Новые технологии иммунодиагностики и механизмы иммунных нарушений при урогенитальных инфекциях у женщин репродуктивного возраста

Масштабность распространения сексуально-трансмиссивных инфекций продолжает оставаться актуальной во всем мире. Инфекционно-воспалительные заболевания репродуктивной сферы, несмотря на достижения современной медицины, лидируют в структуре гинекологической заболеваемости и остаются традиционно значимыми на про гяжении последних лет. Урогенитальный хламидиоз и уреаплазмоз занимают ведущее место в структуре инфекций передаваемых половым путем. Возбудители хламидиоза и уреаплазмоза — облигатные внутриклеточные паразиты — не относятся к патогенам, представляющим. особую опасность, но на фоне растущей урбанизации, ухудшения социально-демографической и экологической ситуации инфицирование ими способно приводить к формированию различных осложнений, оказывающих неблагоприятное влияние как на общее состояние здоровья, так и на репродуктивную функцию населения.

Клинические варианты течения хламидийной и уреаплазменной инфекций в наибольшей степени определяются выраженностью изменений, вызываемых возбудителем в месте своей локализации. Слизистые содержат элементы биотопа (эпителиальные клетки, лейкоциты), являющиеся элементами конституциональной рецепторной системы организма, и в комплексе с другими гуморальными и клеточными факторами мукозального иммунитета определяют эффективность колонизационной резистентности слизистых макроорганизма (один из важных интегральных компонентов местного иммунитета). Способность микрофлоры данного биотопа и макроорганизма, кооперативно взаимодействуя, защищать экосистему от патогенной, микрофлоры, в литературе обозначают как «колонизационную резистентность».

Среди группы возбудителей хламидийных инфекций человека, известных под общим названием «хламидиозы», особое значение для медицины представляют хламидии двух родов Chlamydia и Chlamyclophila, носящие антропонозный характер: вид Chlamydia trachomatis, вызывающий различные урогенитальные заболевания (уретрит, цервицит, эндометрит, простатит, орхит и др.), патологию беременности и родов, некоторые формы артрита, трахому, лимфогранулему венерум, патологию органов дыхания, офтальмию новорожденных, и вид Chlamydophila pneumoniae (биовар TW AR), являющийся респираторным возбудителем, а также играющий роль в пагологии сердечнососудистой системы и головного мозга (атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, инсульт, транзиторные нарушения кровообращения мозга, болезнь Альцгеймера).

Доказана этиопатогенетическая роль вида Chlamydophila pneumoniae при различных заболеваниях человека. Chi. pneumoniae — основной возбудитель респираторной патологии человека. Передается от человека к человеку воздушно-капельным путем. Заболевания, вызываемые Chi. pneumoniae, могут протекать в острой и хронической формах, локально или системно с незначительными клиническими симптомами или их отсутствием у 90% людей. Chi. pneumoniae также резидируется в клетках респираторного эпителия, сосудистого эндотелия. Особенно интересным представляется факт связи СМ. pneumoniae с заболеваниями сердечно-сосудистой системы и головного мозга (атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, инсульт, транзиторные нарушения кровообращения мозга, болезнь Альцгеймера).

Ureaplasma urealyticum является одним из ведущих этиологических агентов воспалительных заболеваний женской половой сферы, приводящих к выраженным нарушениям репродуктивной функции, цервицитам, эндометритам, сальпингоофоритам, хорсоамнеонитам, неонатальным инфекциям и др. Частота выявления U. urealiticnm у женщин репродуктивного возраста достигает 46%, а при наличии хронического воспалительного процесса в различных отделах половой системы достигает 70%. Вместе с тем, в настоящее время наблюдается широкое распространение уреаплазм среди клинически1 здоровых женщин. Пусковым моментом уреаплазменной инфекции является колонизация возбудителем эпителиоцитов хозяина. Вместе с тем, уреаплазмы способны адсорбироваться и на других объектах, в том числе на бактериальных клетках.

Патогенный потенциал хламидий и уреаплазм определяется их концентрацией в организме, наличием других, в том числе патогенных бактерий и вирусов, изменением физиологического и иммунного статуса, соматическими заболеваниями и другими факторами. Большой интерес у исследователей вызывает детальное изучение жизненного цикла штаммов хламидий и уреаплазм, их фенотипических признаков, особенностей структуры генома штаммов хламидий и уреаплазм, а также взаимодействие штаммов возбудителей между собой, штаммов хламидий со штаммами уреаплазм, штаммов хламидий и уреаплазм с условно-патогенными микроорганизмами и нормофлорой слизистых. При этом представляет интерес изучение видового состава и антибиотикорезистентности условно-патогенной микрофлоры урогенитальных путей женщин и мужчин.

