Нуклеотид-гидролизующая активность иммуноглобулинов и лактоферрина молока человека

Открытие каталитически активных антител (абзимов) является одним из наиболее ярких достижений в молекулярной биологии и биохимии за последнее десятилетие. Несмотря на сравнительно небольшой срок (всего около десяти лет), прошедший с момента получения первых абзимов, в настоящее время достигнут огромный прогресс в этой области исследований. На сегодняшний день получение антител (АТ) к стабильным аналогам переходного состояния (АПС) можно считать универсальным, детально разработанным подходом к генерации биокатализаторов химических превращений. Теоретические основы этого подхода были предложены Л. Полингом в 1948 г., который выявил общие черты в механизмах узнавания гаптена антителом и переходного состояния реакции ферментом. Идея о возможности получения абзимов как АТ к стабильным аналогам переходных состояний впервые была высказана Б. Дженксом [1] и экспериментально подтверждена А. Трамонтано с соавт. [2].

Своим быстрым развитием область исследования каталитических АТ обязана не только огромному практическому потенциалу абзимов. Интерес к каталитической активности АТ обусловлен также возникновением новых подходов к решению фундаментальных задач биохимического и молекулярно-биологического характера. Действительно, абзимы являются мощным инструментом в исследовании механизмов биокатализа, реализуемых белковыми структурами. Кроме того, феномен химического превращения антигена под действием АТ заставляет по новому оценить роль последних в различных иммунологических процессах. Необходимо отметить, что возможность генерации абзимов при иммунизации животных гаптенами-АПС сама по себе не свидетельствовала в пользу наличия естественной каталитической функции у АТ в организме. Достаточным основанием, позволяющим утверждать, что АТ в организме выступают не только в качестве связывающего, но и в качестве химически трансформирующего антиген начала, могло быть обнаружение каталитической активности у «природных» АТ и представление строгих доказательств того, что активность не связана с присутствием в препаратах АТ примеси ферментов. Первым подобным исследованием были работы группы С. Пола, в которых показано, что в крови людей, страдающих астмой присутствуют АТ с протеолитической активностью [3]: они расщепляют вазоактивный интестинальный пептид (ВИП). Затем были обнаружены ДНК- [4 — 6] и РНК-гидролизующие АТ [7 — 9] в крови больных СКВ.

Дальнейшие исследования показали, что абзимы образуются и при других АИЗ: ревматоидном артрите и склеродермии [10], аутоиммунном тиреоидите, полиартрите [11], рассеянном склерозе [12], а также при различных формах вирусного гепатита [13] и при СПИДе [14] - заболеваниях, протекающих с нарушением иммунного статуса пациента.

Недавно нами было показано также, что б^А здоровых по медицинским показаниям рожениц фосфорилируют ряд белков молока [15 — 16]- б^А и^{О-абзимы} молока катализируют гидролиз ДНК и РНК [17 — 18]. Следовательно, наработка абзимов возможна и в здоровых организмах в отсутствие аутоиммунных процессов. В ходе исследования активностей АТ молока было отмечено, что пул^О и э^А обладает не только протеинкиназной и нуклеазной активностями, но и гидролизует АТР до АБР и ортофосфата. Целью настоящей работы является исследование нуклеотид-гидролизующей активности антител человеческого молока, установление субстратной специфичности таких антител, определение роли отдельных субъединиц иммуноглобулинов в связывании и гидролизе нуклеотидов. Для выяснения роли нуклеотид-гидролизующих антител в человеческом молоке актуальным также было выявление других белков молока, способных связывать и гидролизовать АТР.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Фундаментальным и наиболее исследованным свойством иммуноглобулинов является их способность связывать самые разнообразные по структуре соединения. Современным представлениям о связи между структурой иммуноглобулинов и их функциями, специфичностью и механизмами осуществления этих функций посвящен ряд обзоров [19, 20]. В рамках данной работы необходимо, на наш взгляд, рассмотреть строение антиген-связывающих и пространственно близких к ним областей антител, в силу того, что именно они непосредственно участвуют в связывании и химической трансформации субстрата осуществляемых абзимами.

Мономерная молекула иммуноглобулина состоит из четырех субъединиц: двух идентичных «тяжелых» полипептидных цепей (Н) 51−72 кДа, и двух идентичных «легких» (Ь) цепей 20−25 кДа. Цепи соединены межцепочечными дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями (рис. 1, а). Мономеры иммуноглобулинов могут быть объединены в пентамерные комплексы с помощью дисульфидных связей с дополнительным полипептидом — .Г-цепью (^М), или в димерные комплексы дисульфидными связями с 1-цепью и секреторным компонентом (э^А), либо без секреторного компонента (1§-А) [19].

Иммуноглобулины — гликопротеины с четко выраженной доменной структурой. Легкие цепи антител образуют два гомологичных домена: вариабельный — Уьи константный — Сь Структура тяжелой цепи в зависимости от класса иммуноглобулина образована 4-мя или 5-ю гомологичными доменами, один из которых вариабельный — Ун, а остальные константные Сн1-СнЗ/4. Антигенсвязывающий активный центр формируется Уь и Ун доменами (рис. 1, а)[20].

Домен ^ образован приблизительно 107 — 110 АК. Вторичная структура доменов ^ представлена обширными областями, образующими две плоскости антипараллельных Р-складок, и так называемыми петлями, структура которых представлена элементами ос-спиралей и изгибами (поворотами) цепи (рис. 1, б) [19,20].

