Меченный фосфором-32 3 «-азидо-3» — дезокситимидин-5'-холинфосфат — ингибитор репликации ВИЧ, его получение и метаболизм в клетке

выводы.

1. Показано, что 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфат является депо-формой АЗТ, а образовавшийся в процессе внутриклеточного гидролиза холинфосфат участвует в клеточном метаболизме, включаясь в липиды.

2. Сравнительный анализ динамики проникновения в клетки НЬ-60 З'-азидо-З'-дезокситимидин-5'-холинфосфата и АЗТ показал, что после 8 ч инкубации внутриклеточная концентрация АЗТ, образовавшегося из З'-азидо-З'дезокситимидин-5'-холинфосфата, выше, чем при проникновении самого АЗТ.

3. Выявлены различия в динамике проникновения 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфата в микромолярных и наномолярных концентрациях.

4. Повышение анти-ВИЧ активности 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфата, очевидно, обусловлено не спецификой внутриклеточного метаболизма, а особенностью динамики проникновения в клетку.

5а. Разработан эффективный метод фосфорилирования первичных спиртов Рфосфорной кислотой с использованием ВгСК.

5Ь. Разработан метод синтеза 32Р-меченых фосфодиэфиров АЗТ.

4. Экспериментальная часть Материалы и методы.

В работе использовали 5 М BrCN в ацетонитриле, МСС и Н3РО4 (Merck), DCC, TCN, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота (Fluka). [32Р]-ортофосфорная кислота получена из Института реакторных материалов (Заречный, Свердловская обл.), AZT любезно предоставлен ассоциацией AZT (Москва). [3H]-AZT был синтезирован в Институте Молекулярной Генетики РАН (Москва). Сыворотка крови человека любезно предоставлена Гематологическим Научным Центром РАМН (Москва). Фосфолипазу С змеиного яда (Crotalus adamanteus), фосфодиэстеразу змеиного яда (Crotalus attrox) и 5'-нуклеотидазу змеиного яда (Crotalus attrox) (Sigma).

УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Shimadzu УФ-1201 (Япония). 'Н-ЯМР-спектры получены на спектрометре Bruker АМХ III-400 (400 МГц). 31Р-ЯМР-спектры — на том же приборе с рабочей частотой 162 МГц при подавлении фосфор-протонного спин-спинового взаимодействия с 85% Н3РО4 в качестве внешнего стандарта. ВЭЖХ осуществляли на хроматографе Gilson (Франция), с УФ-детектором тип 115 и проточным детектором радиоактивности тип 170, используя колонку (4×150 мм) Lichrosorb RP-18 (5 мкм), с градиентной элюцией в ион-парном режиме. Раствор А: 50 мМ ТЕАВ, раствор В: 75% этанол, скорость элюции 0,5 мл/мин. Элюция по программе: 0−5 мин (0% В), 5−10 мин (0->20% В), 10−30 мин (20-^30% В). Время удерживания соединения (2) — 14 мин, AZT — 20 мин, дифосфата (4) — 23 мин. Для ТСХ использовали пластинки Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) и элюирующие системы хлороформ-метанол 9 :1 (система А), диоксан-iPrOН-вода-25% водный NH3 3:3:3:1 (система В). Детектирование радиоактивных продуктов реакции проводили авторадиографически и с помощью Instant Imager Electronic Autoradiography (Packard Instrument Company, США). Количественный анализ реакционных смесей на пластинках ТСХ осуществляли на этом же приборе с использованием прилагаемого программного обеспечения.

Электрофорез выполняли в камере для горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле (60×30 мм), толщина геля 3−4 мм, электродный буфер 20 мМ однозамещенный фосфат натрия (рН 4,3). Напряжение 400 В, время разделения 10−12 мин. Выделение целевого продукта (2) проводили замораживанием геля при -18°С с последующим оттаиванием и отбором слоя жидкости. Соединения идентифицировали методом ВЭЖХ в условиях, описанных выше.

