Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Заболеваемость холерой, входящей в группу карантинных инфекций с диа-рейным синдромом, регистрируется на всех континентах мира. В 1961 г. началась седьмая пандемия холеры Эль-Тор, которая по продолжительности во времени и числу охваченных стран превышает каждую из шести предшествующих [Москви-тина Э.А. с соавт., 2003]. Сведения о регистрации на территории России в 19 992 002 гг. крупных эпидемических вспышек (Дальний Восток, 1999; Казань, 2001) и спорадических случаев холеры (Челябинск, 2000; Волгоград, 2001; Калмыкия, 2002) [Онищенко Г. Г., 2000, 2002; Москвитина Э. А. с соавт., 2003] обусловливают большой интерес микробиологов и эпидемиологов к этой инфекции. Кроме того, благодаря уникальной вариабельности своего генома, холерный вибрион является идеальной моделью для изучения механизмов эволюции патогенных свойств возбудителей особо опасных инфекций [Кутырев В.В., Смирнова Н. И., 2003].

Холерные вибрионы могут обитать как в природных экосистемах, так и в организме человека. Для существования в двух таких разных экологических нишах возбудитель холеры должен обладать набором генов, которые обеспечивают ему выживаемость как во внешней среде, так и в организме хозяина, обуславливая его патогенность [Бароян О.В., 1971; Faruque S.M. et al., 1998; Литвин В. Ю. с соавт., 2001; Ali М. et al., 2002; Faruque S.M., Nair G.B., 2002]. Полученные в последние 57 лет данные указывают на то, что гены, обеспечивающие жизнеспособность этого микроорганизма, локализованы на эволюционно древних участках большой хромосомы и называются генами жизнеобеспечения (housekeeping genes) [Trucksis М. et al., 1998; Heidelberg J.F. et al., 2000]. Кроме того, в геноме V. cholerae присутствуют мобильные генетические элементы или МГЭ (профаги, «острова патогенности»), которые холерный вибрион приобрел в процессе эволюции. К настоящему времени известно, что хромосома эпидемически опасных штаммов V. cholerae содержит как минимум 4 «блока вирулентности»: профаг СТХф с генами холерного токсина (CT), вызывающего развитие основного симптома при холере — профузную диарею [Waldor М. К., Mekalanos J. J., 1996; Chiang S.L., Mekalanos J.J., 1998; Iida T. et al., 2002; Davis B.M., Waldor M.K., 2003]- «остров патогенности» (ОП) VPI, несущий кластер генов, кодирующих биосинтез основного фактора колонизации — токсин-корегулируемые пили адгезии (TCP) [Karaolis D.K.R. et al., 1998, 1999; Смирнова Н. И., 1999]- недавно открытый второй ОП VPI-2 с генами, отвечающими за синтез нейраминидазы, усиливающей действие холерного токсина [Jermyn W.S., Boyd E.F., 2002] и профаг RS 1 ф, присутствующий у всех вирулентных вибрионов эльтор [Faruque S.M., Asadulghani et al., 2002; Davis B.M., Waldor M.K., 2003]. Кроме того, геном эпидемически опасных и непатогенных холерных вибрионов содержит ОП с генами Ol-антигена [Stroeher U.H. et al., 1998] и «остров персистенции» с генами маннозо-чувствительных пилей адгезии, участвующих у эльтор вибрионов в образовании биопленки, защищающей их от неблагоприятных воздействий окружающей среды [Marsh J.W., Taylor R.K., 1999; Смирнова Н. И., Лозовский Ю. В., 2003]. Таким образом, для генома возбудителя холеры характерна модульная организация, обуславливающая генетическую гетерогенность этого микроорганизма. Благодаря использованию современных молекулярно-биологических методов исследования стало возможным изучение молекулярно-генетических свойств штаммов V. cholerae биовара эльтор, вызвавших различные вспышки холеры, а также выяснение механизма эволюции этого патогена. Тем не менее, до сих пор имеются лишь отдельные сведения о структуре генома вирулентных штаммов, выделенных во время массовых заболеваний холерой на территории бывшего СССР (19 701 975гг.). Недостаточно также данных о том, как изменился состав генов вирулентности у штаммов, изолированных впоследствии в межэпидемический период от вибрионосителей и из объектов внешней среды на географически удаленных друг от друга территориях с разными климатическими и экологическими условиями. Кроме того, среди штаммов V. cholerae имеется значительная доля атипичных по патогенным свойствам изолятов, которые часто выделяются из воды поверхностных водоемов, и при определенных условиях могут вызывать спорадические заболевания холерой у людей [Rodrigue D. С., et al., 1994; Coehlo A.J. et al., 1995; Saha P. et al., 1996; Pal A. et al, 1999; Ратникова Л. И., Кузьмина Н. Я., 2002; Марамович A.C. с соавт., 2003; Москвитина Э. А. с соавт., 2003; Pichel M., et al., 2003]. Определение эпидемической значимости таких штаммов нередко затруднено. Более того, возникает вопрос, существует ли эволюционная связь между типичными и атипичными штаммами V. cholerae и какова степень их генетического родства между собой. Для получения ответа на указанные вопросы существует целый ряд методов молекулярного типирования: рестрикционный анализ хромосомной ДНК вибрионов, основанный на феномене полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ДНК-дактилоскопия, риботипирование, пульс-электрофорез) и полимофизма длин ам-плифицированных фрагментовгенотипирование штаммов по характеру распределения в геноме вариабельных тандемных повторов — VNTRПЦР с использованием произвольных (универсальных) праймеровсеквенирование геномов или фрагментов генов [Гинцбург А.Л. с соавт., 1988; Stull T.I. et al, 1988; Olive D. M., Bean P.,.

1999; Момыналиев К. Т., Говорун В. М., 2000; Шагинян И. А., 2000; Водопьянов С. О. с соавт., 2001]. Вместе с тем информативность разных методов генотипирова-ния неодинакова, в связи с чем возникает необходимость выбора наиболее оптимального метода (или методов), которые смогут обеспечить проведение более эффективных мониторинговых исследований. Таким образом, «генные портреты» штаммов V. cholerae и их молекулярное типирование позволят решить вопросы о клональности различных штаммов, вызвавших вспышки холеры на различных территориях и в разное время, а также о степени их генетического родства с вибрионами, обитающими в объектах внешней среды.