Такое строение характерно не только для, но и для широкого крута других полипептидов, образующих суперсемейство^{-подобных} белков. В число последних входят антигены главного комплекса гистосовместимости, дифференцировочные антигены лейкоцитов, ряд клеточных рецепторов и другие белки. Внутри этого суперсемейства сходство вторичной и третичной структур полипептидов обусловлено существенной гомологией первичных последовательностей белков [20].

Между Сн1 и Сц2 доменами тяжелой цепи имеется так называемый шарнирный участок, который придает молекуле пространственную гибкость. Пептидные связи этого участка наиболее подвержены протеолизу. Так, ограниченный протеолиз папаином происходит с образованием двух идентичных Fab-фрагментов антител (от англ. «Fragment antigen binding») и одного Fc-фрагмента (от. Англ. «Fragment cristalline»). Под действием трипсина и пепсина образуется Р (аЬ)г-фрагмент, состоящий из двух Fab-фрагментов, соединенных в шарнирной области дисульфидными связями (рис. 1, а) [19].

Из рис. 1, б видно, что антиген-связывающие V-домены антител представлены относительно консервативными каркасными участками FR1 — FR4 (от англ. «Framework Region»), образующими Р-складки, и гипервариабельными, областями CDR1-CDR3 (от англ. «Complementarity-Determining Region»). Каркасные участки (FR) формируют структуру доменов цепей и вносят существенный вклад во взаимодействие тяжелых и легких цепей между собой [21]. Таким образом структурообразующая часть, на которую приходится более 80% всего Vl или Ун домена, формируется инвариантными элементами вариабельных регионов цепей. Необходимо отметить, что контактная область между Vl и Vh доменами приблизительно на 40% формируется за счет CDR-областей. Поэтому взаимное расположение V-доменов цепей различно даже для идиотипически родственных иммуноглобулинов. В частности, отмечены вариации угла взаимного поворота Vl и Vh доменов от 165° до 180° [21, 22].

В формировании антиген-связывающих активных центров в основном участвуют АК CDR областей антител, однако далеко не все АК остатки гипервариабельных областей непосредственно контактируют с лигандом. Большинство из них предназначено для придания активному центру уникальной конформации, необходимой для связывания лиганда. Аминокислотные остатки каркасных областей так же принимают участие в формировании активного центра и могут непосредственно контактировать с антигеном [19].

Недавно были установлены некоторые закономерности, касающиеся аминокислотной композиции антиген-связывающих регионов антител. Согласно данным различных авторов, остатки аспарагина и гистидина встречаются от двух до восьми раз.

Место гидролиза.

Место гидролиза пепсином б).

РН1 °Ш1 ГР2 °Ш2 РПЗ С0ЯЗГП4.

0 25 50 75 100.

V, оо-?—?-[О—МП—? С108.

Рис. 1. а) Схематическое строение молекулы⁰¹ человека с легкой цепью ж-типа. Утолщенные линии с цифрами на границах обозначают гипервариабельные участки СБШ — СЭКЗ (схема приведена согласно [23]). б) Взаимное расположение константных ИИ-РИЛ, вариабельных СОШ-СЭКЗ регионов (сверху) и элементов вторичной структуры? — (3-складок, ?] - а-спиралей (снизу) в Уь-домене легкой цепи ж-типа человека (схема составлена по данным [19, 24]). чаще в CDR, чем в FR областях [25]. В непосредственной близости с антигеном отмечена высокая частота встречаемости остатков тирозина и триптофана [22].

Результаты многочисленных исследований комплексов антиген-антитело, позволяют выделить три различных типа структуры антиген-связывающих активных центров иммуноглобулина:

1. Полости (cavity) характерны для активных центров, связывающих низкомолекулярные лиганды (гаптены);

2. Выемки или бороздки (groove) образуют пептид-, ДНК-, полисахарид-связывающие активные центры;

3. Плоские (planar) области формируются активными центрами антител, взаимодействующих с белками [21].

Отмечены исключения из приведенной закономерности строения антиген связывающих активных центров: так активный центр антител к низкомолекулярным гаптенам может иметь форму бороздки, характерной для пептиди ДНКсвязывающих центров AT [26].

Активный центр антител является конформационно-лабильной структурой. Взаимодействие антител с лигандами может сопровождаться конформационными перестройками, которые варьируют от небольших сдвигов боковых цепей АК остатков до глобальных перестроек в третичной и четвертичной структуре Fab-фрагментов молекулы иммуноглобулина [21, 22, 27]. В тех случаях, когда в качестве лиганда выступает антиген, антитела меняют конформацию не существенно. То есть взаимодействие с антигеном в большинстве случаев соответствует механизму «ключа и замка». Однако при взаимодействии с соединениями структурно родственными антигену (перекрестная реактивность антител) или с соединениями существенно отличающимися от антигена (полиреактивность антител) структурная комплементарность может быть достигнута благодаря конформационным изменениям как антител, так и лиганда [28]. Таким образом, взаимодействие антител с лигандами может характеризоваться элементами механизмов индуцированного соответствия и деформации субстрата, характерных для взаимодействия ферментов с субстратами [29].

В образовании комплексов АТ-АГ важную роль играют молекулы воды. Так показано, что в случае комплексов AT с белковыми антигенами молекулы воды могут располагаться не только на периферии, но и в области непосредственно образующей плоский контакт АТ-АГ [30]. Молекулы воды обнаружены в областях контактов с антигеном антипептидных, анти-ДНК и антигаптеновых антител. При этом, молекулы воды могут выступать в качестве необходимого элемента, формирующего структурную комплементарность АТ и АГ [31].