Общая методика синтеза 3'-азидо-2', 3'-дидезокситимидин-[5,-32Р]-фосфата { [32Р]-(2)} при активации ТРБСЛ, ТСГ*, БСС и МСС.

Раствор 10 мКи Нз32Р04 в 0,05 М НС1 (20−50 мкл в зависимости от объемной активности.

Нз РО4) вносили в 10 мМ водный раствор фосфорной кислоты (10 мкл), растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в 50% водном пиридине, раствор упаривали досуха и дважды переупаривали с абсолютным пиридином (2×20 мкл). Полученный остаток растворяли в 20 мкл абсолютного пиридина, добавляли 10 мкл 1 М раствора’А2Т в абсолютном пиридине и 10 мкл 0,1 М раствора соответствующего конденсирующего агента в пиридине. По окончании реакции (детекция ТСХ), растворитель удаляли в вакууме, остаток дважды соупаривали с 50 мкл воды, растворяли в 50 мкл воды, и продукт [ Р]-(2) выделяли с помощью ВЭЖХ. Выходы продукта (2): 28% в случае ТР8С1 (после повторной хроматографии), 15% в случае ТОЧ, 18% в случае БСС, 30% в случае МСС. Молярная радиоактивность 100 Ки/ммоль.

Н-ЯМР (Б20- 5, м.д.- У, Гц): 7,43 д (1 Н, У1, Н 6), 6,27 т (1 Н, /7,5, НГ), 4,4 (1 Н, м, НЗ'), 4,2 м (2 Н, Н5'), 4,07 м (1 Н, Н4'), 2,25 м (2 Н, Н2'), 1,88 д (3 Н, 31, 5-СН3).

31Р-ЯМР (Б20): 0,54 с.

Данные ЯМР-спектров приведены для образца соединения (2) с молярной радиоактивностью 0,1 Ки/моль.

Синтез 3'-азидо-2'3'-Дидезокситимидин-[5'-32Р]-фосфата { [32Р]-(2) } при активации ВКЖ.

Раствор

10 мКи Н3 РО4 в 0,05 М НС1 (20−50 мкл в зависимости объемной активности) вносили в 1 мМ раствор Н3РО4 (10 мкл), раствор упаривали в вакууме, остаток растворяли в 50% водном пиридине (20 мкл) и растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 5 М растворе ОМАР в воде (15 мкл), далее добавляли 2 М раствор К1Х в 5 М растворе БМАР в воде (10 мкл), затем вносили 2 мкл 5 М раствора ВгСИ в абсолютном ацетонитриле. По окончании реакции растворитель удаляли в вакууме, остаток дважды соупаривали с 50 мкл воды, растворяли в 50 мкл воды и продукт [32Р]-(2) выделяли с помощью ВЭЖХ. Выход составил 46%. Молярная радиоактивность 1000 Ки/ммоль.

Синтез 3'-азидо-2'3'-Дидезокситимидин- [5'-32Р]-холинфосфата {[32Р]- (1)}.

К 10 мКи Нз32Р04 в 0,5 мМ НС1 добавляли Н3Р04 (10 мкл 1 мМ раствора в воде) вносили 40 мкл ацетонитрила, растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 5 М растворе прирдина в воде (15 мкл), добавляли холиний иодид (1 мкмоль, 231 мкг) и реакционную смесь термостатировали 10 мин при 0 °C. Добавляли раствор 50 мМ ВгСЫ в ацетонитриле (6 мкл), и после 20 мин при 0 °C удаляли растворитель в вакууме. Остаток растворяли в 5 М растворе ОМАР в воде (20 мкл), вносили А.ЪТ.

1 мкмоль, 267 мкг) и 50 мМ раствор ВгСК в ацетонитриле (6 мкл). Через 10 мин добавляли 30% водный аммиак (10 мкл), через 20 мин раствор упаривали, а остаток переупаривали с водой (50 мкл). Остаток растворяли в 50 мМ ТЕАВ (50 мкл) и продукт выделяли методом ВЭЖХ. Выход продукта 18−20%, радиохимическая частота 99%, молярная активность 1000 Ки/ммоль. Я/(ТСХ, система В,): 0,6.

