучных по лейкозу хозяйств (табл. 1).

Популяция лимфоидных клеток, как и у животных серологически отрицательных в РИД, состояла из малых светлых лимфоцитов и единичных больших лимфоцитов с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Лимфоциты инфицированных животных имеют изменения в ядре, мембранном аппарате клеток, митохондриях. Выявлены расслоения и миелинизация мембран ядра, образование фибриллярных труктур, сформированных в кольцевидные или пакетообразующие комплексы. В цитоплазме часто выявляли аппарат Гольджи, более развитую эндоплазматическую сеть. Самым значимым для онкорнавирус-ной инфекции является наличие лимфоидных клеток с патологическими изменениями в ядрах ядерными карманами, ядерными инвагинатами и ядерными вакуолями. Ядерные карманы были однообразной формы, в виде небольших пузырьков. Иногда встречались несложные комплексы из двух ядерных карманов.

Представляло интерес проследить за развитием спонтанной он-корнави-русной инфекцией на крупном рогатом скоте из хозяйства с высокой общей инфицированностью стада: 62,5% - инфицированных ВЛКРС- из них 10,2% - больных лейкозом и 12,8% - подозрительных на заболевание. С инфекцией вируса лейкоза у крупного рогатого скота ассоциировано три состояния: бессимптомная инфекция, гематологическая и опухолевая формы болезни. Мы провели пятилетние наблюдения за четырьмя группами животных:

1. Животные положительные в РИД к антигенам ВЛКРС с нормальной гематологией — 27 гол.

2. Животные положительные в РИД с нормальным лейкоцитозом и относительным лимфоцитозом — 30 гол.

3. Животные положительные в РИД со слабо выраженным лейко-щтозом и лимфоцитозом (подозрительные на лейкоз) — 20 гол.

4. Животные положительные в РИД с выраженным лейкоцитозом и лимфоцитозом (больные лейкозом) — 15 гол.

Гематологические и электронно-микроскопические исследования представлены в табл. 1 (группа 3, 4).

Продолжительный период наблюдения позволил констатировать, что длительность онкорнавирусной инфекции коррелировала с нарастанием ультраструктурных изменений в клетках-мишенях для ВЛКРС-лимфоцитах крови. Если первоначально животные первой подгруппы (За) не имели ядерных карманов в лимфоцитах или имели их лишь у небольшого (до 1,13±0,24%) количества клеток, то через 2−3 года количество клеток с ядерными аномалиями возросло в 2−4 раза у 8 коров, у 19 гол. показатели оставались стабильно одинаковыми (1,2−1,4%), четыре животных с повышенным лейкоцитозом и лимфоцитозом до уровня подозрительных или положительных на лейкоз показателей (14,2−16,7 тыс./мкл) были переведены в третью подгруппу (Зв). Количество лимфоцитов с ядерными карманами с 1,4−1,7% возросло до 5,7−8,2%.

У животных второй подгруппы (36) количество лимфоидных клеток с ядерными карманами увеличилось, но осталось в пределах значимости для клинически здоровых, инфицированных животных (2,95±0,95%). Из этой группы выбыло два животных с положительной на лейкоз гематологией (18,1 — 21,5тыс./мкл).

Анализируя результаты исследований лимфоцитов животных третьей (Зв) и четвертой группы (ЯК 6,67 ± 1,2), следует сказать, что 50% животных выбраковано как положительные по гематологии на лейко: У оставшихся животных, несмотря на повышение лейкоцитоза и относительного лимфоцитоза, количество клеток с маркерными аномалиями лейкозных лимфоцитов или оставались практически на одном уровне, или повышалось перед гибелью животного. Возможно альтернативное объяснение данного факта:

1. Несмотря на возрастающий лейкоцитоз и лимфоцитоз нарастание лимфоцитов с патологическими изменениями, ядерными аномалиями, имеет индивидуальные пределы, зависящие от иммунобиологического статуса отдельной особи или ряда других экзогенных и эндогенных факторов.

2. Увеличивающийся лейкоцитоз может быть связан с доброкачественной В-клеточной пролиферацией лимфоцитов.

Не без оснований можно предположить, что клинически здоровые инфицированные животные с высоким процентом лимфоцитов (3−6%) с ядерными карманами представляют собой группу «повышенного риска» к заболеванию лейкозом и возможно такое состояние назвать «предлей-козом».

2.2.2. Субмикроскопическая морфология лимфоцитов крови и лимфы крупного рогатого скота при гемобластозах.