Несмотря на несомненные достоинства молекулярно-биологических методов исследования, они достаточно сложны и дорогостоящи и пока не нашли широкого применения в практической работе Центров Госсанэпиднадзора. В этой связи работа многих исследователей была направлена на создание других более простых и доступных, но также информативных методов для определения эпидемической значимости вибрионов. В настоящее время в практике эпидемиологического надзора за холерой широкое применение нашел метод, позволяющий дифференцировать холерные вибрионы биовара эльтор на 3 группы (эпидемически опасные, эпидемически безопасные и штаммы с неустановленной эпидемической значимостью) на основании избирательного литического действия диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx+ и ctx~~, полученных в РосНИПЧИ «Микроб» Н. М. Остроумовой с соавт. в 1996 г., и данных о гемолитической активности штаммов. [Ко-кушкин A.M. с соавт., 1998; Смирнова Н. И. с соавт., 2001]. В результате государственных испытаний новых холерных фагов на 570 штаммах V. cholerae биовара эльтор установлено, что фаг ctx+ более чем в 80% случаев лизирует штаммы, содержащие гены ctxAB и не продуцирующие гемолизин. В то же время, почти в 12% случаев к этому фагу чувствительны и штаммы, лишенные генов СТ [Анисимова Т.И. с соавт., 2000]. Вместе с тем в последние годы появились сообщения о выявлении фагорезистентных культур холерных вибрионов эльтор, что ставит под сомнение диагностическую ценность фагового теста [Казакова Е.С. с соавт., 1995; Подосинникова JI.C. с соавт., 1995; Онищенко Г. Г. с соавт., 2000, 2002; Зиатдинов В. Б., 2002]. В связи с этим, встает вопрос о том, какой набор генов вирулентности имеют в хромосоме штаммы, имеющие различную эпидемическую значимость по данным фагового теста. Получение ответа на этот вопрос позволит получить новые фундаментальные знания о структуре генома природных штаммов вибрионов эльтор и ее влиянии на взаимоотношения между бактериальной клеткой и фагом, а также оценить эффективность фагового метода при определении эпидемической значимости штаммов V. cholerae биовара эльтор.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ — сравнительный анализ структуры генома штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных, от больных, вибрионосителей и из объектов окружающей среды на разных территориях.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. С помощью комплексного ПЦР-тестирования 13 различных генов и генных «блоков» выявить различия в структуре генома штаммов V. cholerae биовара эльтор, изолированных от больных, носителей и из объектов окружающей среды на территории Поволжья и Туркменистана.

2. Выявить закономерность изменения генома штаммов холерного вибриона эльтор, обитающих в воде открытых водоемов и организме носителей в межэпидемический период.

3. Провести ПЦРи риботипирование штаммов У. скокгае биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Поволжья и Туркменистана, с целью выявления их генетического родства.

4. Изучить молекулярно-генетические особенности атипичного штамма У. ско1егае биовара эльтор, выделенного от больного холерой.

5. Провести сравнительный анализ эффективности фагового метода (фаги йх+ и с1х~) и ПЦР при дифференциации штаммов У. ско1егае биовара эльтор по эпидемической значимости.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Для выяснения структуры генома холерных вибрионов с различной эпидемической значимостью впервые проведен комплексный ПЦР-анализ 186 штаммов У. ско1егае биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Поволжья и Туркменистана в эпидемически благополучные и неблагополучные по холере годы. Выявлено присутствие (или отсутствие) 13 генов, расположенных как на эволюционно древней части хромосомы (гены жизнеобеспечения), так и на пяти МГЭ, выполняющих различные функции. Установлено, что клинические штаммы и ряд изолятов, выделенных от носителей во время вспышек холеры, представлены генетически однородной популяцией и содержат набор всех тестируемых генов, относящихся как к стабильным генам жизнеобеспечения (карА, ШхЯ, ггхА), так и генам патогенности и персистенции, расположенным на МГЭ: СТХф (сША, ю^ асе), RS 1 ф (rstC), VPI (tcpA, aldA, toxi), EPI (mshQ), VPI-2 (nanH), а также последовательности attRS. Вибрионы, изолированные в межэпидемический период из воды поверхностных водоемов и от вибрионосителей, характеризуются выраженной вариабельностью генома за счет утраты различных по размерам и функциям фрагментов ДНК. Показано, что процесс потери генов имеет определенную последовательность. Наиболее нестабильными являются гены вирулентности, входящие в состав профагов СТХф и RSl.

Приоритетное значение имеют данные рибои ПЦР-типирования 29 штаммов V. cholerae биовара эльтор с различной эпидемической значимостью, выделенных на территории Поволжья и Туркменистана, с целью изучения генетического родства между ними. Показано, что использованные методы молекулярного типи-рования позволяют дифференцировать холерные вибрионы эльтор на три группы: эпидемически опасные, авирулентные и нетоксигенные штаммы, сохранившие часть генов вирулентности. Установлено, что вибрионы последней группы имеют генетическое родство как между собой, так и с вирулентными штаммами.

Получены новые сведения относительно фенотипических и молекулярно-генетических свойств атипичного штамма V. cholerae биовара эльтор, вызвавшего единичный случай заболевания холерой в 2000 г. В экспериментах на модельных животных показано, что штамм нехолерогенен, но продуцирует ряд ферментов па-тогенности (гемолизин, фосфолипазу, растворимую гемагглютинин/протеазу). На основании данных ПЦР-анализа определен генотип этого штамма (ctxA~ zof асе~ sf tcpA~ toxT aldA' rstC nanFT attRS? toxR+hapA+rtxA+mshQ+), подтверждающий его эпидемическую безопасность. В результате ПЦР-типирования с двумя «случайными» праймерами установлено, что по структуре генома данный штамм отличается как от вирулентных, так и от нетоксигенных эльтор вибрионов.

