Обмен аминокислот и углеводов у бруцелл различной вирулентности и агглютинабельности

Бруцеллез относится к наиболее распространенным и опасным заболеваниям животных и человека" Полная ликвидация бруцеллеза является актуальной задачей, стоящей перед ветеринарной и меди* цинской наукой. Сложность этой проблемы обусловливается рядом особенностей биологии возбудителя этого заболевания.

Наличие широкого круга естественных носителей (млекопитающих, птиц, клещей и насекомых), длительное пребывание в пораженном организме, высокая устойчивость против неблагоприятных условий внешней среды свидетельствуют о большой пластичности свойств бруцелл.

Очевидно, что для успешной борьбы с бруцеллезом необходимы подробные сведения об особенностях биологии его возбудителя, обеспечивающих приспособление к изменяющимся условиям окружающей среды. Особый интерес представляет изучение метаболизма бруцелл, так как каждое биологическое явление, каждый признак живого организма является результатом сопряженных биохимических реакций (В.Г.Петровская, 1967).

Кроме того, в последние годы делаются попытки дополнить существующую таксономическую характеристику бактерий новыми биохимическими показателями, которые могли бы быть использованы для создания автоматизированных систем идентификации. В связи с этим актуальным является подбор стабильных и легко воспроизводимых биохимических тестов, характеризующих тот или иной вид, штамм бруцелл. Однако эта задача осложняется вариабельностью многих метаболических показателей, поэтому изучение метаболизма бруцелл следует вести с учетом их изменчивости.

В последние годы получены сведения о наличии у бруцелл ряда ферментных систем, катализирующих процессы синтеза и деградации аминокислот, глюкозы, эритрита, а также энзимов цикла трикарбо-новых кислот и дыхательной цепи (Cutinelli, 1945; К. П. Студенцов и др., 1966; Е. А. Драновская и др., 1968; Robertson et al., 1968; P.M.Ароне и др., 1974).

Установлены некоторые особенности метаболизма бруцелл, имеющих различные антигенные и вирулентные свойства (Wilson et alj I960- П. А. Вершилова и др., 1967; В. Д. Тимаков и др., 1968; Е. А. Драновская, Н. И. Островская, 1970; В. Ф. Резников, 1977; С.П.Ме-ринов, Э. Б. Санченко, 1978; А. Ф. Пинигин и др., 1980; М. М. Ременцова и др., 1981).

Однако эти данные разрознены и иногда противоречивы. Недостаточно изученными остаются особенности метаболизма бруцелл, находящихся в промежуточной SR-форме. В частности, мало сведений о биохимической активности Br. abortus 82, живая вакцина из которого широко применяется для иммунизации крупного рогатого скота в нашей стране.

Исходя из вышеизложенного, целью работы было изучение обмена аминокислот и углеводов у бруцелл различной вирулентности и анти-генности, а также более углубленная биохимическая характеристика вакцинного штамма 82. При этом в задачи исследований входило:

1) изучить сахаролитические свойства бруцелл различной вирулентности и антигенности;

2) определить активность ферментов аминокислотного обмена у S-, SRи Rштаммов Br. abortus ;

3) изучить окислительную и дегидрогеназную активность различных штаммов возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота;

4) разработать дополнительные биохимические тесты, пригодные для идентификации культур бруцелл вакцинного штамма 82.

Работа выполнена согласно плану научных исследований лаборатории по изучению бруцеллеза КВИ по теме 0I.05.H4 — Дать предложения о внедрении новых методов и средств борьбы с бруцеллезом сельскохозяйственных животныхтемы 01.02.05.М2 — Разработка новых и усовершенствование существующих вакцин против бруцеллеза крупного рогатого скота, овец и северных оленей.

Научная новизна. Впервые с применением современных методов (аппарата для замера ионов водорода — АЗИВ-2, анализатора ферментативной активности — АФ-I, автоматического аминокислотного анализатора) изучена окислительная активность и процессы дезаминиро-вания декарбоксилирования и трансаминирования аминокислот у S-, SRи Rштаммов Br*abortus различной вирулентности. Определена сахаролитическая и дегидрогеназная активность у различных штаммов бруцелл.