Анализ данных литературы показал, что до настоящего момента не было специальных исследований по сравнительному изучению лимфоидных клеток периферической крови и центральной лимфы крупного рогатого скота при гемоблатозах. В связи с вышеизложенным крайне важным являлось не только обнаружение патологических изменений в лейкозных клетках, но и доказательство их специфичности, стабильности присутствия в клетках, возможности определения количественных критериев малигнизации лимфоидных клеток в течении развития и становления лейкозного процесса. Указанные моменты прослежены на больных гемобластозами животных.

Хронический лимфоидный лейкоз (ХЛЛ).

Это наиболее часто встречающаяся форма лейкоза у крупного рогатого скота в возрасте 4−8 лет. Хронический лимфолейкоз наблюдали у 45 коров, из которых 20 имели начальную стадию, 15 — развернутую и 10 — терминальную стадии болезни. Количество лейкоцитов в 1 мкл крови колебалось от 12 тыс./мкл до 365 тыс./мкл и более при наличии в лейко-формуле 7−14% пролимфоцитов, а в терминальной стадии — до 50% лим-фобласгов, недифференцированных и атипичных клеток.

Начальная стадия лимфолейкоза характеризуется наличием в пе-рифери-ческой крови в основном малых и средних лимфоцитов иногда обнаруживали единичные пролимфоциты и лимфобласты. Ультраструктура преобладающего числа клеток не имела существенных отли-ий от таковых у здоровых животных. Поверхность лимфоцитов преимущественно гладкая или с небольшим числом выступов. Клетки с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Ядро расположено эксцентрично. В цитоплазме концентрируются органеллы с измененной ультраструктурой. Митохондрии (3−10 на клетку) часто имеют набухшие, деградированные или полностью редуцированные кристы. Часто встречается комплекс Гольджи и центриоли. У единичных клеток находили длинные профили эндоплазматического ретикулума. Цитоплазма богата рибосомами и полисомами. Ядрышко преимущественно большое, рыхлое. Постоянно наблюдали лимфоидные клетки с полиморфизмом ядер, наличием ядерных карманов (в среднем у 8,1 ± 1,6% клеток) простой пузырьковидной формы. В отдельных лимфоцитах наблюдали 1−3 ядерных кармана.(Табл. 4)

Развернутая и терминальная стадии ХЛЛ. В отличие от начальной в развернутой и терминальной стадиях ХЛЛ наряду с увеличением общего числа лейкоцитов и лимфоцитов (30,0 тыс/мкл — 365,6 тыс./мкл), значительно увеличивается количество незрелых лимфоидных клеток (до 50%), лимфобластов и недифференцированных (до 5%), ридеровских форм клеток. Среди всех обнаруженных типов клеток увеличилось число лимфоидных клеток с выраженными изменениями субмикроскопического строения важнейших клеточных органелл. Для лейкозных лейкоцитов были характерны прогрессирующие изменения в цитоплаз-матических органеллах. Как в малых, так и незрелых, недифференцированных клетках и бластах находили центриоли, пиноцитозные пузырьки и аппарат Гольджи, который нередко был гипертрофирован, состоял из больших везикул и канальцев. В одной клетке находили 2−4 пластинчатых комплекса. Характерные аномалии обнаруживали в митохондриях. Наряду с типичными митохондриями в одной и той же клетке наблюдали гигантские формы с обычной структурой или выраженной диском-плексацией и деструкцией крисг. В митохондриях часто встречались миелиноподобные структуры, образованные из мембран крист или

Рис. № 1 Ультраструктурные изменения в лимфоцитах при онкорнавирусной инфекции и хроническом лимфолейкозе: а, б — ядерные карманы- в -миелиноподобные структуры) г — полиморфизм МИТОХОНД-рий.х

Рис № 2, 3 Развернутая стадия хронического лимфолейкоза. Увеличение перинуклеарного пространства, разнообразные комплексы ядерных карманов. X 40 ООО, 18 ООО внешней мембраны. У небольшого числа клеток мембраны шероховатого ретикулума были большой протяженности и располагались параллельно ядерной мембране. Такие клетки напоминали «плазматизированные» лимфоциты.

Наиболее значительные изменения обнаружены в ультраструктуре ядра, его мембране. Ядра клеток преимущественно имели неправильную форму с выпячиваниями и углублениями разнообразной конфигурации. Ядерные мембраны дуплицировались и участвовали в образовании аномалий 3 видов: ядерные карманы, ядерные инвагинаты и фибриллярные комплексы. Аномалии сочетались с локальным расширением перинуклеарного пространства.