Впервые получены сведения о присутствии генов hap A, ctxA, tcpA и toxR, генетических маркеров эпидемически опасных штаммов, в хромосоме 142 штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на территории Поволжья, Дагестана, Туркменистана, Узбекистана, Сибири и Приморья в период с 1965 по 2002 гг., эпидемическая значимость которых была определена фаговым методом. Установлено, что результаты фагового теста и ПЦР-анализа при оценке эпидемической значимости 460 штаммов холерных вибрионов биовара эльтор совпадают в 97% случаев, что указывает на высокую диагностическую ценность холерных бактериофагов ctx+ и ctx~. Лизис фагом ctx+ в 93,8% случаев штаммов, содержащих ген tcpA, позволяет полагать, что пили TCP могут служить рецептором для данного фага.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

По результатам работы составлены методические рекомендации: «Мультиплексный ПЦР-анализ для идентификации штаммов Vibrio cholerae eltor и определения их эпидемической значимости» и «Риботипирование штаммов Vibrio cholerae», которые одобрены Ученым Советом (протоколы № 7 от 3 июля 2002 г. и № 9 от 18 декабря 2003 г.) и утверждены зам. директора Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» три штамма V cholerae биовара эльтор с различным набором основных генов патогенности ctxA, tcpA, toxR и неодинаковой чувствительностью к новым холерным диагностическим бактериофагам ctx+ и ctx~, а также шесть штаммов V. cholerae биовара эльтор, имеющих различные генотипы по данным ПЦР-тестирования 13 генов патогенности. Указанные штаммы могут быть использованы в прикладных и фундаментальных исследованиях.

Данные о структуре генома 186 штаммов Кско1егае биовара эльтор с различной эпидзначимостью предназначены для использования Государственной коллекцией патогенных бактерий «Микроб» при молекулярно-генетической паспортизации штаммов, циркулирующих на разных территориях России.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Геном клинических штаммов ?.ско1егае биовара эльтор, выделенных на разных территориях и в различные годы, стабилен и содержит три ПЦР-тестированных гена жизнеобеспечения (карА, 1охЯ, гЬсА), девять генов вирулентности (с1хА, асе, г$ 1С, рА, аЫА, 1охТ, папН, тякО), входящих в состав мобильных генетических элементов, а также нуклеотидную последовательность аиЛБ.

2. В водной экосистеме геном значительной части популяции вирулентных клонов претерпевает изменения за счет утраты различных фрагментов ДНК, кодирующих продукцию ключевых факторов патогенности. Делеции генных блоков происходят в определенной последовательности: СТХф (с (хА, zot, асе) и ЫБЦ (гя [С) -> УР1 (1срА, аША, ШТ) -> УР1−2 (папН).

3. Геном «водных» вибрионов содержит гены жизнеобеспечения (НарА, ШЯ, ША) и, в ряде случаев, гены «острова персистенции» (тзкО) и нуклеотидную последовательность айЯБ. Значительные различия между геномами у вирулентных и «водных» вибрионов исключают возможность приобретения последними генов патогенности.

4. По данным рибои ПЦР-типирования эпидемические штаммы холерных вибрионов, выделенные от больных во время разных вспышек холеры на территории Туркменистана и Поволжья, имеют клональное происхождение. Обнаруженные нетоксигенные вибрионы эльтор, сохранившие ряд генов вирулентности, имеют генетическое родство с эпидемически опасными штаммами, тогда как «водные» вибрионы представляют самостоятельную гетерогенную популяцию.

5. Атипичный штамм У. ско1егае биовара эльтор, выделенный от больного холерой в Челябинске (2000 г.), имеет генотип: сйсА~ гоГ асе~ яГ 1срА~ гохТ аША папН~ ШС аиЯБ+ гохЯ+ карА+ НхА+ тяИО*, подтверждающий его эпидемическую безопасность. По данным генотипирования указанный штамм не имеет сходства ни с клиническими, ни с нетоксигенными вибрионами, выделенными из воды открытых водоемов. Тем не менее, при условии резко сниженного иммунитета у макроорганизма, штаммы холерного вибриона, лишенные ключевых факторов патоген-ности, могут вызывать холерогенный синдром за счет активной продукции дополнительных токсинов (гемолизин, ЯТХ-токсин).

6. Сравнительная оценка диагностической ценности ПЦР и холерных бактериофагов с! х+ и с! х~, проведенная при анализе 460 различных штаммов У. ско1егае биовара эльтор, указывает на высокую эффективность простого и дешевого метода, основанного на использовании холерных диагностических фагов йх+ и с1х, при определении эпидемической значимости эльтор вибрионов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2001, 2002, 2003) — Проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (Ростов-на-Дону, 2002) — научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (Москва, 2002) — 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003).

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

ВЫВОДЫ.

1. Клинические штаммы V. cholerae биовара эльтор, выделенные в разные годы на территории Поволжья и Туркменистана, являются генетически однородной группой. Их геном содержит следующие 13 ПЦР-тестированных генов: стабильно наследуемые гены жизнеобеспечения (hapA, toxR, rtxA), нуклеотидную последовательность attRS, а так же расположенные на мобильных генетических элементах гены патогенности и персистенции — СТХф (ctxA, zot, асе), КБ1ф (rstC), VPI (tcpA, aldA, toxT), VPI-2 (nanH), EPI (mshQ).

2. В межэпидемический период в природных экосистемах циркулируют штаммы, отличающиеся друг от друга по структуре генома: 1) единичные вирулентные (3,6%), 2) производные вирулентных штаммов, утратившие лишь отдельные гены и (или) генные блоки патогенности (20,7%), и 3) «водные» вибрионы, содержащие в хромосоме гены жизнеобеспечения, а также в ряде случаев гены персистенции и нуклеотидную последовательность attRS (75,7%).