Известно, что система антиинфекционной резистентности организма определяется качественным и количественным составом биопленки, формируемой индигенной микрофлорой на эпителиальных поверхностях, а также местным п общим иммунологическим статусом организма хозяина. Ключевым звеном в распознании макроорганизмом патогенов являются образ распознающие рецепторы врожденной иммунной системы. К таким рецепторам относятся То11-подобные рецепторы (ТЬЯ), составляющие основу мембранных комплексов и экспрессирующихся на всех клеточных элементах, участвующих в формировании резистентности (включая колонизационную резистентность макроорганизма), в том числе и на поверхности слизистых.

ТЬЯ способны распознавать консервативные молекулярные структуры, распространенные среди определенного класса микроорганизмов и отсутствующие у человека. Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции после взаимодействия патогенов с мембранными ТЬЯ, что сопровождается активацией генов цитокинового каскада, ответственных за активацию фагоцитов и других иммунокомпетентных клеток, иммуноглобулинов, что, в свою очередь, определяет уровень мукозалыюй колонизационной резистентности и, в дальнейшем, блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление инфекционного агента из организма.

Детальное изучение жизненного цикла хламидий и уреаплазм, фенотипических признаков, особенностей структуры генома возбудителей, влияния последних как монопатогенов, так и в ассоциации с условно-патогенными микроорганизмами, на формирование вторичного иммунодефицита па организменном и мукозальном уровнях необходимо для установления новых патофизиологических и иммунологических патогенетических механизмов развития этих инфекций. Тем самым, сократится колоссальный разрыв между фундаментальными исследованиями биологии и морфологии хламидий и уреаплазм и клиническими исследованиями заболеваний, которые они вызывают, в ряде случаев позволит объясни 1Ь отсутствие симптоматики, возможность атипичных проявлений, бессимптомного течения инфекции. Кроме того, это открывает новые возможности совершенствования и повышения информативности методов диагностики, лечения и профилактики, а также создания фармпрепаратов, воздействующих губительно на все формы цикла развития хламидий и уреаплазм, и новых иммуномодулирующих препаратов, вакцин с целью наиболее эффективного лечения и профилактики этих заболеваний.

Цель исследования.

Целью исследования явилось установление роли организменного и местного иммунитета в патогенетических механизмах и клинических проявлениях при урогенитальных хламидийной и уреаплазменной инфекциях у женщин репродуктивного возраста.

Задачи исследования.

1. Провести сравнительную оценку вторичного иммунодефицита, осложняющего хламидийную и уреаплазменную инфекции.

2. Выявить патогенетический, диагностический и прогностический потенциал микробиоценозов урогенитального тракта женщин при хламидийной и уреа-плазменной инфекциях.

3. Оценить роль рецепторов врождённого иммунитета в патогенезе, а также диагностическое и прогностическое значение регистрации показателей их уровней при урогенитальной хламидийной инфекции женщин.

4. Изучить колонизационную резистентность слизистой цервикального канала при урогенитальной хламидийной инфекции.

5. Установить клинико-диагностические и прогностические возможности выявления фенотипических и генотипических (серологических) особенностей возбудителя при урогенитальной хламидийной инфекции.

Научная новизна работы.

Впервые показано, что выраженный длительный вторичный иммунодефицит является неотъемлемой частью патологических проявлений при урогенитальных хламидийной и уреаплазменной инфекциях, на организменном уровне проявляющийся повышенной восприимчивостью к бактериальным и вирусным агентам, высокой частотой выявления воспалительных процессов гениталийна местном уровне (слизистые)-относительно слабо выраженной воспалительной реакцией, дисбалансом в цитокиновом и иммуноглобулиновом звеньях, угнетением нормофлоры (лактобациллы и бифидобактерии), сниженной реакцией на условно-патогенную микрофлору, что в сочетании способствует нарушению колонизационной резистентности слизистых как основного компонента мукозального иммунитета.