Самым существенным отличительным признаком лейкозных лимфоцитов, как и при начальной стадии, было наличие в них многочисленных ядерных карманов. Количество их возрастало — в развернутой стадии 19,52 ± 5,05% клеток, в терминальной — 28,01 ± 9,08%. Стенк- ядерного кармана формировалась внешней и внутренней ядерными мембранами и слоем гетерохроматина толщиной 25−50 нм, который располагался между двумя мембранами. Эта слоистая структура инва-гинировала в цитоплазму или ядро клетки и окольцовывала их фрагменты с различными органеллами: рибосомами, вакуолями, цистернами шероховатого эндоплазматического ретикулума, хроматином. Ядерные карманы разных размеров имели вид пузырьков, петель, рукавов, фила-ментов или кеглевидную форму.

При развернутой и терминальной стадиях болезни в лимфоцитах выявляли комплексы подобных патологических структур, состоящие из 2−5 ядерных карманов, или отдельные аномалии от 2 до 6 на клетку.

Второй вид часто встречающихся аномалий — это так называемые ядерные инвагинаты, которые образовывались за счет выпячивания внутренней мембраны ядра в кариоплазму и формирования петлевид-ных или пузырьковидных структур. В ядрах лимфоцитов больных животных значительно увеличивалось количество ядрышек, которые выглядели гомогенными, мелкоточечными или кольцевидными.

Недифференцированные клетки имели крупное, чаще бобовидной формы, ядро с нежно-зернистым эухроматином и электронно-плотным тонким слоем гетерохроматина. На периферии ядра находили одно или несколько рыхлых гомогенных ядрышек. Незначительная по ширин< цитоплазма содержала много рибосом, крупных митохондрий с четким рисунком крист. Аппарат Гольджи представлен скоплением пузырьков.

Лимфобласты — крупные клетки с ядром овальной или округлой формы. Мелкозернистый хроматин распределен равномерно, с незначительным уплотнением околоядерной мембраны. Часто выявляли четко контурированные ядрышки. В цитоплазме: 8−10 митохондрий. Ядерные карманы обнаруживали как в малых лимфоцитах, так и недифференцированных клетках — пролимфоцитах, лимфобластах. Наши исследования показали, что имеется корреляция наличия лимфоидных клеток с ядерными карманами с тяжестью течения лейкозного процесса, но нет прямой корреляции между лейкоцитозом и числом клеток с ядерными карманами.

Лимфосаркома

Исследования проведены на 13 коровах с лимфосаркомой. Общее количество лейкоцитов составляло 5,2 тыс/мкл крови при содержании в лейкоформуле 54−84% лимфоцитов, 5−12% лимфобластов, незрелых и атипичных лимфоидных клеток.

При лимфоцитарной лимфосаркоме основную массу лимфоидных клеток периферической крови составляли малые и средние лимфоциты, редко большие лимфоциты и двухъядерные клетки Ридера. Клеточная поверхность лимфоцитов преимущественно гладкая, реже с ворсинками. В лимфоидных клетках при лимфосаркоме находили те же изменения, что и при ХЛЛ. В цитоплазме регулярно выявляли фибриллярные комплексы у ядерной мембраны, мембран клетки и митохондрий, развитый аппарат Гольджи. Выявляли изменения митохондрий, кольцеобразную деформацию крист, вакуоли и профили эндоплазматического ретикулу-ма. В цитоплазме — большое количество рибосом. Значительные изменения обнаруживали в ядрышках. Характерным признаком было обнаружение ядерных телец, которые не выявляли при ХЛЛ. Они были различной формы: кольцевидные, полулунные, трехслойные, ламелляр-ные, и различных типов: фибриллярные, гранулярные, тубулярные.

Пролимфоцитарная и лимфобластная лимфосаркома. При этих заболеваниях в крови циркулирует большое число пролимфоцитов, полиморфных недифференцированных клеток, бластов, «лимфосаркомных» опухолевых клеток больших размеров. Они имели своеобразную морфологию ядра — большого, округлого, с инвагинатами, но чаще с изрезанным или причудливо очерченным профилем. Встречаются крупные клетки с «конволютными» ядрами. Хроматин в них имел своеобразное распределение — узкий, тонкий ободок гетерохроматина и широкий аморфный эухроматин. Почти постоянно выявляли 1−4 рыхлых ядрышка, ядерные тельца. Ядерные карманы — у 9,7 ± 4,6% клеток. В цитоплазме мало рибосом, митохондрий 4−6, увеличенное количество вакуолей, развитый аппарат Гольджи. Обнаруживали также мультиве-зикулярные тельца и тубулоретикулярные структуры.