3. Существует определенная закономерность в изменении генома неэпидемических штаммов, являющихся производными вирулентных за счет делеции различных фрагментов ДНК. Утрата «блоков» вирулентности происходит в следующей последовательности: СТХф (ctxA, zot, асе) и RS^ (rstC) —>• VPI (tcpA, aldA, toxT) —" VPI-2 (nanH).

4. Результаты риботипирования с зондом на 16S рРНК и ПЦР-типирования с праймерами на вариабельный тандем ДНК бактериофага М13 и «универсальным» праймером 1281 позволяют дифференцировать вирулентные штаммы, их производные и «водные» вибрионы эльтор. Клинические штаммы V. cholerae биовара эльтор, вызвавшие эпидемические вспышки холеры в Поволжье и Туркменистане в.

1969;1975 гг., имеют клоиальиое происхождение и генетически родственны с не-токсигенными вибрионами, сохранившими часть генов вирулентности. Авирулент-ные «водные» вибрионы по данным генотипирования отличаются от штаммов двух указанных групп и представлены гетерогенной популяцией.

5. Установленный генотип атипичного штамма У. ско1егае биовара эльтор, выделенного от больного холерой в Челябинске в 2000 г. (ЫхА~ гоГ асе~ яГ (срА~ ШТ аМА гя^ папН~ аМЯЗ+ Г<�хсЯ+ кар А+ г1хА+ тякО^) подтверждает его эпидемическую безопасность. По данным ПЦР-типирования с двумя «универсальными» праймерами указанный штамм не имеет генетического родства с вирулентными и нетоксигенными эльтор вибрионами.

6. Результаты определения эпидемической значимости 460 штаммов У. ско1егае биовара эльтор, изолированных на территориях Поволжья, Дагестана, Туркменистана, Узбекистана, Сибири и Приморья (с 1965 по 2002 гг.), с помощью ПЦР-тестирования видоспецифического гена карА и ключевых генов вирулентности ОхА, ЩзА, ШЯ в 97,0% случаев совпадают с данными метода, основанного на использовании бактериофагов диагностических холерных эльтор с1х+ и что подтверждает высокую диагностическую ценность последних.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Возбудитель холеры характеризуется уникальной вариабельностью генома, которая обусловила появление в процессе его эволюции различных патогенных клонов, отличающихся между собой по ряду важнейших фенотипических и генетических свойств [Кутырев В.В., Смирнова Н. И., 2003]. В процессе изучения структуры генома было обнаружено, что значительная часть генов патогенности у V. cholerae расположена на МГЭ различного филогенетического происхождения. Такая модульная организация генома возбудителя холеры, как и других патогенных бактерий, указывает на то, что основной механизм его эволюции — как приобретение через горизонтальный перенос генов различных «блоков вирулентности» и эпидемичности (ОП и профагов), так и потеря их. Эволюционный успех возбудителя седьмой пандемии холеры, по видимому, определен более удачной комбинацией в его геноме различных МГЭ, продукты которых обеспечили ему как выживаемость во внешней среде, так и более быстрое распространение за пределы эндемичного очага и укоренение на других территориях. С помощью современных мо-лекулярно-биологических методов исследования показано, что эволюционные преобразования возбудителя холеры продолжаются и в настоящее время. Так, отмечено широкое распространение среди клинических штаммов интегронов с кассетами генов резистентности к антибиотикам, что свидетельствует об эволюционной адаптации возбудителя холеры к лекарственным препаратам [Dalsgaard A. et al, 1999; Chakraborty S. et al., 2001; Folgosa E. et al., 2001; Chhotray G.P. et al., 2002; Марамо-вич А.С. с соавт., 2003]. В 2002 г. впервые описан новый вариант вибрионов эльтор, выделенных в 1991;1994 гг. от больных холерой, которые имели ряд фенотипических (чувствительность к полимиксину, резистентность к диагностическим фагам и т. д.) и генотипических (структура генов tcpA и rstC) признаков V. cholerae классического биовара [Nair G.B. et al, 2002]. Использование относительно новых методов молекулярного типирования (AFLP, MLST, PFGE), характеризующихся высокой разрешающей способностью, позволило выявить генетическую неоднородность как патогенных клонов V. cholerae биовара эльтор, выделенных в период седьмой пандемии на географически разобщенных континентах [Jiang S. С. et al, 2000; Lan R., Reeves P., 2002], так и штаммов различных серогрупп, циркулирующих в природных водоемах [Singh D.V. et al, 2001; Kotetishvili M. et al, 2003; Li M. et al, 2003; Thompson F.L. et al, 2003]. Что касается молекулярно-генетических свойств вирулентных вибрионов эльтор, вызвавших массовые заболевания холерой на территории бывшего СССР в начале 70-х гг. прошлого столетия, а также штаммов, изолированных в межэпидемический период, то к настоящему времени получены лишь сведения о распространении в их геноме четырех генов: видоспецифи-ческого гена hapA и трех генов вирулентности — ctxA, tcpA и toxR. [Смирнова Н.И. с соавт., 2001; Челдышова Н. Б., 2002]. До начала нашей работы более глубокие исследования структуры генома различных штаммов холерного вибриона не проводились. В этой связи одной из основных задач нашего исследования явилось изучение молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных от больных холерой, вибрионосителей, а также из объектов внешней среды на двух географически удаленных друг от друга территориях — в Поволжье (1970;2002 гг.) и в Туркменистане (1965;1987 гг.). С помощью разработанных нами мультилокус-ных ПЦР в геноме 186 исследуемых штаммов было определено присутствие двух групп генов. В первую группу входило три стабильно наследуемых гена жизнеобеспечения, расположенных на эволюционно древней части хромосомы [Мохоп.