Впервые комплексно оценена просветная и пристеночная микрофлора влагалища и показатели иммуноглобулинов секрета влагалища клинически здоровых женщин и пациенток с уреаплазменной микст-инфекцией. Выявлено резкое снижение колонизационной резистентности, характеризующееся появлением и/или значительным увеличением в просветной и пристеночной областях ассоциаций условно-патогенных факультативно (стрептококки, стафилококки, энтерококки, энтеробактерии, капдида) — и облигатно-анаэробных микрооганизмов (пептострептококки, пептококки, гарднереллы, бактероиды, фузобактерии) и изменением показателей иммуноглобулинов секрета влагалища у пациенток с уреаплазменной микст-инфекцией, по сравнению с клинически здоровыми.

При хламидийной инфекции микроорганизмы, попадая на слизистые.

УГТ, взаимодействуют с рецепторами врождённого иммунитета и запускают воспалительную реакцию. Различные уровни активации рецепторов ТЪЯ-2 и.

ТЬЯ-4 зависят от качественного состава микробных сообществ, присутствующих на слизистой оболочке УГТ. Показатели уровней обсеменённости УПМ Цк, Ур и Вл прямо коррелировали с показателями уровней экспрессии генов ТЬЯ-2 и Т1Л-4. Низкие уровни экспрессии генов.

ТЬЯ-4 при осложненном инфекционном процессе свидетельствуют о переключении ТЬЯ-4 типа иммунного ответа на ТЫЗ.-2. Повышение экспрессии генов ТЬК.-2 и ТЬЯ-4, как в Цк, так и в Ур, коррелирует с тяжестью клинических проявлений, зависящей как от хламидий, так и от ассоциатов возбудителей ИППП и УПМ). Во Вл имеет место экспрессия генов ТЬЯ-2 и.

ТЫ1−4 в ответ на УПМ, а в Цк и Ур — на УПМ и ИППП. Активация экспрессии генов ТЬЯ-2 и Т1Л-4 происходит более выраженно в ответ на УПМ и менее выражено при контакте с нормофлорой.

Впервые установлена определяющая роль ТЫ1−2 и ТЬЯ-4 слизистых нижних отделов урогенитального тракта в ответе макроорганизма на инфицирование хламидиями при урогенитальном хламидиозе. Естественная или приобретённая супрессия генов ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 обусловливает хроническое течение УГХ. При воспалении шейки матки/уретры более чем у половины женщин с хроническим рецедивирующим течением УГХ наблюдается снижение экспрессии генов ТЬК-2 и ТЬЯ-4 (в полтора-два раза ниже значений у клинически здоровых пациентов), сопровождаемое уменьшением лейкоцитарной реакции. Как про-, так и антиапоптозная активности хламидий определяют характер развития инфекции: продуктивная инфекция либо персистенция.

Выявленные однотипные изменения показателей уровня экспрессии ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 в Цк и Ур пациенток с хронической формой хламидийной инфекции указывают на развитие «феномена рецепторной депрессии», сопровождающегося дисбалансом между развитием инфекционного процесса и воспалительной реакции. Уровни экспрессии генов ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 служат критериями оценки выраженности хламидийной инфекции и наличия воспалительного процесса у больных, а при выздоровлении их снижение может свидетельствовать об эрадикации возбудителя. При острой хламидийной инфекции выявление низких уровней ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 указывает на возможность начала хронизации инфекционного процесса.

Впервые выявлена при УГХ в УГТ взаимосвязь рецепторов врождённого иммунитета ТЫ1−2 и ТЬЯ-4 (контролируют запуск цитокинового каскада местной антиинфекционной резистентности, через который запускаются иммуноглобулиновое звено и воспалительная реакция) с микрофлорой биотопа (в том числе, с нормофлорой) определяет колонизационную резистентность слизистых и характеризует течение инфекционного процесса, выраженность клинических и лабораторных проявлений и исход заболевания (излечение, хронизация), а оценка их уровней носит диагностический и прогностический характер.

При хламидийной инфекции впервые выявлена зависимость выраженности патологического процесса и клинических проявлений от наличия и сочетания отдельных патогенетических факторов (плазмиды, функциональное состояние гена 1псА, принадлежность штамма хламидий к конкретному генотипу, одновременное инфицирование штаммами хламидий с разными генотипами и возможность обменивания между ними генетической информацией с появлением другой разновидности хламидийного штамма).

Теоретическая значимость работы.