Исследованиями установлено, что бруцеллы расщепляют ряд углеводов, в основном моносахаридов, и осуществляют интенсивное де-карбоксилирование, дезаминирование и трансаминирование аминокислот. Выявлены отличительные особенности в обмене аминокислот и углеводов у типичных S — и измененных SR — и Rформ.

Слабовирулентный вакцинный штамм 82 проявлял характерные для Br. abortus окислительные свойства. Вместе с тем, обладал рядом отличительных особенностей метаболизма, которые стабильно сохранялись при различных режимах культивирования и пассировании через организм лабораторных и сельскохозяйственных животных. В частности, культуры вакцинного штамма 82, в отличие от вирулентного штамма, медленнее окисляли аланин и фруктозу, а сукцинат натрия не ингибировал их дегидрогеназную активность.

Полученные данные расширяют существующие представления о биологии возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота.

Практическая ценность. Выявление особенностей метаболизма штаммов бруцелл, различающихся по антигенным и вирулентным свойствам, могут быть учтены при диагностике бруцеллеза и изучении генетики возбудителя этой инфекции.

Разработанная нами методика измерения интенсивности дыхания бактерий с применением прибора АЗИВ-2, значительно упрощает технику определения окислительных свойств бруцелл, которая является одним из основных методов дифференциации видов и биотипов бруцелл. Предлагаемая методика менее трудоемка и легко воспроизводима в условиях ветеринарных лаборатории.

Сконструирована новая среда для определения сахаролитических свойств бруцелл, позволяющая быстро и объективно определить их ферментативную активность. Эта среда с успехом может быть использована для биохимической характеристики культур бруцелл.

На основе изучения биохимических свойств бруцелл определены дополнительные тестн, пригодные для идентификации культур штамма 82 различного происхождения.

По результатам проведенных исследований оформлена одна заявка на предполагаемое изобретение «Синтетическая среда для определения сахаролитических свойств бруцелл» (приоритетная справка № 3 567 724/15 от 8 февраля 1983 года) и внесены два рационализаторских предложения. Материалы диссертации учтены при составлении проекта «Инструкции по изготовлению и контролю сухой живой вакцины из слабоагглютиногеиного штамма 82», а также используются при чтении лекций по курсу ветеринарной микробиологии студентам и слушателям факультета повышения квалификации Казанского ветеринарного института.

Основные положения диссертации выносимые на защиту. На обсуждение выносятся следующие положения диссертации:

— Результаты изучения особенностей углеводного и аминокислотного обменов бруцелл различной вирулентности и агглютинабель-ности/.

— Результаты изучения окислительной активности бруцелл различной вирулентности и агглютинабельности.

— Итоги разработки дополнительных биохимических тестов, пригодных для идентификации культур бруцелл вакцинного штамма 82.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

— ежегодных научных сессиях Казанского ордена Ленина ветеринарного института имени Н. Э. Баумана по обсуждению отчетов о выполнении планов НИР (1976;1982 г.);

— итоговых научных конференциях Казанского ордена Ленина ветеринарного института имени Н. Э. Баумана;

— Юбилейной научной конференции, посвященной 110 -летию образования Казанского ветеринарного института им. Н. Э. Баумана;

— Республиканской научно-производственной конференции по проблемам лечения зоонозных заболевании и лейкозов (Гродно, 1982 г.);

— совместном заседании научных сотрудников лабораторий биохимии, микробиологии, экспериментальной иммунологии и лаборатории по изучению бруцеллеза КЕМ. Казань, 3 октября 1883 г.

По материалам диссертации опубликовано шесть научный работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА. I. НОМЕНКЛАТУРА, КЛАСОШКАЩЯ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ И СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БРУЦЕЛД.

Обоснованием для объединения группы возбудителей таких инфекционных заболеваний, как мальтийская лихорадка, инфекционный аборт коров и свиней в род Brucella послужило сходство их куль-туральных, морфологических и биологических свойств. В предложенной Evans (1918), Huddleson (1920) классификации род Brucella включал в себя лишь 3 вида, вызывающих характерную клинику заболевания главным образом у коров, свиней и овец.