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛБЛ)

Встречается у крупного рогатого скота реже, чем ХЛЛ и в более молодом возрасте (до 5 лет). Лимфобластный вариант лимфоидного лейкоза характери-зовался острым течением, высоким лейкоцитозом (150−450 тыс./мкл) и наличием в лейкоформуле до 50% лимфобластов. В начальной стадии ОЛБЛ лейкоцитоз был незначительным — до 30−70 тыс./мкл, но лимфобластов было 30−35%. Лимфобластный лимфолейкоз характеризовался наличием среди лимфоидных клеток крови большого числа клеток с размерами и субмикроскопической морфологией лимфобла-стов и единичными гигантскими лимфоидными клетками с низким ядерно-цитоплазматическим отношением.

Они имели обильную электронно-светлую цитоплазму, значительное число свободных рибосом и отдельные полисомы, множество канальцев гранулярной эндоплазматической сети, 8−12 митохондрий с просветленным матриксом и разнообразной архитектоникой крист: четко конту-рированые, деструктурированные, с нарушенной комплектацией, нередко миелиноподобной упаковкой. На экваториальные срезах клеток выявляли хорошо развитый комплекс Гольджи, в его зоне 1−2 цен-триоли, электронно-плотные гранулы, рассеянные по всей цитоплазме, пиноцитозные пузырьки. Часто в лейкозных клетках при ОЛБЛ находили рибосомо-пластинчатые комплексы.

Большое округлое или овальное ядро было в центре клетки или эксцентрично. Оно содержало аморфный эухроматин и узкую примем-бранную зону гетерохроматина. Встречаются клетки (единичные или до 15%) с необычно причудливо изогнутым «конволютным» ядром- 1−2 крупными ядрышками с хорошо выраженной нуклеоплазмой. Постоянно присутствовали многочисленные ядерные карманы, инвагинаты. При лейкоцитозе 40−70,5 тыс/мюх (5 животных) ядерные карманы выявляли у 23,2 ± 1,56% клеток, при высоком лейкоцитозе (80 тыс/мкл и более — 8 гол.) — у 35 ± 4,5% клеток.

Пролимфоцитарный лейкоз (ПЛЛ)

Больные с подобной формой лейкоза встречались редко. Нами исследованы лимфоидные клетки от пяти животных с общим лейкоцитозом 30−90 тыс/мкл с наличием более 15% пролимфоцитов.

Лимфоидные клетки имели ультраструктурные параметры и размеры средние между лимфоцитом и лимфобластом. Цитоплазма содержит довольно полный набор органелл, немногочисленные полирибосомы, короткие профили эндоплазматического ретикулума, комплекс Гольджи с развитыми мембранной и везикулярной частями, 12 центриоли. Ядро правильной округлой формы с хорошо выраженными гомогенными или сетчатыми 1 -2 ядрышками. В перенуклеарной зоне встречаются ламиллярные комплексы и лизосомоподобные, электронно-плотные гранулы. В единичных клетках ядра с изогнутой конфигурацией типа «конволютных». У 11,5 ± 3,1% клеток находили ядерные карманы с ядерным или цитоплазматическим содержимым (табл. 4).

2.2.3. Ультраструктура лимфоидных клеток лимфы при хроническом лимфолейкозе и лимфосаркоме.

Электронно-микроскопическое изучение клеток лимфопоэза и в первую очередь лимфы началось в конце семидесятых годов. Была дана ультраструктурная характеристика лимфоцитов лимфы здоровых мелких и лабораторных животных (кошек, крыс, мышей) и при некоторых незаразных заболеваниях. Более пристальное внимание исследователей было направлено на изучение лимфоцитов лимфы человека. Сведений об ультраструктуре лимфоцитов лимфы при гемобластозах в доступной литературе нами не обнаружено.

В этой связи первоначально нами изучена ультраструктура натив-ных, некультивированных лимфоцитов лимфы при спонтанных хроническом лимфолейкозе и лимфосаркоме. Изучали клетки лимфы 12 коров черно-пестрой породы, больных в начальной, развернутой и терминальной стадиях лимфолейкоза. Четыре коровы в начальной стадии лейкоза с лейкоцитозом в крови до 35 тыс/мкл, в лимфе имели незначительные изменения, общее количество клеток немного превышало норму (3−5 тыс/мкл), в лимфограмме увеличивался процент пролимфоцитов (до 10%) и клеток Ридера.