E.R. et al, 1994]: видоспецифический ген hapA [Finkelstein R.A. et al, 1992; Kimsey H.H. et al, 1998; Челдышова Н. Б. с соавт., 2000; Смирнова Н. И. с соавт., 2001; Benitez J.A. et al, 2001; Zhu J. et al, 2002], rtxA [Lin W. et al, 1999; Chow K.H. et al, 2001] и глобальный регуляторный ген toxR [Смирнова Н.И. 1999; Merrell D.S. et al, 2001, Wang S.Y. et al., 2002]. Вторая группа включала ключевые гены патогенности и персистенции, локализованные на МГЭ, которые холерный вибрион приобрел в процессе эволюции: гены коровой области профага СТХфctxA, zot, асе, кодирующие биосинтез различных токсинов [Waldor M.K. et al, 1996; Kimsey H.H. et al, 1998; Heilpern A.J. et al, 2000], ген rstC профага RS1(|) [Davis B.M. et al, 2002; Faru-que S.M. et al, 2002], генетические маркеры двух ОП: VPI (структурные гены tcpA, aldA и регуляторный toxT) [Karaolis D.K.R. et al., 1998; O’Shea Y.A. et al., 2002; Fa-ruque S.M., Zhu J. et al., 2003] и VPI-2 (nanH) [Jermyn W.S., Boyd E.F. et al., 2002], a также ген mshQ «острова персистенции» [Marsh J.W., Taylor R.K. et al., 1999; Torna С. et al., 2002]. Кроме того, мы выяснили присутствие в геноме изучаемых штаммов последовательности attRS, которая служит сайтом для внедрения в хромосому профагов СТХф и RS^ [Iida T. et al, 2002; Davis B.M., Waldor M.K., 2003].

В результате проведенных экспериментов показано, что геном штаммов, изолированных от больных и ряда носителей во время эпидемий холеры как в Поволжье, так и в Туркменистане был стабилен и содержал набор всех 13 тестируемых генов и генных «блоков»: hapA, toxR, rtxA, СТХф (ctxA, zot, ace), RSl^ (rstC), VPI (tcpA, aldA, toxT), VPI-2 (nanH), EPI (mshQ), attRS. Выявленная закономерность может служить указанием на то, что холерному вибриону для развития инфекционного процесса в организме хозяина (человека) необходимы продукты всех указанных генов. Только в присутствии в хромосоме ключевых и второстепенных генов вирулентности этот патоген приобретает способность противостоять защитным системам макроорганизма, заселять тонкий кишечник и размножаться там, вызывать развитие клинических симптомов при холере. Мы пока не знаем, является ли такое сочетание генов и генных блоков в хромосоме холерных вибрионов вполне достаточным для развития эпидемии или вспышек холеры. Для ответа на этот вопрос необходимы дополнительные исследования. Тем не менее, выявленная стабильность генома клинических штаммов, выделенных на разных территориях, позволяет говорить о ее адаптивном характере, обеспечивающим вибрионам возможность существовать в организме хозяина.

Особый интерес для нас представляло обнаружение клинического штамма с фенотипическими (не агглютинировал куриные эритроциты) и генотипическими (структура гена tcpA,) свойствами вибрионов классического биовара, тем более, что штаммы с признаками возбудителя обоих биоваров описаны ранее другими исследователями [Nair G.B. et al., 2002]. Выявленные особенности в структуре генома указанного штамма, а также наличие в его хромосоме неполноценного профага СТХф, сохранившего лишь гены токсинов Zot и Асе, подтверждают большую роль горизонтального переноса генов и рекомбинационных событий в эволюции этого патогенна. Что касается штаммов эльтор вибрионов, выделенных из объектов внешней среды в эпидемически неблагополучный период, примерно 50% популяции как в Поволжье, так и в Туркменистане было представлено вирулентными вибрионами, имеющими в геноме все тестируемые гены. Остальная часть изученных штаммов состояла из авирулентных клонов, в хромосоме которых присутствовали лишь гены жизнеобеспечения, attRS-сайт (в 86% случаев) и «остров персистенции» (у 47% изолятов). Таким образом, по данным ПЦР-анализа существенных различий между штаммами, выделенными во время вспышек холеры на территории Поволжья и Туркменистана, не обнаружено.

Смена эпидемического периода на межэпидемический, по мнению многих исследователей, не сопровождается полным исчезновением холерных вибрионов, поскольку этот вид способен в определенных условиях существовать вне организма хозяина, т. е. в водных экосистемах. Длительное пребывание вибрионов во внешней среде порождает много вопросовизменяется ли структура генома вирулентных вибрионов при смене экологической ниши и каким образом, какова граница вариабельности генома вибрионов эльтор, каково соотношение вирулентных и типичных «водных» вибрионов в популяции? Безусловно, мы не можем дать исчерпывающего ответа на эти важные для эпидемиологов вопросы. Тем не менее в пределах нашего экспериментального материала мы попытались проанализировать события, происходящие с вибрионами в этот период. При анализе 111 изолятов, выделенных из воды поверхностных водоемов в Туркменистане и Поволжье выявлено три группы штаммов: 1) вирулентные вибрионы, которые сохраняются в межэпидемический период, хотя доля таких штаммов в общей популяции вибрионов, циркулирующих в водной экосистеме невелика (3,6%) — 2) нетоксигенные вибрионы, производные вирулентных, поскольку в их геноме сохранился ряд генов вирулентности, относящихся к генетическим маркерам эпидемически опасных штаммов. Так, 78,2% из них имели VPI, в геноме ряда штаммов присутствовал неполноценный СТХф, утративший гены ctxAB, но сохранивший zot и асе. Более того, в геноме всех указанных штаммов присутствовал VPI-2 (папН), который в настоящее время стал считаться еще одним генетическим маркером эпидемически опасных штаммов [Jermin W.S., Boyd E.F., 2002]- 3) непатогенные «водные» вибрионы эльтор, составившие значительную часть популяции (75,7%), в хромосоме которых присутствовали лишь гены жизнеобеспечения, attRS-сшт (у 71,4% штаммов), а из МГЭ — «остров персистенции» (в 58,3% случаев). Из-за неоднородности условий существования холерных вибрионов на двух исследуемых территориях, были выявлены заметные различия в структуре их генома. Оказалось, что штаммов, производных от эпидемически опасных вибрионов, в Туркменистане обнаружено значительно больше (32%), чем в Поволжье (7,5%), при этом геном 80,6% из них содержал VPI с генами основного фактора колонизации, что полностью согласуется с полученными ранее результатами ПЦР-анализа [Челдышова Н.Б., 2002] и данными эпидемиологов о развитии в 70−80 гг. на территории Туркменистана своеобразного эпидемического процесса, характеризующегося выделением из объектов внешней среды слабовирулентных холерных вибрионов и высоким уровнем вибрионоси-тельства [Анисимов П.И. с соавт., 1981].