УФ: >.тах 266,3 нм (е = 8440) (рН 7,0, вода), Хта}Дтт 3,3.

Н-ЯМР (Б20- 8, м.д.- 7, Гц): 7,63д (1Н, 71 Гц, Н-6) — 6,20 т (1Н, У 6,5 Гц, Н-Г) — 4,43 дт (1Н, 76,5 и 11 Гц, Н-3') — 4,25 м (2Н, СНгО холин) — 4,12−4,04 м (ЗН, 2Н-5'+Н-4') — 3,61 м (2Н, СЩМ холин) — 3,16с (9Н, Ме3 холин) 2,47 т (2Н, У 6,5 Гц, Н-2') — 1,86 с (ЗН, Ме-ТЬу). 31Р-ЯМР (Б20- 5, м.д.- 7, Гц): -0,16 с.

13С-ЯМР (020- 5, м.д.- 7, Гц): 166,8, 151,9 (С-2 + С-4) — 137,7 (С-6) — 111,9 (С-5) — 85,4 (С-Г) — 83,1 д (7 8,5, С-4') — 66,3 тс (7МС 3,9, СН2К холин) — 65,4д (7 5,2, С-5') — 60,5 (С-3') — 59,8д (74,9, СН20 холин) — 54,3 тс (Тыс 3,7, Ме3 холин) — 36,5 (С-2') — 12,0 (Ме-ТЬу).

Синтез образцов сравнения:

Синтез 3'-азидо-2', 3'- дидезокситимидин-5'-фосфата (2):

Продукт (2) получали конденсацией 3'-азидо-2', 3'- дидезокситимидина с РОС1з в среде БМГ аналогично [73]. Выход 92%.

Синтез фосфамидов (5а) и (5Ь):

Фосфамиды (5) получали реакцией ОМАР или М1ш и ортофосфорной кислоты в Б МБ в присутствии избытков дипиридинилдисульфида и трифенилфосфина, как описано в [79]. Выход (5а) — 66%, (5Ь) — 51% в пересчете на ортофосфорную кислоту.

Синтез бис-(3'-азидо-2'3'- дидезокситимидин)-5'-дифосфата (4):

К раствору 10 мг (28,8 мкмоль) 3'-азидо-2', 3'- дидезокситимидин-5'-фосфата в 2 мл безводного Б МБ добавшш 12 мг (57,6 мкмоль) БСС, через 7 часов в реакционную массу добавили 2 мл воды и оставили на 2 ч при 0 °C. Выпавший осадок отфильтровали, супернатант упарили в вакууме, растворили в 0,5 мл воды и продукт выделяли методом ВЭЖХ в условиях, идентичных выделению монофосфата (2) используя колонку (25×300 мм) ЬюЬгоэогЬ ЯР-18 (5 мкм). Выход 68%.

Ферментативные эксперименты.

Нерадиоактивный диэфир (1) (50 мг) наносили на Боуех 50 в Н+ форме (колонка 50×200 мм), элюировали 10% водным аммиаком. Растворитель удаляли в вакууме и полученный нуклеотид растворяли в воде получая 114 мкМ раствор.

Гидролиз клеточным лизатом:

12−106 клеток НЬ60 суспендировали в 500 мкл 5 мМ ТРИС-НС1 (рН 7,5). После 4 циклов замораживания-оттаивания жидким азотом, суспензию осветляли центрифугированием (5 мин, 1000 §). В 50 мкл осветлённого клеточного лизата внесли 5 мкл 55 мМ раствора М§ СЬ в 500 мМ ТРИС-НС1 (рН 7,5), смесь термостатировали до температуры 37 °C и вносили 114 мкМ (1) (3,2 Ки/ммоль, 2 мкл). Итоговые концентрации: 4 мкМ (1) в 44 мМ ТРИС-НС1 буфере (рН 7,5) в присутствии 5 мМ М§-2+. Для анализа отбирали 2,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали в системе, А и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз гомогенатом клеточных мембран:

Осадок, образовавшийся при центрифугировании криолизованных 12−106 клеток НЬ60, суспендировали ультразвуком в 50 мМ ТРИС-НС1, содержащего 5 мМ М§-2+(100 мкл, рН 7,5). Суспензию термостатировали до 37 °C и вносили 114 мкМ (1) (4 мкл). Для анализа отбирали 5 мкл аликвоты с молярной активностью 3,7 Ки/ммоль, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз сывороткой крови человека:

100 мкл нормальной сыворотки крови человека термостатировали до 37 °C в течение 5 мин и вносили 4 мкл 114 мкМ (1) с молярной активностью 2,9 Ки/ммоль. Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, добавляли к 10 мкл метанола и суспензию осаждали центрифугированием 2 мин при 14 000 g. Супернатант концентрировали до объёма 4−5 мкл в вакууме, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз ферментами змеиного яда:

0,25 мг препарата змеиного яда растворяли в 50 мМ ТРИС НС1 буфера, содержащего 10 мМ Mg2+(200 мкл, рН 8,0). Раствор термостатировали до 37 °C в течение 5 мин и вносили 114 мкМ (1) (8 мкл) с молярной активностью 3,2 Ки/ммоль. Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз фосфодиэстеразой змеиного яда:

— 0,5 ед. активности фермента (по ди (п-нитрофенил)фосфату) растворяли в 50 мкл 50 мМ ТРИС-НС1 буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ Mg2+ и 0,11 М NaCl. Раствор термостатировали до 37 °C в течение 5 мин и вносили 114 мкМ (1) (2 мкл раствора в воде, 2,8 Ки/ммоль). Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз 5'-нуклеотидазой змеиного яда:

Фермент (1 ед. активности по л-нитрофенилфосфату) растворяли в 50 мМ ТРИС-НС1 буфере (50 мкл, рН 8,0), содержащего 10 мМ Mg2+ и 0,11 М NaCl. Раствор термостатировали до 37 °C в течение 5 мин и вносили 114 мкМ (1) (2 мкл раствора в воде, 3,2 Ки/ммоль). Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Клеточные эксперименты.

Клетки промиелоцитарного лейкоза человека (promyelocytic leukemia cells) HL-60 культивировали в среде RPMI — 1640 содержащей 2 мМ L-глутамин и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% СОг. При плотности.

1 млн. клеток/мл в культуральную жидкость добавляли исследуемый радиоактивный (1) с молярной активностью 4−5 Ки/ммоль и проводили отбор 2 параллельных аликвот по 3 мл через 0, 1, 3, 7, 24 часа. Клетки центрифугировали при 180 g и 4 °C 4 мин, супернатант анализировали отдельно, клетки дважды промывали 5 мл охлажденного до 5 °C PBS и суспендировали в 5 мМ ТРИС-НС1 (200 мкл, рН 7,5). Клетки разрушали четырёхкратным замораживанием-оттаиванием в среде жидкого азота, вносили 400 мкл метанола, осаждали образовавшуюся суспензию центрифугированием (2 мин при 14 000 g), надосадочную жидкость пипетировали и удаляли растворитель в вакууме при 37 °C. Остаток растворяли в 25 мкл 50 мМ ТЕАВ и анализировали ВЭЖХ.

Анализ липидного состава мембранной фракции осуществляли на ТСХ (силикагель), в качестве образцов сравнения выступали аутентичные нерадиоактивные образцы соответствующих липидных компонентов.

Идентификация Р меченых метаболитов (1), выделенных из липидной фракции клеток.

Идентификацию проводили двумерной хроматографией на силикагеле. Система 1 (хлороформ-метанол- 25% водный аммиак 65:35:5), пластинку тщательно высушивали, далее хроматографировали в системе 2 (хлороформ:МеОН:АсОН:ацетон:вода 10:2:4:2:1). Детекцию нерадиоактивных фосфолипидов проводили по методу Васьковского и Костевского [83]. Липиды содержащие 32Р детектировали с помощью фосфоимиджера.