Приведенные выше сведения о конформационной лабильности активного центра антител, возможности изменений в структуре антигена под действием антител, а также данные о доступности антигена для молекул воды позволяют говорить о элементах функционального сходства антител и ферментов.

Впервые гипотеза о возможности проявления антителами каталитических свойств была высказана Б. Дженксом [1, 32] в 1969 г. Гипотеза базировалась, с одной стороны, на концепции ферментативного катализа о комплементарности фермента переходному состоянию реакции, и, с другой — на возможности получения антител к широкому кругу стабильных аналогов переходных состояний. Таким образом Б. Дженкс предположил, что с помощью иммунизации гаптенами — стабильными аналогами переходных состояний (АПС) химических реакции могут быть получены антитела, катализирующие эти реакции. Как будет показано ниже, гипотеза Б. Дженкса послужила отправной точкой для получения антител-катализаторов (абзимов) самых различных химических превращений. Детальные исследования показали, что катализ реакций моноклональными антителами может осуществляться не только благодаря комплементарности переходному состоянию (по механизму «ключ к замку»), но и благодаря реализации элементов механизма индуцированного соответствия, кислотно-основного катализа и даже ковалентного катализа.

Открытие пептиди НК-гидролизующих абзимов в крови пациентов с заболеваниями, протекающими с нарушением иммунного статуса, показало возможность спонтанной индукции каталитической активности у антител. Полученных на сегодняшний день данных о строении активных центров и о механизмах катализа пока недостаточно для обсуждения структурно-функциональных основ каталитических свойств природных абзимов. Однако высказано несколько предположений, которые объясняют ферментоподобные свойства иммуноглобулинов. Одно из них базируется на возможности деформации субстрата (структурно подобного антигену) при связывании с антителами [33]. Другое предположение основывается на возможности формирования функциональных элементов ферментов на основе антиген-связывающих активных центров антител [34].

Моноклональные абзимы.

Описание взаимодействий рецептора и лиганда, фермента и субстрата строится на ряде общих принципов, основополагающим из которых является принцип структурного соответствия, или комплементарности биополимера лиганду, фермента — переходному состоянию реакции. Собственно концепция комплементарности фермента переходному состоянию введена Дж. Б. С. Холдейном и развита Л. Полингом в середине нашего столетия [35]. Опираясь на эту концепцию, Б. Дженкс в 1969 году, предложил использовать связывающий потенциал иммуноглобулинов для генерации биокатализаторов [1]. Первые экспериментальные попытки получить абзимы были предприняты Столляром Б. Д. и Разо В. [36], которые применили для иммунизации кроликов конъюгат Тч[-(5-фосфопиридоксил)-3'-амино-Ь-тирозина с БСА. Однако полученные к гаптену поликлональные антитела слабо ускоряли реакцию переаминирования Ь-тирозина [37]. И только с использованием гибрид омной технологии для отбора клонов антител-продуцирующих В-лимфоцитов А. Трамонтано с соавт. [2] удалось получить моноклональные абзимы с эстеразной активностью. Для получения таких абзимов, а в последствии и абзимов с амидазной активностью, применяли гаптены, которые отличаются от субстратов тем, что разрываемая в ходе реакции сложноэфирная или амидная связь субстрата (С-0 или С-1Ч) заменена в них на связи Р-0 или Р-Ы фосфонатной или фосфонамидной групп [38]. Подобные замены часто применяются при конструировании АПС. Они основываются на том, что процесс гидролиза сложного эфира или г.

К н амида протекает через образование о частично заряженного тетраэдрического переходного переходное остояние состояния атома углерода с участием молекулы воды, как показано на рис. 2 .

Пространственное V 6 0−1*1 iii аналог переходного остояния расположение лигандов при карбонильном атоме углерода в переходном состоянии II.

Рис. 2. Гидролиз сложного эфира (I), катализируемый АТ к аналогу переходного состояния реакции (III) соответствует таковому для заместителей при тетраэдрическом атоме фосфора в фосфонатной группе III. Поэтому антитела, обладающие высоким сродством к гаптену-АПС — III, при взаимодействии с субстратом снижают энергию активации реакции.

В частности, для иммунизации авторы работы [2] применили ряд АПС, из которых наилучшие результаты были получены с соединением IV (рис. 3).

Моноклональные антитела 6D4 к гаптену IV гидролизовали сложный эфир V с Кт = 1.9*10″ 6 М и? cat=2.7*10″ 2 с" 1, при этом достигалось ускорение реакции в 960 раз по сравнению с некаталитическим гидролизом этого эфира. С несколько меньшей скоростью протекал гидролиз эфира VI (kcat = 8*10″ 3 с^^б.г.Ю^М).

В этой работе, которая стала отправной точкой в получении и исследовании каталитической функции антител, впервые были предложены критерии сравнительной эффективности и специфичности катализа реакций абзимами. Критерий — kcJKm общепринят для оценки эффективности действия фермента, он служит мерой энергии кинетического барьера ферментативной реакции и ограничен величиной 109 M’V, когда лимитирующей стадией реакции является встречная диффузия фермента и субстрата. Другой критерий — это отношение константы скорости реакции превращения фермент-субстратного комплекса в продукт (kcat) к константе скорости превращения субстрата в продукт (?uncat) в отсутствие катализатора. Максимальное значение kcJkmuui для исследованных к настоящему времени ферментативных реакций достигает Ю10 [35].