В последующие годы в номенклатуре бруцелл возникли определенные трудности в связи с выделением от различных животных бактерий, сходных по многим признакам с бруцеллами, но имеющие существенные особенности, не позволяющие включить их в тот или иной вид (Burgisser, 1951; Renoux, 1954; Niznansky, 1958; Е.И.Кайт-мазова и др., I97I). stoenner et al. (1957) вццелили из крыс штамм бруцелл, отличающийся своеобразным окислительным метаболизмом (Cameron et al., 1958), чувствительностью к фукцину и тионину, резистентностью к фагу ТБ. Авторы сочли возможным выделить этот штамм в особый вид Br. neotomae.

В последующем бруцеллы были выделены от северных оленей (И.М.Голосов и др., 1959; П. Н. Давыдов, 1966; В. А. Забродин, 1968), от собак (Buddle, 1951; М. М. Ременцова и др., 1956), от зайцев (Renoua 1954; Bendtsen, 1956; М. М. Ременцова, 1959) и других домашних и диких животных.

Buddle et al. (1953) выделили из организма баранов, страдающих орхитами, абортировавших овцематок, микробы, имеющие сходные с бруцеллами признаки. Эти бактерии имели стойкую шероховатую форму и были отнесены к самостоятельному виду Br. ovis •.

В действующей номенклатуре, принятой в 1978 году Подкомитетом по таксономии бруцелл Международного комитета по номенклатуре бактерий, род вгисе11авключает б видов и 20 биотипов, в том числе Br. abortus — 9, Br. melitensis- 3, Br. suis — 5, Er. neotomae Br. ovis И Br. canis — ПО одному.

Разумеется, существующая классификация бруцелл отражает сегодняшний уровень изученности биологии этого возбудителя и не может быть лишена недостатков. Свидетельством этого является наличие большого количества атипичных штаммов бруцелл. Значительные затруднения возникли также в связи с определением таксономического положения бруцелл, вццеленных от мышевидных грызунов Северного Кавказа.

Б.А.Драновская и др. (1983) — Г. И. Лямкин и др. (1983) считают целесообразным отнести эти штаммы к новому биотипу Br. suis.

По мнению И. Ф. Таран и др. (1972), действующая классификация бруцелл не учитывает особенностей шероховатых форм бруцелл, сущность, природа и эпизоотологическое значение которых еще не полностью изучены.

В соответствии с решениями Подкомитета по таксономии бруцелл, Международного комитета по номенклатуре бактерий (1970, 1978), природные штаммы бруцелл в шероховатой форме, изолированные от овец и гончих собак, вьщелены в самостоятельные виды Br. ovis и.

Br.canis.

Однако ряд авторов считает это решение не оправданным, так как по окислительному метаболизму, антигенной структуре и некоторым другим признакам гладкие варианты Вт. сanis близки к виду Br" suis (Moore, 1967, Jones et al., 1968), a S-формы Br. ovis мало отличаются от штаммов Br. melitensis (А.Ф.Пинигин и др., 1980).

В настоящее время род Brucella классифицируется по методикам, рекомендованным Подкомитетом по таксономии бруцелл (Женева 1978), в том числе по чувствительности к фагу «ТВ», потребности первых генераций культур в повышенной концентрации GOg в атмосфере, по продуцированию Hg s, чувствительности к анилиновым красителям (фукцин и тионин), агглютинабельности монорецепторными R-, Аи М-сыворотками, вирулентности для некоторых видов животных, а также по способности утилизировать ряд аминокислот и углеводов (Stablefort et al., 1962; Jones, I964jAlton et al., 1977),.

Однако типирование бруцелл значительно затрудняется из-за их H3MeH4HBocTi.

Некоторые исследователи предлагают использовать при решении вопросов таксономии этого возбудителя методы иммуноэлектрофореза или двойной диффузии в геле (Наиз1ег et al., 1974; Paraas f 1976; Ja-sagama, 1980; Meyer, 1981 — Morigon f 1983),.