1. Honjo, М., Fumkawa, Y. Kobayashi, К. Studies on phosphorylation. Phosphorylation of nucleosides with organic amine salts of phosphoric acid, Chem. Pharm. Bull.-1. V 14,1966,1061−1065.

2. Holy A., Smrt J. Synthesis of a GpUpU analogue containing 5'-deoxyuridine 5'-phosphonic acid and its effect upon the binding of I4C]valyland [14C]alanyl-tRNA to ribosomes. Collect. Czech. Chem. Commun.- V 31,1963,128−130.

3. Ztverteczky J. Szabo P., Szabo L. Phosphorylated Sugars. XIII. A new synthesis of D-arabinose-5-dilitium phosphate. J.Chem.Soc. Perkin Trans.- V 1,1973, 872−879.

4. Sakakura A., Katsukawa M., Ishihara K. Selective Synthesis of Phosphate Monoesters by Dehydrative Condensation of Phosphoric Acid and Alcohols Promoted by Nucleophilic Bases, Organic LettersV 7 (10), 2005,1999;2002.

5. Ishihara K., Kosugi Y., Akakura M. Rational design of an L-histidine-derived minimal artificial acylase for the kinetic resolution of racemic alcohols, J. Am. Chem. Soc., 126 (39), 2004,12 212−12 213.

6. De Graaf R. and Schwartz A. Thermal synthesis of nucleoside H-phosphonates under mild conditions, OrigLife EvolBiosph., 35(1), 2005,1−10.

7. Biebricher K., A simple procedure for the synthesis of a-32P-nucleoside triphosphates, Anal BiochemV 95 (2), 1979,429−432.

8. Stock J. Synthesis of phosphonate analogs of thymidine diand triphosphate from 5'-0-toluenesulfonylthymidine, J. Org. ChemV 44 (22), 1979,3997−4000.

9. Davisson V., Davis R., Dixit V. and Poulter C. Synthesis of nucleotide 5'-diphosphates from 5*-0-tosyl nucleosides, J. Org. Chem.- V 52, 1987,1794−1801.

10. Davisson V., Woodside A., Neal Т., Stremler K., Muehlbacher M., Poulter C.- Phosphorylation of isoprenoid alcohols, J. Org. Chem.- V 51, 1986,4768−4779.

11. Davisson V., Woodside A., Poulter C., Methods Enzymol.- V 110,1984,130−144.

12. O-Selective Phosphorylation of Nucleosides without N-protectionUchiyama M., Aso Y., Noyori R., Hayakawa Y., J. Org. ChemV 58,1993, 373−379.

13. Howes P.D., Slater M.J., Wareing K. The Regiospecific One-Pot Phosphorylation of Either the 5'- or 2'-Hydroxyl in З'-Deoxytimidines Without Protection: Critical Role of the Base, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic acidsV 22(5−8), 2003,687−689.

14. Hata Т., Chong K. Synthesis of thiamine diaikyl phosphate disulfide. Bull. Chem. Soc. Jpn. V 45,1972,654−661.

15. Taguchi Y., Mushika Y., Synthesis of O-acylthyamine disulfides. J. Org. Chem. V 40, 1975,2310−2317.

16. Taguchi Y., Mushika Y., Synthesis of O-benzoylthiamine disulfide. Tetrahedron Lett. 1975,1913;1918.

17. Taguchi Y., Mushika Y., Studies on biologically active haloganenated compounds. III. Synthesis and antibacterial activity of 7-fluoromethyl-l, 8-naphthyridine and quinoline derivatives. Bull. Chem. Soc. Jpn.- F48,1975,1528−1536.

18. Tener G. 2-Cyanoethyl phosphate and its use in the synthesis of phosphate ester. J.Am.Chem. Soc.- K83,1961,159−170.

19. Hillers S. Popova T., Shanshtein Z., Analogs of pyrimidine monoand polynucleotides. V. Synthesis of models of diand trinucleotides by thermal polycondensation, Khim. ' Geterotsikl. Soed., 1975, 401−411.