Впервые показано, что взаимодействие микробиоценозов слизистых урогенитального тракта и макроорганизма носит динамический характер, обеспечивает жизненно необходимый оптимальный уровень реактивности макроорганизма. Тем самым, достоверно подтверждена роль микроорганизмов в обучении защитных систем макроорганизма в динамике онтогенеза. Формирование вторичного иммунодефицита является неотъемлемым патогенетическим фактором инфекционного процесса, обусловливающего, в конечном счёте, прогноз и исход заболевания.

Впервые выявлено, что взаимодействие микроорганизмов биотопов слизистых, а также возбудителей инфекционных заболеваний с рецепторами врождённого иммунитета является необходимым фактором запуска инфекционного процесса.

Впервые представлена колонизационная резистентность как неотъемлемая часть мукозального иммунитета.

Впервые показано влияние фенотипических и генотипических свойств возбудителя на выраженность патогенетического процесса, клинических проявлений при хламидийной урогенитальной инфекции.

Практическая значимость работы.

Получен патент РФ «Способ оценки микробиоценоза влагалища» № 2 249 821. Зарегистрирован 10.04.2005. Предложена новая медицинская технология «Оценка микробиоценоза влагалища при инфекционных и других заболеваниях женской половой сферы», утверждена Минздравсоцразвитием: Разрешение на применение новой медицинской технологии. Серия АА. № 1 997. ФС № 2009/187 от 17.07.2009. Разработаны и предложены лабораторные критерии диагностики урогенитального хламидиоза с установлением острой и хронической рецидивирующей формы заболевания, защищённые Патентом РФ «Способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза» № 2 327 995. Зарегистрирован 27.06.2008 г. На разработаный способ мультиплексной ГЩР диагностики хламидийной инфекции обезьян, вызванной видом Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia trachomatis, и способ мультиплексной ПЦР диагностики плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Chlamydia trachomatis, получен Патент РФ «Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2 385 946, зарегистрирован 10.04.2010, (награждён Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Дипломом в номинации «100 лучших изобретений России») и Патент РФ «Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2 385 945, зарегистрирован 10.04.2010 (награждён Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Дипломом в номинации «100 лучших изобретений Росси»).

Положения, выносимые на защиту.

Хламидийная и уреаплазменная инфекции сопровождаются развитием длительного вторичного иммунодефицита. Последний наиболее выражен при урогенитальном хламидиозе и проявляется на местном уровне относительно слабо выраженной воспалительной реакцией при остром и обострении хронического хламидиоза, угнетением нормофлоры (лактобацилл и бифидобактерий), сниженной реакцией на условно-патогенную микрофлору, а в дальнейшем развитием у переболевших кольпита, эрозии шейки матки, сальпингоофорита и возможной малигнизации тканей.

Изменения уровней микробиологических и иммунологических показателей биотопа влагалища отражают патогенетические механизмы при хламидийной и уреаплазменпой микст-инфекциях и могут быть диагностическими и прогностическими показателями течения инфекционного процесса.

Впервые установлена диагностическая и прогностическая значимость оценки уровней экспрессии генов ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 при урогенитальном хламидиозе у женщин. Воспалительная реакция и реакция слизистых урогенитального тракта на условно-патогенную микрофлору и нормофлору, колонизационная резистентность координируются Т1Л1−2 и ТЬЯ-4.

Впервые — описан алгоритм запуска колонизационной резистетности слизистой цервикального канала: ТЬИ. слизистых реагируют на условно-патогенную микрофлору и нормофлору, через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни^О, sTgA и секреторного компонента (бс), что в комплексе и определяет колонизационную резистентность.

Впервые доказана связь генотипических и фенотипических свойств возбудителей с патогенетическими механизмами и особенностями клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции.

Внедрение результатов работы в практику.

Результаты исследований и разработок используются в научных исследованиях кафедры клинической аллергологии и иммунологии Первого Московского Государственного медицинского университета имени И. М. Сеченова.

Выводы:

1.Вторичный иммунодефицит при урогенитальной хламидийной инфекции на организменном уровне проявляется повышенной восприимчивостью к бактериальным (микоплазмы, доминирование двух биоваров уреаплазм) и вирусным агентам (к онкогенным типам вируса папилломы человека, ВПГ), высокой частотой выявления воспалительных процессов гениталий. На местном уровне (слизистые) отмечаются относительно слабо выраженная воспалительная реакция при остром и обострении хронического хламидиоза, угнетение нормофло-ры (снижение частоты выявляемое&tradeи количественного содержания лактоба-цилл и бифидобактерий), сниженная реакция на условно-патогенную микрофлору, что в сочетании способствует нарушению колонизационной резистентности слизистых.