Следующим шагом на пути генерации высокоэффективных биокатализаторов путем иммунизации стабильными АПС стала работа А. Трамонтано с соавт. [39]. Была гидролиза сложного эфира I [2]. о.

R = NHCOCF3 R'= NHCOCH3.

Рис. 3. Гаптен (IV) и субстраты (V, VI) моноклональных абзимов 6D4 [2]. сделана попытка улучшения каталитических свойств абзимов путем отбора моноклональных антител с наибольшим сродством к АПС IV R'= NHCO (CH2)4CON (COCH2)2 (рис. 3). Таким образом были получены моноклональные IgG — продукты клонов 50D8 и 57G4, которые катализировали гидролиз эфира V R'=NHCOCH3 (рис. 3). При этом активность AT 50D8 была сравнима с таковой для известных эстераз. Так, в частности, значение ксщ для антител 50D8 было всего в 10 — 100 раз ниже, чем у эстеразы печени свиньи в реакции гидролиза эфира, сходного с эфиром V, в 102 — 104 раз больше, чем значение kcat для химотрипсина в реакции гидролиза синтетических субстратов, и практически укладывалось в диапазон значений kcat для большинства других эстераз. Кроме того, параметр kcat/kmcat для абзимов 50D8 составлял ~106.

Существенное улучшение каталитических свойств 50D8 по сравнению с абзимами 6D4 (см. выше) достигнуто благодаря тому, что AT обладали высоким сродством (Ki = 50 нМ) к АПС, в то время как сродство к субстрату было достаточно низким: Кт реакции гидролиза эфира V составляло всего 1.5 мМ.

Для генерации AT, катализирующих гидролиз амидов, авторами работы [38] предложено использование фосфонамидного АПС IX (рис. 4). После иммунизации конъюгатом этого гаптена с БСА получены моноклональные AT, из которых 44 клона В-лимфоцитов были предварительно отобраны с использованием иммуноферментного.

VII он анализа, основанного на связывании абзимами АПС. Способностью гидролизовать амид VII (рис. 4) обладали продукты только одного клона — 43С9. Катализ в этом.

VIII случае характеризовался н следующими значениями параметров: kcat/ku"c!lt= 1.5 • 105, kcJKm=2.24 М" 1 с" 1.

IX.

Рис. 4. Реакции гидролиза амида VII и сложного эфира VII, катализируемые абзимами 43С9 к АПС IX.

Удивительной особенностью абзимов 43С9 оказалась их способность катализировать помимо гидролиза и-нитроанилидного производного VII еще и гидролиз и-нитрофенильного производного VIII. Причем гидролиз сложного эфира VIII отличался особенно высоким для абзимов значением отношения кса11Кт= 1.5*105 М" 1 с" 1 и i одним из самых высоких значений kcat= 40 с". Необходимо отметить, что абзимы 43 С9 с наилучшими эстеразными свойствами получали и отбирали с помощью АПС IX реакции гидролиза амида VII (рис. 4) [38]. Это свидетельствует, скорее всего, о непредсказуемости иммунной системы в генерации каталитически активных АТ.

Детальное исследование механизма гидролиза смешанных эфиров АТ 43С9 проведено С. Дж. Бенковиком с соавт. [40]. Было показано, что катализ реакции, приведенной на рис. 4 — многостадийный процесс (рис. 5), который в общих чертах напоминает гидролиз пептидов сериновыми протеазами. он.

Ab + S^=^ Ab*l—* Ab*P? *Ej=5 — Ab*^ +? Ab + I? + f.

АБС Д E.

Рис. 5. Механизм гидролиза сложных эфиров и амидов АТ 43 С9 [40].

Согласно данным кинетического анализа, абзимы образовывали ковалентный интермедиат (Ab*Pi) с карбоксильной группой продукта (рис. 5). То есть гидролиз, как и в случае сериновых протеаз, протекал по механизму «пинг-понг». Ускорение реакции АТ 43 С9 осуществляли не только благодаря стабилизации переходного состояния, но и благодаря реализации элементов кислотно-основного катализа. Результаты исследования кинетики гидролиза свидетельствовали также о существенных конформационных перестройках активного центра абзимов в ходе связывания субстрата, следовательно, 43 С9 подобно ферментам использовали механизм индуцированного соответствия.

Сходство антигенных детерминант аналога переходного состояния и субстрата, необходимое для генерации абзимов, приводило к тому, что продукт реакции обладал высоким сродством к активному центру абзимов. Поэтому лимитирующей стадией реакции гидролиза был процесс диссоциации комплекса фермент-продукт (стадия Е, рис. 5).

Дальнейшие исследования активного центра антител семейства 43 С9 опирались на данные о структуре комплекса абзим-аналог переходного состояния, которые были получены с помощью компьютерного моделирования, а также на данные анализа активности генно-инженерных конструкций на основе мРНК гибридомы 43 С9. Для получения таких конструкций кДНК копии суммарной мРНК гибридомы 43 С9 были встроены в фаг лямбда, после чего были отобраны фаги, экспрессирующие тяжелые или легкие цепи Ig [41]. Индивидуальные фаговые библиотеки тяжелых и легких цепей скрещивали и получали комбинированные библиотеки. Из них отбирали те библиотеки, которые экспрессировали высокоаффинные AT к гаптену — аналогу переходного состояния. Полученные таким образом генно-инженерные фаговые антитела проявляли каталитические свойства, сходные с продуктами исходной гибридомы 43С9. Сравнение последовательностей ДНК-копии мРНК антител 43С9 и ДНК, кодирующей генно-инженерные фаг-экспрессируемые антитела, показало их полную идентичность. На основе фаговой конструкции генов абзимов были получены генно-инженерные антитела, в которых вариабельные части тяжелой и легкой цепей соединены полиглициновым спейсером — NPN43C9 антитела (так называемые одно-цепочечные антитела) [42].