По мнению Deley (1978), В. Г. Петровской (1982), на сегодняшний день наибольшее применение находят методы, направленные на изучение в таксономических целях генетического аппарата бактерий, в том числе, определение размера и состава ДНК, соотношения в ней отдельных азотистых оснований, методы гибридизации ДНК (ДНК-ДНК и днк-гаю.

Особую ценность имеют результаты определения химического состава гетерополимеров клеточной стенки с применением таких современных биохимических методов, как газожидкостная хромотография и диск электрофорез, электрофоретическое изучение ферментов бактерий, инфракрасная спектроскопия целых клеток и его структур и т. д.

Появление новых биохимических методов исследований, обладающих большой разрешающей способностью, позволило разработать новые принципы таксономии микроорганизмов, к которым относится, в частности, числовая или адансоновая таксономия. По мнению ряда исследователей (DeLey et al, 1978; В. Д. Тимаков и др., 1980; В. Г. Петровская, 1982), она является наиболее перспективной в систематике бактерий.

Числовая таксономия предусматривает наиболее полную характеристику фенотипических свойств микроорганизмов: морфологических, биохимических и серологических, характера питательных потребностей и т. д. В связи с этим по-прежнему не теряют значение метаболические тесты, применяющиеся в дифференциации бактерий, в том числе и бруцелл (DeLey, 1978, Jasagama, 1980, Г. А. Грушина, 1979; Meyer, 1981).

Бруцеллы представляют собой мельчайшие бактерии разнообразной формы — от кокковидной до палочковидной. Длина палочковидных форм достигает 1−2мкм в длину и 0,3−0,5 мкм в ширину (П.Ф.Здро-довский, 1953). В мазках из культуры бактерии располагаются чаще одиночно, иногда попарно или в виде цепочки. Бруцеллы не обладают подвижностью, спор не образуют (М.К.Юсковец, I960) в определенных условиях могут образовывать капсулу (П.А.Вершилова, 1972; Oberti et al., 1982).

Все типы бруцелл легко окрашиваются анилиновыми красителями, грамотрицательны. Специфичным для них является метод окраски по Е. В. Козловскому (1936), основанный на ярко красном окрашивании бактериальных клеток сафранином, которую они сохраняют после обработки мазка малахитовым зеленым, в то время как большинство бактерий воспринимают при этом зеленый цвет.

Бруцеллы требовательны к питательным средам. Свежевыделенные штаммы плохо растут на искусственных и естественных питательных средах и нуждается в повышенной концентрации углекислого газа в атмосфере (5−10%). Однако лабораторные культуры бруцелл дают обильный рост через 24−48 часов и в обычной атмосфере.

Для культивирования бруцелл применяются жидкие и плотные питательные среды. Наиболее приемлемы печеночные среды с добавлением глюкозы и глицерина. Применяются также и сухие среды, изготовленные на основе рыбных и дрожжевых гидролизатов.

Для улучшения роста бруцелл Объединенный комитет по бруцеллезу Ш0/ ВОЗ (1970) рекомендовал ввести в состав основных сред нормальную сыворотку крови животных.

По мнению Alton, Jones (1977), наиболее благоприятными для культивирования бруцелл являются сывороточно-декстрозная среда или декстрозный агар с твином — 40. Хорошие результаты получены также при выращивании бруцелл на агаровой среде с сывороткой и картофельным настоем, на триптозном агаре (Дифко) и триптиказном агаре (США-Франция).

Однако использование обогащенных сред может привести к нежелательным явлениям. Так, например, М. К. Юсковец и др. (1955), наблюдали признаки диссоциации у культур бруцелл, выращенных на средах с желчью, иммунной сывороткой, аланином и глицерином.

Рост культур бруцелл в жидких средах сопровождается помутнением среды, а в более поздние сроки образуется осадок.

На плотных агаровых средах бруцеллы образуют мелкие, с ровными краями и гладкой поверхностью колонии, на поверхности которых иногда можно заметить нежную зернистость. При удлинении периода культивирования колонии становятся менее прозрачными.