2.При остром урогентальном уреаплазмозе вторичный иммунодефицит иа организменном уровне проявляется повышенной восприимчивостью к бактериальным (микоплазмы, уреаплазмыпреимущественно одного биовара, хлами-дии) и вирусным агентам (цитомегаловирусу, вирусам простого герпеса, вирусам папилломы человека), высокой частотой выявления воспалительных процессов гениталий. На местном уровне (слизистые) отмечаются угнетение нор-мофлоры (снижение количественного содержания лактобацилл и бифидобактерий), повышенная реакция на условно-патогенную микрофлору.

3 .Уреаплазменная микст-инфекция сопровождается достоверным изменением микробиоценоза влагалища в зависимости от выраженности инфекционного процесса: снижением уровня протективной микрофлоры — лактобацилл, увеличением содержания условно-патогенных факультативно-анаэробных микроорганизмов в просветной области и облигатно-анаэробных микроорганизмов в пристеночной области влагалища.

4.При оценке микробиотопа влагалища больных уреплазмозом установлена достоверная корреляционная зависимость между изменением показателей микрофлоры влагалища, содержанием в вагинальном отделяемом^А, б^А,^М и бс и выраженностью клинических проявлений.

5.При хламидийиой инфекции установлено, что выявление в соскобном материале из уретры уровня экспрессии генов TLR-2 более 14 ОЕ и TLR-4 более 10 ОЕ, а в соскобном материале из цервикального канала TLR-2 более 19 ОЕ и TLR-4 более 14 ОЕ указывает на острый урогенитальный хламидиозвыявление в соскобном материале из уретры уровня экспрессии генов TLR-2 не более 5 ОЕ и TLR-4 не более 5 ОЕ, а в соскобном материале из цервикального канала TLR-2 не более б ОЕ и TLR-4 не более 9 ОЕ указывает на хронический урогенитальный хламидиоз или начало хронизации инфекционного процесса.

6.Приведён механизм функционирования колонизационной резистентности слизистых: TLR слизистых через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни IgG, slgA и секреторного компонента (sc) и в купе с микрофлорой биотопа определяют колонизационную резистентность слизистых как части мукозального иммунитета.

8.Разработанные мультиплексные ПЦР-тест-сис темы для видовой дифференциации штаммов Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, для детекции плазмидных и бесплазмидных штаммов, а также праймеры для ПЦР-генотипирования штаммов Ch. trachomatis позволяют одновременно не только верифицировать возбудителей хламидиозов, но и осуществлять дифференциацию хламидий, оценивать вирулентность штаммов.

9.Установлено, что из 5 генотипов циркулирующих в Московском регионе штаммов Ch. trachomatis (К- 46,2%, G- 23,1%, Е- 19,2%, F- 7,7%, J- 3,8%) у женщин чаще встречаются генотип G (37,5%), генотип Е (19%), генотип К (43,5%). При остром хламидиозе генотип G определяется в 22%, генотип Ев 11%, генотип Кв 61% случаевпри хроническом хламидиозе генотип Gв 25%, генотип Ев 37,5%, генотип Кв 12,5% случаев. В ассоциации всегда присутствует генотип К.

Практические рекомендации.

1.При диагностике и установлении прогноза течения инфекционных заболеваний гениталий женщин необходимо и целесообразно оценить выраженность дисбиотических нарушений влагалища и цервикального канала как интегрального показателя местной антиинфекционной резистентности применяя предложенную оригинальную новую медицинскую технологию. Последняя позволяет судить о выраженности колонизационной резистентности слизистых как неотъемлемой части мукозального иммунитета.

2.При урогенитальном хламидиозе женщин количественная оценка экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 по оригинальному разработанному способу позволяет судить о состоянии врождённого иммунитета и выявлять его нарушения, дополняет и повышает информативность, диагностическую и прогностическую значимость алгоритма верификации хламидийной инфекции.

3.Общепринятый алгоритм верификации возбудителя хламидийной инфекции необходимо расширить за счёт включения предложенных оригинальных мультиплексных ПЦР-тест-систем на одномоментное дифференцирование Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae, одномоментное дифференцирование плазмидосодержащих и плазмидонегативных штаммов Chlamydia trachomatis, а также ПЦР-тест-системы с предложенными оригинальными праймерами на генотипы Chlamydia trachomatis и ПЦР-тест-системы для выявления анти-биотикорезистетности штаммов хламидий.