Авторами работы [43] показано, что остаток аргинина легкой цепи — Arg L 96 комплекса NPN43C9 с АПС IX расположен вблизи атома фосфора фосфонамидной группы АПС (рис. 6). Было высказано предположение о решающей роли этого остатка в катализе благодаря тому, что именно он осуществляет стабилизацию переходного состояния. Предположение было подтверждено после получения мутантных одно-цепочечных антител, в которых остаток Arg L 96 заменен на глутамин [43]. Мутантные антитела обладали способностью связывать субстрат, но были полностью лишены каталитической активности. Работы по сайт-направленному мутагенезу выявили также роль в катализе остатка гистидина His L 91 (рис. 6), имидазольная группа которого,.

Фосфонамидный Тетраздрическии аналог субстрата атом фосфора л.

Туг L 32.

Туг Н 95.

His Н 35.

His L 91.

Arg L96.

Рис. 6. Фрагмент активного центра АТ 43 С9 как предполагают авторы [44], является в комплексе с аналогом переходного состояния IX. нуклеофилом, образующим интермедиат с ацильной группой субстрата.

О существовании ацильного интермедиата Ab*P? (рис. 5) свидетельствовали косвенные данные кинетических экспериментов [40], однако прямое доказательство было получено недавно масс-спектрометрическим методом [45]. Показано, что при насыщающих концентрациях субстрата приблизительно 8% антител 43С9 находятся в ковалентном комплексе с продуктом. Мутантные His L 91 — Gin «одно-цепочечные» антитела обладают способностью связывать субстрат и не образуют с ним промежуточного соединения. Участие имидазольной группы гистидина в образовании ацильного интермедиата антителами 43 С9 авторы отмечают как беспрецедентное для действия аналогичных протеаз.

Недавно опубликованные данные рентгеноструктурного анализа абзимов 17Е8 с эстеразной и амидазной активностями в комплексе с АПС показали, что, как, и в случае 43 С9 антител, гидролиз протекает с образованием промежуточного ацильного интермедиата [46]. При этом в качестве акцептора ацильной группы субстрата выступал остаток серина антител 17Е8. Нуклеофильность остатка серина в активном центре была существенно увеличена благодаря взаимодействию с остатками гистидина и аспарагина. Механизм, реализуемый 17Е8, близок к механизму действия сериновых протеаз настолько, что сохранял даже каталитическую триаду Ser-His-Asp, характерную для активного центра трипсина [46].

АПС-гаптены абзимов 43С9 и 17Е8 не включали в себя структурные элементы, которые целенаправленно могли бы привести к реализации такого сложного механизма катализа. Возможно, что генерация иммунной системой абзимов, реализующих практически весь набор элементов катализа, присущий природным ферментам с аналогичной активностью, является вполне закономерным процессом. Ответ на вопрос о том, почему абзимы с наилучшими кинетическими характеристиками «организуют» процесс катализа подобно ферментам, может помочь в решении многих проблем, связанных с исследованиями как моноклональных, так и природных каталитических AT.

Разрешению интригующего вопроса о реализации различных механизмов катализа семейством абзимов, полученных с помощью иммунизации одним АПС посвящен ряд работ [47, 48]. Как было отмечено выше, при получении «одно-цепочечных» антител из фаговых библиотек легких цепей и библиотек тяжелых цепей авторы работы [41] скрещиванием получали библиотеки, экспонирующие на поверхности фага функциональные антитела. Аналогичным образом с использованием гена тяжелой цепи абзимов 43 С9 и фаговой библиотеки статистического набора генов легких цепей были получены несколько конструкций «одно-цепочечных» антител с эстеразной активностью [48]. Анализ ДНК легких цепей этого семейства абзимов с 43С9 подобной активностью выявил высокую степень гомологии внутри этого семейства и 9698% гомологию с легкой цепью антитела 43С9. При этом все легкие цепи абзимов демонстрировали консервативность остатков Arg L 96 и His L 91 (рис. 6) и их ближайшего аминокислотного окружения. Параметры kcat/kmc.dt у всех членов семейства таких антител были приблизительно одинаковы. Эти данные свидетельствуют о том, что в ходе формирования иммунного ответа к гаптену — АПС, предельное сродство и наилучшие каталитические характеристики достигаются абзимами семейства 43С9. Дальнейшее улучшение каталитических свойств AT требует изменения в консервативных участках вариабельных регионов. Такие изменения можно производить в настоящее время только с помощью генно-инженерных конструкций, но не с помощью иммунизации и гибридомной технологии. Последняя работа Г. П. Миллера с соавт. [48] устанавливает границы применения метода иммунизации гаптенами-АПС для получения ферментов с заранее заданными свойствами. Таким образом, структура активного центра антитела является первым «шаблоном», с получением которого открывается возможность дальнейшего конструирования еще более эффективных и специфических биокатализаторов.

Детальное исследование механизма катализа гидролиза эфиров и амидов абзимами выявило ряд закономерностей, характерных и для других реакций, катализируемых моноклональными AT к АПС.