20. Kappler K., Hampton A., Synthesis of 5'-C-acylaminomethyl derivatives of adenosine 5'-phosphate and adenosine 5'-triphosphate. J.Carbohydr. Nucleosides, Nucleotides.1. V 2,1975,109−117.

21. Carpenter J., Shaw G. Chemical synthesis of specifically a-, (3-, and y-32P-labeled ucleoside-5'-triphosphates. J.Chem. Soc., 1970,2016;2022.

22. Kulikowski T., ZmudzkaB., Shugar D., Acta Biochim. PolV 16,1969,201−209.

23. Holy A., Sorm F., Effect of 5'-substitution on the template activity of oligo-nucleotides for the binding of valine and alanine tRNA to ribosomes. Collect. Czech. Chem. Commun., 1. V 36,1971,3282−3299.

24. Schoffstal A., Cyclopropylmethyl dihydrogen phosphate. Preparation and use in the phosphorylation of nucleosides, J. Org. Chem.-, V 40,1975,3444−3451.

25. Moffat A. Chemical synthesis of specifically a-, (3-, and y-32P-labeled ucleoside-5'-triphosphates. Methods Enzymol., Part AV 12,1967,182−199.

26. Holy A. Oligonucleotidic compounds. XI. Synthesis of ribonucleoside-2', 3'-cyclophosphates from nucleosides via nucleoside-2', 3'-phosphites. Smrt J., Collect. Czech. Chem. Commun.-, V 31(4), 1966,1528−1530.

27. Holy A., Sorm F. Oligonucleotidic compounds. XXXIV. Preparation of some 0-L-ribonucleosides, and 2', 3'-cyclic phosphates. Collect. Czech. Chem. Commun.-1. V 34(11), 1969, 3383−3385.

28. Frezit W., Schattka K., Cramer F., Jastorff B. Neue darstellungsmethode von nucleotide-analogen der 5'-amino-5'-deoxy-nucleotide. Chem. Ber.- V 105(3), 1972,991−996.

29. Takaku H., Shimada Y., Studies of phosphorylation. IV A selective phosphorylation of 5'-hydroxy group of nugleosides by means of tris (8-quinolyl) phosphate, Tetrahedron Lett. 1974,1279−1282.

30. Takaku H., Shimada Y., Studies. of phosphorylation. III. Effect of metallic compound on the phosphorylation of alcohols, phosphates, and nucleosides by 8-quinolyl phosphatesChem Pharm Bull {Tokyo). V 22,1974, 1743−1747.

31. SchiffH., Diarylamines and their derivatives, Justus Liebigs Ann. Chem-, 1. V 102,1857,337−342.

32. Levene P., Tipson R., The Synthesis of Ribose-S-phosphoric Acid. J. Biol. Chem., 1. V 106,1934,113−117.

33. Levene P., Tipson R., conversion of uronic acids into corresponding hexoses. J. Biol. Chem.', V 111, 1935,313−319.

34. Yoshikava M., Kato T., A novel method for phosphorylation of nucleosides to 5'-nucleotides. Tetrahedron Lett-, 1967,5065−5068.

35. Yoshikava M., Kato T., Studies of phosphorylation. I. Phosphorylation of 2', 3'-o-isopropylidene nucleoside by phosphoryl chloride. Bull. Chem. Soc. Jpn, 1. V 42,1969,3505−3511.

36. Kasashio K., Yoshikava M., Studies of phosphorylation. II. Reaction of 2', 3'-0-isopropylideneinosine andguanosine with phosphoryl chloride. Bull. Chem. Soc. Jpn. V 41, 1968,142−151.

37. Ludwig J., A new route to nucleoside 5'-triphosphates. Acta Biochim., Biophys., Acad., Set, HungV 16,1981,131−137.

38. Levene P., Tipson R., catalytic reduction and deacetylation of the methyl ester of 2,3,4-triacetyl a-methyl-d-galacturonide. J. Biol. Chem. V 111, 1937,185−188.