Редукционный характер изменчивости генома вибрионов, обитающих в водной среде, свидетельствует о том, что микроорганизмы используют все возможные молекулярные механизмы, чтобы их геном освобождался от последовательностей ДНК, ненужных для жизни клетки в водных экосистемах. Маловероятно, что такие преобразования генома холерных вибрионов вредны для них. Скорее всего вибрионы в водной среде подвергаются действию какого-то отбора, направленного на освобождение их генома от генов и генных блоков, не нужных им для существования в этой экологической нише.

В рамках проведенной работы встает также вопрос о предельно допустимом уменьшении размера генома холерных вибрионов эльтор. Обнаружены вибрионы, которые, по-видимому, утратили достаточно протяженные фрагменты ДНК — профаги СТХф (7,0 т.п.н.) и RS1<|> (2,7 т.п.н.), VPI (39,5 т.п.н.), VPI- 2 (57,3 т.п.н.), EPI (16.7 т.п.н.), attRS (18,0 п.н.), rtx (около 4,0 т.п.н.), toxR (около 1,0 т.п.н.). В этой связи чрезвычайно интересно проследить, может ли у этих вибрионов происходить увеличение генома в процессе приобретения ими указанных или новых генов и каковы биологические последствия этих событий на каждом этапе формирования клона с определенными свойствами.

Таким образом, анализ полученных данных о составе тестируемых генов в хромосоме изучаемых штаммов указывает на четкие отличия в наборе генов и генных блоков между клиническими и непатогенными штаммами, обитающими в водной среде. Клиническим штаммам свойственны две общие черты, определяющие их принадлежность к патогенным бактериям:

1 .Поскольку эти вибрионы могут существовать не только в организме хозяина, но и вне его, то их геном, как и других «свободноживущих» бактерий, содержит набор генов, продукты которых обеспечивают метаболическую возможность адаптироваться к условиям обитания в водной среде. К такому типу относят гены жизнеобеспечения hapA, toxR, rtxA, а также «остров персистенции».

2. Вторая черта клинических штаммов связана с наличием в их геноме специфических МГЭ, контролирующих синтез факторов вирулентности. К их числу относят два профага — СТХф, RS^ и два «острова патогенности" — VPI, VPI-2, без которых реализация типичного инфекционного процесса при холере невозможна.

Уникальность клинических штаммов состоит еще и в стабильном наследовании ими обеих групп генов. Очень велика вероятность того, что функция этих генов абсолютно необходима холерным вибрионам как для адаптации в организме хозяина, так и для проявления ими типичной патогенности. Однородность клинических штаммов по составу изучаемых генов, возможно, также обусловлена и относительно одинаковыми условиями их существования в данной экологической нише.

Что касается природных популяций холерных вибрионов, обитающих в воде открытых водоемов, то давно известно, что их главный и общий признак — огромная гетерогенность, обеспечивающая возможность адаптаций в этой разнородной среде обитания [Беляков В.Д., с соавт. 1996; Литвин В. Ю. с соавт., 1998, 2001; Ма-рамович А.С. с соавт., 2003].

Выявленная генетическая гетерогенность холерных вибрионов, циркулирующих в воде открытых водоемов в межэпидемический период, позволила выяснить общие закономерности в изменении структуры их генома, которые, видимо, носят адаптивный характер. На основании полученных данных установлено, что вирулентные вибрионы, попав в водную среду, в первую очередь утрачивают генетическую основу их вирулентности — весь СТХ-генетический элемент (в 66,7% случаев) или только гены ctxAB (у 18,5% штаммов), что не противоречит данным других исследователей о возможной делеции отдельных генов «кассеты вирулентности» [Kurazano Н. et al., 1995; Власов В. П. с соавт., 1999; Монахова Е. В. с соавт., 1999; Pourshafie M.D., et al, 2000; Челдышова Н. Б., 2002; Li М. et al., 2003]. Генетические перестройки в геноме профага СТХф, который у клинических штаммов включен в хромосому стабильно, с общебиологических позиций представляют самостоятельный интерес. Ранее было принято считать, что указанная «кассета вирулентности» неделима и входящие в ее состав гены ctxAB, zot и асе могут быть деле-тированы (или амплифицированы) как одна генетическая единица [Sears S.L. et al., 1996; Colombo M.M. et al., 1997]. Однако оказалось, что у ряда штаммов могут отсутствовать гены ctxAB. Избирательность утраты генов ctx, А В из профага СТХф вряд ли является случайным событием. Возможно, эти факты служат подтверждением высказанного предположения E.F. Boyd et al. (2000), что предшественником фага СТХф (или pre СТХф) мог быть бактериофаг с генами zot и асе, но без оперона ctxAB. И только впоследствии на каком-то этапе эволюции этот фаг приобрел гены ctxAB от неизвестного донора, которые при определенных условиях существования вибрионов становятся нестабильными.