Прежде всего необходимо отметить влияние структурного сходства АПС субстрата и продуктов реакции. Высокое сродство к переходному состоянию в случае моноклональных антител не может быть обеспечено только изменяющимися в ходе превращения группами субстрата. В энергетику связывания существенный вклад вносят неизменные группы субстрата [49]. Поэтому лимитирующей стадией каталитического превращения, зачастую, является диссоциация фермент-субстратного комплекса. Может иметь место также и ингибирование продуктом реакции. Генно-инженерные абзимы могут быть лишены такого недостатка [50].

Наибольший вклад в связывание субстрата AT семейства 43С9 вносят остатки аминокислот тяжелой цепи, а аминокислоты легкой цепи участвуют в генерации и стабилизации переходного состояния реакции, то есть непосредственно осуществляют катализ [43]. Удивительно, что аминокислотные остатки легкой цепи большинства исследованных природных и гибридомных абзимов играют решающую роль в катализе. Фундаментальные исследования взаимодействия антител с антигеном свидетельствуют о том, что тяжелая цепь вносит больший вклад в узнавание антигена, чем легкая цепь [51]. Видимо в этом и заключается больший «каталитический потенциал» легкой субъединицы олигомера I". Возможно, что структура легкой цепи обеспечивает реализацию того или иного механизма катализа.

Работы, касающиеся получения и исследования свойств абзимов с эстеразной и амидазной активностью, являются лишь небольшой частью огромного числа публикаций, посвященных методам генерации каталитических антител (для обзора см. [52, 53]). Некоторые примеры гаптенов, использованных для иммунизации, и субстраты катализируемых моноклональными абзимами реакций, приведены в конце главы в таблице 1. Из данных таблицы видно, что дизайн гаптена позволяет получать антитела, которые осуществляют стереоспецифический катализ реакций, субстраты и продукты которых не имеют аналогов в живой природеа кроме того катализ реакций, механизм которых не реализуется природными биокатализаторами. В настоящее время описано более 100 реакций, катализируемых моноклональными абзимами, полученными как иммунизацией различными гаптенами — стабильными АПС, так и с помощью других подходов.

Один из принципиально новых подходов к конструированию гаптенов для получения абзимов с заданными каталитическими свойствами был предложен авторами работы [54]. Была сделана попытка генерировать в активном центре антител набор аминокислотных остатков, характерных для активных центров ферментов, путем введения в гаптен специфических иммуногенных групп.

Для того, чтобы окружение гапетна в активном центре абзима содержало аминокислотные остатки с карбоксильной группой (глутамат или аспаратат), в состав нитрофенильного производного X (рис. 7) было введено положительно заряженное при физиологических значениях рН четвертичное аммониевое основание. Авторы [54] предполагали, что карбоксильная группа в активном центре абзима будет выступать в качестве промежуточного акцептора протона (такова роль остатков глутамата и аспартата в гидрофобном окружении активных центров некоторых ферментов). Полученные к гаптену X моноклональные абзимы 43Б4−303 действительно катализировали реакцию (3-элиминирования, приведенную на рис. 7. Отношение кса1/Кт для этой реакции было найдено равным 1.38*102 М1с" '. При этом достигалось более чем 1000-кратное ускорение реакции по сравнению с некаталитическим процессом. Исследования кинетических закономерностей превращения, а также ингибирование реакции в результате специфической ковалентной модификации карбоксильных остатков антител свидетельствовали об участии в катализе АК остатков глутамата либо аспаратата, что практически подтверждало эффективность предложенного подхода к выбору гаптена. Необходимо отметить, что в данном случае гаптен не был подобен АПС, более того, он имел противоположный переходному состоянию заряд. Предложенный авторами [54] подход в дальнейшем был адаптирован для получения антител, способных катализировать реакцию дегидратации [55,] и реакцию цис-транс изомеризации [56] (таблица 1). О.

Г^чг МН г он.

Р о X.

ОМ.

XI.

Рис. 7. АПС X и реакция (3-элиминирования катализируемая АТ43Б4-ЗБЗ [54].

При конструировании аналогов переходного состояния реакции Дильса — Альдера авторы работы [57] опирались на достаточно хорошо изученный механизм реакции с участием М-замещенного малеимида XIV (рис. 8). Моноклональные АТ 1Е9 связывали аналог переходного состояния XII с Кд =1.3*10″ 6 М и ускоряли двусубстратную реакцию циклизации приблизительно в 10 раз (рис. 8). В дальнейшем этот подход был использован для получения абзимов, катализирующих стереоспецифическую конденсацию по Дильсу-Альдеру [58] (таблица 1). Приведенные примеры катализа реакций, механизм которых не реализуется в живой природе, наиболее ярко демонстрирует возможности использования гаптена-АПС для наработки абзимов с заданной ферментативной активностью.

XIII XIV.

Рис. 9. Аналог переходного состояния XII и реакция Дильса Альдера, катализируемая антителами 1Е9.

Наибольшее ускорение реакции в присутствии абзимов (kcal/kunoat = 109) показано с использованием оригинального подхода, предложенного в работе [59]. Для генерации антител, катализирующих конденсацию ацетона с альдегидом XVI (рис. 9), в качестве гаптена использовали дикетон XV, предполагая, что активные центры AT с наивысшим сродством к XV будут содержать реакционоспособный остаток лизина. Взаимодействие гаптена с антителом будет протекать с образованием основания Шиффа. Этот подход, направленный на генерацию гаптеном его ковалентного взаимодействия с AT, авторы назвали «реактивной иммунизацией» (reactive immunization [60]). Предполагалось также, что s-аминогруппа лизина в реакции с альдегидом XVI будет образовывать ковалентный интермедиат, который после связывания второго субстрата — енолята превратится в продукт реакции XVII.