39. Khorana H. G. and Todd A. R. Studies on phosphorylation. Part XI. The reaction between carbodi-imides and acid esters of phosphoric acid. A new method for the preparation of pyrophosphates. J. Chem. Soc. 1953,2257 2260.

40. Kennedy E.P. The synthesis of cytidine diphosphate choline, cytidine diphosphate ethanolamine, and related compounds. J. Biol. Chem. 1956. V 222(1), 185−191.

41. Smith, M., Moffatt, J.G. and Khorana, H.G. Carbodiimides. VIII. Observations on the reactions of carbodiimides with acids and some new applications in the synthesis of phosphoric acid esters. J. Amer. Chem. Soc. 1958; V 80,6204−6212.

42. Hughes, N. A., Kenner, G. W. & Todd, A. Part III. A synthesis of diphosphopyridine nucleotide (cozymase), and some observations on the synthesis of triphosphopyridine nucleotide. J. Chem. Soc. 1957,3733−3778.

43. G.W. Kenner G.W. Phosphoric esters and related compoundsreport of a symposium held at the Chemical Society anniversary meeting, Cambridge, on April 9−12th, London, 1957,99−101.

44. Tener G. M., Khorana H. G., Markham R., Pol E. H. Studies on Polynucleotides. II. The Synthesis and Characterization of Linear and Cyclic Thymidine Oligonucleotides. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80(23), 6223−6230.

45. Weimann, G. and Khorana, H.G. Studies on polynucleotides XVII. On the Mechanism of Internucleotide Bond Synthesis by the Carbodiimide Method. J. Am. Chem. Soc. 1962,1. V 84,4329−4341.

46. Jacob, T. M., and H. G. Khorana. Studies on polynucleotides. XXX. A comparative study of reagents for the synthesis of the CsA35f intemucleotidic linkage. J. Am. Chem. SOC. 1964; V 86,1630−1635.

47. B. D. Mehrotra and H. G. Khorana. Studies on Polynucleotides XL. Synthetic deoxyribopolynucleotides as templates for ribonucleic acid polymerase: the influence of temperature on template function. J Biol Chem. 1965; V 240,1750−1753.

48. Letsinger RL, Caruthers MH, Miller PS, Ogilvie KK. Oligonucleotide syntheses utilizing beta-benzoylpropionyl, a blocking group with a trigger for selective cleavage. J Am Chem Soc. 1967 Dec 20- 89(26), 7146−7147.

49. Katagiri N, Itakura K, Narang SA. The use of arylsulfonyltriazoles for the synthesis of oligonucleotides by the triester approach. J Am Chem Soc. 1975. Dec 10- 97(25). 7332−7337.

50. Seth AK, Jay E. A study of the efficiency and the problem of sulfonation of several condensing reagents and their mechanisms for the chemical synthesis of deoxyoligoribonucleotides. Nucleic Acids Res. 1980, 8(22), 5445−5459.

51. Todd A. Some Aspects of Phosphate Chemistry. PNAS. 1959,45,1389−1397.

52. Michelson A.M. Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Academic Press, London and New York, 1963, 412−417.

53. DG Knorre and VF Zarytova. The mechanism of the chemical synthesis of oligonucleotides and its synthetic consequences. Nucl. Acids Res. 1976. 3. 2709−2729.

54. The role of metaphosphate in the activation of the nucleotide by TPS and DCC in the oligonucleotide synthesis. Nucleic Acids Res. 1986,25−14(6), 2699−2706.

55. T.M. Chapman, D.G. Kleid, Activated Phosphate Triesters. The Synthesis and Reactivity of N-Hydroxysuccinimide and N-Mercaptosuccinimide Esters.

56. J. Org. Chem., 1973; V 38(2), 250−252.

57. Tri-t-butyl Phosphite and Some of Its ReactionsMark V and J.R. Van Wazer, J. Org. Chem-, V 29,1964,1006−1008.

58. R. W. Taft, D. Gurka, L. Joris, P. v. R. Schleyer and J. W. Rakshyszbad., 1. V 91,1969,1801.

59. Arnett E. M. Quantitative comparisons of weak organic bases, Progr. Phgs. Org. Chem.-, 1. V 1,1963,223−403.

60. Biosynthetic Preparation of 32P-Labaled Nucleoside 5'-Phosphates and DerivativesR. Hurlbert, N. Furlong, Nucleic Acids Components, 193−202.