При электронно-микроскопическом изучении клеточной популяции лимфы крупного рогатого скота больного начальной стадией КИЛ установлено, что лимфа содержит четыре варианта клеток лимфоидного ряда, которые обнаруживали и у здоровых животных: малые узко или широкоцитоплазменные лимфоциты с ядерно-цитоплазматическим отношением в пределах 0,85 — 0,97- крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим отношением (0,4 — 0,61) — недифференцированные бластные клетки размером 10−12 мкм и более, ядерно-цитоплазматическое отношение 0,4 — 0,45. Следует отметить, что наряду с «нормальными» лимфоцитами, преобладали клетки с более многочисленными внутрицитоплазматическими структурами с видимыми качественными и количественными отличиями в компановке и архитектонике отдельных органоидов. Так клеточные поверхности всех четырех типов чаще неровные, с довольно многочисленными филоподиями. В цитоплазме часто находили органеялы с измененной структурой. Митохондрии лимфоцитов нередко имели просветленный матрикс с деструкцией крист. В матриксе крупных митохондрий обнаруживали миелиноподоб-ные структуры, которые не выявляли в нормальных клетках. В некоторых лимфоцитах (до 3%) находили ядерные. карманы на разных стадиях формирования.

В развернутой и терминальной стадиях исследовали 8 коров с уровнем лейкоцитоза в крови свыше 100 тыс/мкл, в лимфе содержание форменных элементов увеличивалось по сравнению с нормой в 3−4 раза (10−15 тыс/мкл), бластов было более 10%. В отличие от начальной стадии чаще встречали клетки с дефектами ядерных мембран, ядерными карманами. Десгруктированные ядерные мембраны формировали мие-линоподобные структуры, фибриллярные комплексы. Ядерные карманы находили у 3−4% лимфоидных клеток, ядерные инвагинаты и вакуоли. Мелкие пузырьковидные или сложные комплексы ядерных карманов находили от 1 до 5 на ядро лимфоцита. Они имели ядерное и цитоплаз-матическое содержимое, внешнюю (цитоплазматическую) и внутреннюю (ядерную) локализацию.

В наших опытах были животные больные лимфосаркомой (10 гол). Гема-тологическими исследованиями установлено, что в начале болезни отмечается умеренный и перемежающийся лейкоцитоз (10−15 тыс/мкл) с относительным или абсолютным лимфоцитозом, эозинофи-лия, моноцитоз. При обострении процесса наступает лейкемизация (в 10−12%) случаев). Общий лейкоцитоз достигает 15−63 тыс/мкл. Наиболее демонстративные изменения при лимфосаркоме наблюдали в лимфе, так кале типичные лимфосаркомные клетки обнаруживали в ней чаще, чем в крови- при обострении их число достигало 50−86%. Общее содержание клеток в лимфе также резко возрастает и обычно превышает число лейкоцитов в крови. В зависимости от формы лимфосаркомы в лимфе преобладали лейкозные лимфоциты (ЛЛС) или бласты (ЛБЛС). В обоих случаях наблюдали большое количество крупных или очень больших (свыше 18 мкм) опухолевых клеток. Находили клетки с 2−5 лопастными ядрами. В узком ободке цитоплазмы выявляли полирибосомы, 2−8 митохондрий конденсированного типа, гипертрофированные аппарат Гольджи.

Следующий вариант лимфоцитов представлял собой клетки с небольшим округлым ядром и широким ободком цитоплазмы, которая содержала множество полирибосом, элементы гранулярного ретикулу-ма, формировавшего рибосомо-пластинчатые комплексы и единичные микрофибриллы. В небольших митохондриях находили дезориентацию крист и уменьшение гранулярного компонента матрикса. В таких клетках обнаруживали структуры, которые никогда не находили в нормальных лимфоцитах. В частности, к ним относятся кристаллоидные тельца.

Типичными представителями редко встречающихся клеток являлись лимфоциты, ядро которых имело извилистые контуры, в центре -гипертрофированные ядрышки неправильной формы, часто выявляли ядерные тельца — глобулярные, фибриллярные и сочетанного типа.

Часто встречались клетки с ядром неправильной формы, с неровными контурами клеточных мембран и многочисленными отростками, типа псевдоподий. Последние считают типичным признаком лимфосаркомы. В таких клетках находили ядерные карманы. Митохондрии нередко принимали необычную форму с продольной ориентацией крист.

Таким образом, по сравнению с нормой лимфоциты лимфы коров, больных различными формами лейкоза, имеют определенные отличия, заключающиеся в изменении количества отдельных структур: полирибосом, мембран ретикулума, клеточных отростков и появление органелл, которые не выявлялись в нормальных лимфоцитах: миелиновые структуры, ядерные карманы, ядерные тельца, кристаллоидные тельца, канальцевые структуры. Важнейшим признаком злокачественности клеток является полиморфизм, который наиболее ярко выражен при гема-тосаркомах.