После иммунизации мыши и наработки первичных клонов В-лимфоцитов были получены комбинированные фаговые библиотеки генов тяжелых и легких цепей.

XVI XVII.

Рис. 8. Гаптен XV, использованный [59] для генерации АТ, катализирующих превращение альдегида XVI в альдоль XVII иммуноглобулинов [61]. Фаги отбирали по способности ковалентно связываться с иммобилизованным гаптеном XV. Таким образом были получены фаги, которые экспонировали антитела, содержащие в активном центре лизин. Описанный подход, сочетающий элементы гибридомной технологии и фагового дисплея, оказался чрезвычайно эффективным и позволил получить абзимы-альдолазы, демонстрирующие рекордное ускорение и 95%-ую стереоселективность катализируемой реакции.

Как видно из приведенных выше примеров, современные подходы к получению абзимов сочетают в себе не только дизайн гаптена и наработку моноклональных антител к нему, но и получение генно-инженерных конструкций на основе АТ, а в некоторых случаях еще и рациональное изменение активного центра путем сайт-направленного мутагенеза. Большинство достижений в этой области запатентовано авторами приведенных выше работ. Необходимо отметить также, что именно практическая ценность биокатализаторов является основной движущей силой исследований моноклональных абзимов. Вместе с тем в этих исследованиях остается не решенным фундаментальный вопрос о возможности наличия естественной каталитической функции у «природных» антител.

Как сообщают авторы обзора [62], первые попытки выявить собственную каталитическую активность антител были проделаны еще в середине 60-х годов. Л. И. Слоубин [63] в 1966 г. показал ускорение гидролиза и-нитрофенилацетата в присутствии антител. Кульберг А. Я. с соавт. [64] в 1968 открыл способность ^ кролика к аутопротеолизу при кислом значении рН. Однако, наиболее убедительные и обширные данные, подтверждающие наличие у иммуноглобулинов естественной способности не только связывать, но и химически трансформировать лиганды были получены в течение последнего десятилетия.

Таблица 1.

Гаптены, использованные для иммунизации, субстраты и продукты реакций, катализируемых моноклональными абзимами.

Гаптен Субстрат Продукты AT условия реакции Km, MKM kcat c-1 Acat/A" m M-l • с" 1 Литература.

Гидролиз карбонатов О | 0 1 OtN—\)/—^ О — | С02 | + НО^—'f МОРС 167 pH 7.0, ЗОоС 208 0.007 3.36 [65] но, но ос О OjN-^^-OH co2 МеОН 7K16.2 pH 7.5, ЗОоС 3330 5.2*10−3 1.56 [66].

Гидролиз сложных зфиров —V хОН соон О OjN-^^-OH НО^Ч НОл yv 4 NH О CNJ1S7 pH 8.0 110 0.040 364 [67] ч о jm соон о 20G9 pH 8.8, 25oC 300 0.152 500 [68] о. он соон 0 но^ KD2−260 pH 6.0,20oC 4.9 0.042 8600 [69].

VJOI V-WHO II X=(CH2)3NHC0CH2C02H ч «уос» > СУ" «Ш 3B9 pH 7.7 490 0.0018 3.74 [70].

Гидролиз амидов H2N-v 0 Gly Phe? Ala HO-CGty СООН Gly Phe NH2? Ala НОгС-GIy 28F11 pH 6.5, 37oC — 6−10−4 — [71].

Гидролиз зфиров ОСНз &bdquo-фл О ОН 0 ОСНз ОСНз НзСО-d у—0^ о ф i ОСНз ОСНз 6 НзСО—^ —OH лф H0 ^ ОСНз OH 37C4 pH 6.0 31 1.6−10−3 54 [72].

О О N r/ r, rl= СНз, r2=Ar ч&trade-] НО HO 14D9 pH 5.7,37oC 340 9.5−10−5 0.279 [73].

Таблица 1 (продолжение).

Гаптен Субстрат Продукты АТ условия реакции мкМ ксаЬ с-1 М-1 • с-1 Литература.

Гидролиз кеталея Н02С1Ш-| СУ Д — .он 0 N11 ^^ .О Д ^ .он о гчн ноО он Д .он 1409 рН 5.7, 20оС 100 7.5−10−5 0.78 [56].

Гидролиз зпоксидов 1ЧН Н02С «1 0 Д .он 0 гш ^^ о^Т / о мн'4⁰» но.^, но Д ^^он 0 NH ^^ 14Б9 рН 5.6, 240С 25 2.9.10−5 1.0 [74].

С02И Г^ О но2с-^)—^ но но, с—6 Ъ—' о—' 2609 рНб. б 356 1.5−10−3 43 [75].

Трансзтерификация. п? 1 [-он СНзСНО и и"Л" 2Н6−1 2200 0.067 30 [76].

Образование амида со2н ' ТОо Р О, о, р Ш -0 он XX. 17С8 рН 8.0,23оС 2200 3.8−10−4 0.173 [77].

Из омеризация 11 н Ц1 02 М ^^ N02 со, н 1М02 о 0, N N0, DY. il 0−4 рН 7.5 220 0.08 364 [56].

Восстановление «Хи5 он «ХХХр о 1411 о А5 рН 5.0 1240 0.0017 14 [78] сгг IX? 37В39.3 рН 5.0 52 0.0016 32 [79].

Таблица 1 (продолжение).