61. Вояковская E.E., Захарова Л. Ю., Зуева E.B., Кулене В. В., Карпавичене Д. П., Цветков B.C., Титкова Е. Г. Органические соединения, меченные радиоактивными изотопами, II Симпозиум стран-членов СЭВ, Ленинград, 1981. ЦНИИ Атоминформ, Москва, 1982,141.

62. Скоблов Ю. С., Королёв А. Э., Маслова Р. Н. Синтез 5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, Успехи химии, 64(8), 1995, 850−858.

63. Франк-Каменская М.Д., Книжниева Г. В., Мясоедов М.Ф.- Биоорганическая химия, 10,1984,515−518.

64. R. Hurlbert, Furlong N. Methods Enzymol, Part A, 12,1967,193−198.

65. Феофанов C.A.- дис.канд.хим.наук. НИБХ CO АН СССР, Новосибирск, 1985.

66. Ch.K. Biebricher. A simple procedure for the synthesis of alpha-32P-nucleoside triphosphates, Anal. Biochem., 1979; V 95,429−432.

67. Скоблов Ю. С., Королев А. Э., Маслова P.H. Синтез нуклеозид 5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора. Успехи химии. Т. 64,1995, 850−858.

68. Walseth T.F., Johnson R.A. Biochim. Biophys. Acta. V 526,1979,11−16.

69. Шипицый A.B., Ясько M.B., Широкова E.A., Куханова М. К., Проняева Т. Р., Федюк Н. В., Покровский А. Г., Госслен Ж., Периго К., «Холинфосфат З'-азидо-З'-дезокситимидина как антивирусный агент», Заявка на изобретение2 002 119 748 от 26.06.2002 г.

70. Turcotte J.G., Pivarnik Р.Е., JShirali S.S., Preparative-scale high-performance liquid chromatographic separation and purification of 3 '-azido-3 '-deoxythymidine-5 '-phosphate.

71. J. Chromatography, 1990; V 499,55−61.

72. Suesy P., Zagarny M. A biosynthetic method for the preparation of high specific activity 32Plabeled phospholipids, Chem. Phys. Lipids. 1969. V 56,9−13.

73. Symons R.H. Synthesis of a-32P-riboand deoxyribonucleoside 5'-triphosphate. Methods Enzymology, 1974; V 29, 102−108.

74. Fedorova O.A., Gottikh M.B., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. Cyanogen Bromide-induced Chemical Ligation: Mechanism and Optimization of the Reaction Conditions, Nucleosides Nucleotides., 1996; V 15,1137−1147.

75. E. Kanaya and H. Yanagava, Template-Directed Polymerization of Oligoadenylates Using Cyanogen Bromide, Biochemistry, 1986; V 25,7423−7430.

76. Зарытова В. Ф., Кнорре Д. Г. Промежуточные реакции при синтезе олигонуклеотидов по данным спектроскопии Я.М.Р. на ядрах Р31, Доклады академии наук, 1973, Т 212,630−633.

77. Годовикова Т. С., Зарытова В. Ф., Халимская Jl. М., Реакционноспособные фосфамиды монои динуклеотидов. Биоорганическая Химия, 1986,12(4), 475−481.

78. Лебедев А. В., Резвухин А. И. Закономерности изменений химических сдвигов ядер фосфора в спектрах 31Р-ЯМР производных нуклеотидов, Биоорганическая химия, 1983, Т 9 (2), 149−185.

79. Folch J., Lees M., Sloane-Stanley, G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 1957; V 226,497−501.

80. Vaskovsky V.E., Kostevsky E.Y. Modified spray for the detection of phospholipids on thin-layer chromatograms, J. Lipid Res.-, V 9,1968, 396.