Форма, состояние поверхности, размер и другие признаки колоний бруцелл могут изменяться под влиянием разнообразных условий внешней среды (Huddles on, 1952).

Культурально-морфологические свойства бруцелл различных видов весьма сходны. Поэтому для внутриродовой дифференциации бруцелл применяются дополнительные тесты. К ним относится использование ингибирующего действия некоторых анилиновых красителей на рост бруцелл. В основе такого действия лежит выраженное сродство этих красителей к фосфорнокислым группам нуклеопротеидов бактерий. Из большого числа анилиновых красителей, обладающих бакте-риостатическим действием, для дифференциации видов и биотипов бруцелл рекомевдовано использовать <|уксин и тионин (Alton, Jones, 1977).

Фуксин ингибирует рост культур Вт. suis, тионинBr. abortus, а культурыBr. melitensis не чувствительны к этим факторам.

Важным диагностическим признаком бруцелл является их биохимическая активность. В частности установлено, что они не обладают протеолитической активностью, утилизируют некоторые углеводы и аминокислоты, образуют аммиак и сероводород, редуцируют нитриты и не накапливают индола.

Исследованиями Г. П. Калиной (1933), Б. П. Первушина (1941) установлено, что наибольшее количество сероводорода образуют штаммы Br. suis, а наименьшееBr.melitensis. Однако ряд авторов не обнаружил межвидовых отличий в образовании бруцеллами H^s (О.Герман и др., 1943). Более поздние исследования (В.И.Белобаб и К. Л. Студенцов, 1969) подтвердили пригодность этого теста для дифференциации видов бруцелл. Однако авторы указали на необходимость использования теста на сероводородообразование только в комплексе с другими бактериологическими и серологическими методами.

На протяжении многих лет ведутся работы по изучению строения клеточной поверхности бруцелл. Значение клеточной стенки для жизненных функций бактериальной клетки огромно, так как именно она является непосредственным участником всех видов взаимодействия бактерий с внешними агентами (эпителиальными клетками и макрофагами макроорганизма, антителами, антибиотиками и т. д.). Все эти функции связаны с наличием на поверхности бруцелл сложнейших структур, обладающих антигенностью.

В первый период изучения антигенной структуры бруцелл применялась реакция агглютинации с цельной микробной клеткой (в антигенах) и соответствующими монорецепторными сыворотками. Эта методика позволила выявить поверхностно-оболочечные антигены.

Как показали результаты этих работ, антигенная структура бруцелл различных видов оказалась не однородной. Olitzki et al. (1933) установили возможность серологической дифференциации бруцелл. Методом взаимной адсорбции видовых агглютининов они обнаружили обособленные антигенные рецепторы у Br. abortus и Br. meliten-sis* В последующие годы было определено количественное соотношение различных антигенов, обозначенных условно как Аи М-антигенны. Антиген М находится в большем количестве у Br. melitensis (А:М=1:20), а антиген, А — у Br. abortus (А:М=20:1). Штаммы Br. suis по этому признаку занимают промежуточное положение. Кроме того, все основные виды бруцелл содержат общий 0-антиген, расположенный более глубоко (Н.Г.Шин, 1964; А. К. Адамов и др., 1965; В. В. Гинсбург, 1967; П. А. Триленко, 1971; Е. А. Драновская и др., 1972).

Однако И. А. Косилов и др. (1970) считают, что количественное соотношение Аи М-антигенов у видов Br. suis Br, abortus не является отличительным признаком, так как оно значительно варьирует у различных штаммов одного и того же вида.

М.С.Дрожевкина (1955) описала новый антиген бруцелл, подобный" ^ -антигену брюшнотифозных бактерий. По ее данным этот антиген содержится только у свежевыделенных культур бруцелл, Культивирование на искусственных питательных средах приводит к утрате данного антигена. Однако факт существования vi антигена подтверждается не всеми исследователямиН.И.Островская (1963) и П.А.Три-ленко (1976) считают, что антигенная структура Sформ бруцелл представлена только тремя антигенами: А, М и 0. Шероховатые формы бруцелл частично или полностью лишены, А и М-антигенов. По их мнению, Gантиген бруцелл, обнаруженный Олицким и Гуревичем (1933) и отнесенный ими к неспецифическому, на самом деле является глубинным О-антигеном бруцелл.