Важно отметить, что утрата «кассеты вирулентности» сопровождается потерей другого «блока вирулентности» — профага Я81ф, который ограничивает СТХф с обеих сторон и присутствует у всех эпидемически опасных вибрионов эльтор. Следующий этап изменения генома вибрионов в природных водоемах связан с утратой или делецией второго абсолютно необходимого для реализации вирулентных свойств генного блока — «острова патогенности» (VPI), который оказался более стабильным, чем профаги, сохраняясь в геноме 85,2% вирулентных вибрионов и их производных. Вместе с тем обнаружены штаммы, содержащие дефектный VPI, лишенный гена tcpA, который кодирует биосинтез основной субъединицы пилей TCP, но сохранивший гены aldA, toxT. Вибрионы с генотипом ctxA~tcpA~ являются эпидемически безопасными, поскольку невозможна колонизация ими тонкого кишечника и развитие диареи. Тем не менее, определенная часть таких вибрионов ранее были вирулентными, так как в их геноме присутствует VPI-2, являющийся генетическим маркером эпидемических штаммов. Ген «острова персистенции» mshQ наследовался стабильно и присутствовал в хромосоме 96,3% штаммов. Что касается генов жизнеобеспечения {hapA, toxR, rtxA) и последовательности attRSl, то они наследовались в 100% случаев. Дальнейшее изучение структуры генома штаммов, полностью утративших все блоки вирулентности и поэтому отнесенных нами к третьей группе, генетически не связанной с вирулентными вибрионами, позволило выяснить, наиболее стабильными оказались видоспецифический ген карА и регу-ляторный ген ШЯ, которые имелись соответственно у 100% и 97,0% штаммов.

Выявленные отличия в структуре генома между изученными нами холерными вибрионами эльтор ставят вопрос об их генетическом родстве. Рибои ПЦР-типирование с использованием праймеров разной длины и с разным содержанием О+С (р8 и 1281) 29 модельных штаммов позволили нам провести анализ генетических взаимоотношений между эпидемическими и неэпидемическими штаммами холерного вибриона. Полученные данные указывают на то, что штаммы, выделенные от больных во время разных вспышек холеры, зарегистрированных на территории Туркменистана и Поволжья, представлены генетически однородной группой. Эти данные полностью совпадают с эпидемиологическими выводами о том, что эпидемия холеры, начавшаяся в 1970 г. на территории бывшего СССР, была вызвана одним вирулентным клоном холерного вибриона эльтор.

Наиболее интересными с общебиологических позиций оказались, на наш взгляд, данные генотипирования нетоксигенных вариантов, существующих в другой экологической нише — воде природных водоемов. Полученные сведения лишь частично подтверждают точку зрения ряда исследователей о том, что нетоксиген-ные варианты являются самостоятельной гетерогенной популяцией, представители которой не имеют генетического сходства как друг с другом, так и с эпидемически опасными штаммами [Гинцбург А.Л. с соавт. 1989; Грижебовский Г. М., 1997] и не могут приобрести профага СТХф. Показано, что такая группа авирулентных вибрионов действительно присутствует в водной популяции этих бактерий, характеризуясь заметно укороченным геномом за счет отсутствия в нем практически всех генов и генных блоков вирулентности (третья группа). Вполне вероятно, что такие вибрионы не способны к реконструкции к вирулентному варианту. Их происхождение остается пока неясным. В то же время параллельно с вибрионами этой группы обнаружены нетоксигенные вибрионы эльтор, сохранившие в геноме часть генов вирулентности, которые имели несущественные отличия в генетической организации от вирулентных вибрионов, выделенных от больных. Их сходство между собой по данным генотипирования, а также явное генотипическое родство с эпидемически опасными штаммами указывает на то, что эти штаммы являются производными вирулентных, утрата которыми профагов, либо острова патогенности является необходимым генетическим событием для их адаптации к существованию в водной экосистеме. Из части штаммов, сохранивших остров патогенности с генами основного фактора колонизации (ctxA~tcpA+aldA+tox7*) теоретически могут быть сформированы эпидемически опасные штаммы. Но мы пока не знаем конкретных условий и факторов, которые сделали бы это событие реальным и эпидемически значимым в природе, хотя в условиях эксперимента показана возможность превращения нетоксигенных штаммов в токсигенные в результате фаговой конверсии.

О том, что в качестве этиологического агента диарейных инфекций все чаще выступают авирулентные холерные вибрионы, свидетельствуют многочисленные публикации отечественных и зарубежных исследователей [Кюрегян А.А. с соавт., 2001, Хайтович А. Б. с соавт., 2001; Москвитина Э. А. с соавт., 2003: Rodrigue D. С., et al., 1994; Coehlo A.J. et al., 1995; Saha P. et al., 1996; Савельев B.H., 1998; Pal A. et al., 1999; Pichel M. et al., 2003]. В этой связи особый интерес для нас представляло получение данных о фенотипических и молекулярно-генетических свойствах нетоксигенного штамма V. cholerae биовара эльтор, выделенного в 2000 г. в Челябинске от больного, длительное время страдающего гормонозависимой бронхиальной астмой и гастритом со сниженной секреторной функцией. Результаты проведенного нами комплексного ПЦР-тестирования показали отсутствие у данного штамма не только генов ctxA, zot и асе, локализованных на профаге СТХф, но и гена st, отвечающего за продукцию термостабильного токсина, иногда встречающегося у штаммов V. cholerae биовара эльтор [Pal. A. et al., 1992; Ogawa A., Takeda Т., 1993; Dalsgaard A., Serichantalergs О., et al., 1995; Mallard K.E., Desmarchelier P.M., 1995; Sears C.L., Kaper J.B., 1996; Vicente A.C.P. et al., 1997; Singh D.V. et al., 2001]. Более того, его хромосома была лишена всех тестируемых МГЭ, связанных с вирулентностью (VPI, VPI-2, RS1([)) и содержала лишь гены жизнеобеспечения (rtxA, toxR, hapA), ген «острова персистенции» mshQ и последовательность attRS. Таким образом, анализ генотипических свойств штамма (ctxA~, zof, асе, st~, tcpA", toxT, aldAT, rstCT, nanlT, attRS+, toxR+, hapA+, rtxA+, mshQ+) указывает не только на его эпидемическую безопасность, но и неспособность вызывать единичные случаи холеры. Для получения ответа на вопрос, каким образом этот штамм, геном которого лишен всех известных «блоков вирулентности», смог вызвать острое инфекционное заболевание у человека, мы изучили его популяционный состав после заражения им крольчонка-сосунка и шести белых мышей, поскольку организм чувствительного животного или человека является селективной средой для накопления вирулентных клонов. Оказалось, что все 1140 колоний, изолированные после трехкратного пассажа через кишечник животных, продуцировали гемолизин, фософолипазу и растворимую гемагглютинин/протеазу, которые обладают цитотоксической активностью и способностью разрушать цитокины хозяина, участвующие в мобилизации защитных сил макроорганизма, но не смогли вызвать развитие инфекционного процесса. Кроме того, по данным ПЦР-типирования с использованием двух «универсальных» праймеров он не имел генетического родства ни с эпидемически опасными, ни с нетоксигенными вибрионами эльтор, изолированными в период с 1970 по 2002 гг. на различных территориях.