Гаптен Субстрат Продукты AT условия реакции мкМ fccat с-1 ^cat^m M-l • с-1 Литература.

Декарбоксиляроваыие S03H L-, SO3H 1—rNHX NH ^^-OH co2 21D8 pH 8.0,20oC 168 0.28 1667 [80].

Реакция Дильса-Алвдера A Ш> То 0*4 Г но2с—-J O^NH 0 рл 7D4 pH 7.4,370C Диен Диенофил 960 1700 5.7.10−5 0.06 0.034 [58].

4x1 HN N но2с¹ O^^NH 0 ^^COjH 22С8 pH 7.4, 370С Диен Диенофил 700 7500 5.3.10−5 0.076 0.007 [58].

0 0 0 <А О 0 0 оА 0 0 0 НИ Диенофил 8300 0.055 6.6 [81].

Перегруппировка Кляйзена H Н02с oj.

Дегидратация Н02с—v 02N-/ - н-f H20 20A2F6 рН 7.0,370С 1100 5.8.10−6 5.3.10−3 [55].

Взаимодействие порфирина с металлом M y-NH N \ Н3С. Ё Г~ N N’A NH N-аУ I н. J / N N— / N' 4N" 7G12-A10-G1-A12 Zn++ Си++ 49 50 8.6.10−6 1.4*10−6 0.17 0.028 [83].

СГ^ОН О ОН O^OH О ОН O^OH СГЧ) Н.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые показано, что поликлональные slgA и IgG антитела (AT) молока человека обладают нуклеотид-гидролизующей активностью. Каталитические свойства AT сохранялись после ряда хроматографических стадий очистки, обработки иммуноглобулинов кислыми буферами и хаотропными агентами, разрушающими нековалентые взаимодействия белковэлектрофореза в диссоциирующих условиях и получения Fab-фрагментов AT с помощью их гидролиза протеазами. Показано, что в формирование активных центров AT вовлечены как тяжелые, так и легкие цепи олигомеров.

2. Показано, что slgA и IgG антитела проявляют широкую субстратную специфичность в реакции гидролиза нуклеотидов. Имея определенное сходство с описанными ранее фосфатазами и АТРазами, поликлональные нуклеотид-гидролизующие абзимы в то же время существенно отличались от этих ферментов по ряду термодинамических и кинетических характеристик, а также субстратной специфичности. Способность нуклеотид-гидролизующих абзимов взаимодействовать с ДНК, нуклеотидами и различными белками, включая белки Е. coli, может указывать на полиреактивные свойства таких AT, а также на возможность их индукции под действием бактериальных компонентов кишечной флоры.

3. Впервые показано, что лактоферрин (ЛФ) молока человека связывает и гидролизует АТР. Согласно данным исследования АТР-гидролизующей активности белков молока после их разделения электрофорезом в денатурирующем условиях, ЛФ является основным белком молока с такой гидролитической функцией. Показано, что аффинная модификация ЛФ 2', 3'-диальдегидным производным АТР (оАТР) приводит к образованию основания Шиффа с одним из остатков лизина, С-концевого домена белка. Стехиометрия ковалентной модификации составляет 1 моль оАТР на моль белка. АТР-связывающий участок ЛФ не совпадает и не перекрывается с описанными ранее полианион-связывающим и антибактериальным кластерами ЛФ. Взаимодействие ЛФ с АТР приводит к диссоциации его олигомерных форм до мономеров и изменению характера его взаимодействия с полисахаридами, нуклеиновыми кислотами к некоторыми белками, что может указывать на регуляторную функцию АТР-связывающего центра ЛФ.

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Молоко содержит исключительно большой набор биологически активных компонентов, способных обеспечить рост и развитие млекопитающих на ранних стадиях постнатального онтогенеза. Биохимические и молекулярно биологические свойства компонентов молока в настоящее время являются предметом интенсивных исследований. Это обусловлено тем, что компоненты молока проявляют антивирусные и бактерицидные свойства [131, 146], обладают гормональной активностью [168], способны активировать апоптоз раковых клеток [169], а также важны для создания пассивного иммунитета у новорожденных.

Последние исследования в этой области в основном сосредоточены на лигандсвязывающих и ферментативных свойствах, проявляемых компонентами молока. Изучение механизмов взаимодействия компонентов молока с белками, нуклеиновыми кислотами и низкомолекулярными лигандами ведет к пониманию различных аспектов функционирования иммунной системы, процессов транспорта и метаболизма соединений в организме.

В настоящей работе впервые проведено исследование взаимодействия антител и ЛФ молока человека с нуклеотидами. Получены результаты, свидетельствующие о наличии у этих белков собственной нуклеотид-гидролизующей активности. При этом показано, что активность антител человеческого молока носит неспецифический фосфатазный характер, в то время как детали процесса взаимодействия ЛФ с АТР указывают на специфические АТР-связывающие и АТР-гидролизующие свойства этого белка. Принимая во внимание бактерицидную и антивирусную активность ЛФ и ^ (как показано ранее [170, 171], э^А проявляют эту активность кооперативно с ЛФ) можно предположить, что описанные в данной работе свойства являются важными для функционирования секреторной иммунной системы человека в целом.

Опубликованные ранее результаты исследования протеинкиназной [15, 16] и НК-гидролизующей [17, 18] активностей АТ человеческого молока в совокупности с нашими данными позволяют говорить о реализации секреторной иммунной системой каталитического потенциала активных центров АТ в отсутствие аутоиммунной патологии, а также в отсутствие иммунизации аналогами переходных состояний химических превращений.