Хотя указанный штамм, выделенный от больного в Челябинске, эпидемически безопасен, тем не менее, нетоксигенные штаммы, вызывающие легкую или тяжелую форму холероподобных кишечных заболевания, все больше привлекают внимание исследователей, поскольку их важная роль, как этиологического агента диареи в последние годы стала очевидной. Так, в ряде стран (Индия, Бразилия, Аргентина) от больных с диареей были выделены генетически родственные группы нетоксигенных штаммов, которые получили название V. cholerae 01 «варианты» [Rodrigue D. С., et al., 1994; Coehlo A.J. et al, 1995; Saha P. et al., 1996; Савельев B.H., 1998; Pal A. et al., 1999; Pichel M. et al., 2003]. Молекулярное типирование показало, что структура генома нетоксигенных штаммов из Бразилии (амазонский вариант) была идентична. Одинаковую генетическую организацию имел ряд нетоксигенных штаммов из Аргентины. Но эти группы штаммов генетически отличались как между собой, так и от токсигенного клона, вызвавшего в Латинской Америке эпидемию холеры. Учитывая наличие сниженной антиферментной резистентности организма 61-летнего больного на фоне хронического гипосекреторного гастрита и длительного приема глюкокортикоидных гормонов, возникновение профузной диареи могло быть обусловлено действием дополнительных токсинов — гемолизина и RTX-токсина, механизм действия которых связан с формированием пор в цито-плазматической мембране клеток макроорганизма, а также нового токсина Саньяла, широко распространенного среди различных штаммов V. cholerae биовара эльтор [Saha S., Sanyal S.C., 1988; Singh D.V. et al., 1996, 2001; Монахова E.B. с соавт., 2001; Глянько Е. В., Власов В. П., 2003]. Мы не исключаем также, что развитие типичной для холеры клинической картины было вызвано еще не известными факторами патогенности, для выявления которых требуется проведение дополнительных исследований.

Несмотря на явные преимущества современных технологий при определении эпидемической значимости холерных вибрионов, что имеет первостепенное значение при решении вопроса о проведении противохолерных мероприятий, генодиагностические методы являются весьма дорогостоящими и в ряде случаев недоступными для практического здравоохранения. В связи с этим в работе практического здравоохранения широкое применение нашел более дешевый и простой в исполнении тест, основанный на использовании диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx+, ctx" и определении гемолитической активности. Высокая информативность данного метода при дифференциации эпидемически опасных и безопасных штаммов V. cholerae биовара эльтор была подтверждена работами многих исследователей [Анисимова Т.И. с соавт., 2000 г.- Омарова Б. К. с соавт., 2000; Кудря-кова Т.А. с соавт., 2001; Смирнова Н. И. с соавт., 2001; Манрикян М. Г. с соавт., 2003; Неъматов A.C. с соавт., 2003]. Между тем, до сих пор отсутствовала информация о том, какой набор генов вирулентности содержат в хромосоме штаммы, имеющие согласно фаговому тесту неодинаковую эпидемическую значимость и какова информативность этого метода по отношению к ПЦР. Для получения ответа на эти вопросы мы определили эпидемическую значимость 460 штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенных от больных, носителей и из объектов внешней среды на разных территориях (Поволжье, Дагестан, Туркменистан, Узбекистан, Сибирь и Приморский край) в период с 1965 по 2002 гг., с использованием фагового теста и ПЦР, и провели сравнительный анализ эффективности двух этих методов. На основании проведенных исследований установлено, что 97,8% штаммов, идентифицированных согласно фаговому тесту как эпидемически опасные, содержат все тестируемые гены (видоспецифический карА и гены вирулентности: ЫхА, /срА, ¡-охК). Что касается эпидемически безопасных штаммов, то 99,0% из них лишены генов с (хА, либо с (хА и Юр А, либо с1хА, ЮрА и /охК, из чего следует, что эти штаммы и по данным ПЦР-анализа не способны вызывать эпидемии или вспышки холеры. Полученные данные свидетельствуют о высокой диагностической ценности холерных бактериофагов и Этот вывод о целесообразности дальнейшего использования бактериофагов диагностических холерных эльтор и для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных и безопасных вибрионов имеет особо важное значение, поскольку у ряда исследователей [Онищенко Г. Г. с соавт., 2000, 2002; Зиатдинов В. Б., 2002] появились сведения о резистентности, в частности, клинических штаммов, выделенных во время вспышки холеры в Казани (2001 г.), к указанным фагам. В то же время, при комиссионной проверке в РосНИПЧИ «Микроб» в 2003 г. чувствительности 134 штаммов У. ско1егае биовара эльтор, изолированных в Казани (2001 г.), к фагам с1х+ и с1х~ было установлено, что 70,9% из них оказались чувствительными к фагу йх+ и, следовательно, эпидемически опасными. Сделанное ранее заключение об их устойчивости к названным фагам, возможно, было связано с неполным соблюдением требований по подготовке штаммов к экспериментам.

Обобщая изложенный материал, мы можем заключить, что использование комплексного ПЦР-анализа и трех различных методов молекулярного типирования позволило провести более глубокое исследование генома значительного количества штаммов ?.сИо1егае биовара эльтор, выделенных на различных территориях, и получить приоритетные данные, имеющие как фундаментальное, так и прикладное значение. Важным результатом наших исследований является также подтверждение высокой диагностической ценности холерных бактериофагов эльтор с1х+ и с! х— при оценке эпидемической значимости штаммов холерного вибриона эльтор, что указывает на необходимость его использования в работе практических учреждений здравоохранения.