Изучение компонентов клеточной стенки бруцелл, фракционирование их методом электрофореза в полиакриламидном геле, иммуно-электрофорез и реакция двойной диффузии в агаре позволили выделить большое количество фракций, обладающих антигенностью. А. М. Фомин и К. М. Салмаков (1974) вццелили из бруцелл штамма 82 антиген, положительно реагирующий в РА и РСК cs-ивсыворотками.

Diaz (1966), Н. Г. Шин и H.H.Загорская (1970) ввделили большое количество фракций из бруцелл. Однако они не все обладали антигенностью.

По данным Hatten (1978), количество выделяемых из бруцелл фракций зависит от их вида и биотипа. Ряд авторов указывает, что фракционирование белков, ввделенных из бруцелл методом электрофореза в ПААГе может служить ценным дифференциальным тестом (Balke et al., 1977; Verstreate et al, I982).

Из бруцелл выделены антигенные комплексы методом Буавена (П. А. Вершило ва, 1972) и изучен их химический состав. Он оказался более сложным по сравнению с другими грамотрицательными микробами и характеризовался низким содержанием полисахаридов. Этот антигенный комплекс включал в себя два антигена, различающихся по химическому составу: глюцидо-липо-протеидный антиген и антиген, содержащий специфический полисахарид, белок и ДНК (Е.А.Драновская и др., 1972). Серологическая специфичность компонентов клеточной стенки определяется их полисахаридной частью, химический состав которого также различен (И.И.Дубровская, 1957).

В литературе имеются сообщения о выделении из клеточной стенки бруцелл различных фракций, обладающих биологической активностью. Путем обработки бактериальных клеток разнообразными детергентами, разрушения их или применением самых различных способов экстракции из бруцелл выделены соединения обладающие ишуноген-нос тью (К.Панкова, 1976; Lopes et al., 1976; Е. А. Драновская и др., 1977; Schurig et al., 1981), токсичностью (Kreutzer et al., 1979; Tabatai et al., 1979; Shukla et al., 1980), антибактериальной активностью (Tabatai et al., 1979) и способностью стимулировать образование иммунитета (Youjas et al., 1977).

Особый интерес исследователей привлекает липополисахаридный комплекс, вццеляемый из бруцелл. Этот гетерополимер, обладающий свойствами эвдотоксина, является одним из компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Он образует с белками и липи-дами сложный макромолекулярный комплекс, который обладает высокой биологической активностью (Ю.В.Езепчук, 1977). Е. А. Драновская и др. (1972), Е. А. Драновская (1978) установили, что эндотоксин бруцелл локализуется в глубоких слоях клеточной стенки и имеет вытянутую цилиндрическую форму. Многие авторы изучали структуру и химический состав эндотоксина, с целью обнаружения взаимосвязи между структурой ЛПС и его биологическими функциями (Н.И.Передереев и др., 1972; А. Н. Касьянов, Н. И. Передереев, 1973; Lopes et al., I976-Parnas, 1976; Kreutzer et al., 1979; Н. З. Хазипов, Н. К. Кирилов, 1980; Stone et al., 1982).

Таким образом, в настоящее время накоплен обширный материал о морфологических, культурально-биохимических и биологических свойствах бруцелл. Они легли в основу классификации возбудителей бруцеллеза сельскохозяйственных животных и человека, которая в дальнейшем, по-видимому, будет уточнена в связи с новыми данными в отношении антигенной структуры бруцелл, вариаций метаболизма и др. (П.А.Триленко, 1976).

Актуальными являются также исследования по изменчивости морфологических, культурально-биохимических и антигенных свойств бруцелл под влиянием условий окружающей среды, а также вследствие воздействия защитных факторов организма и широкого арсенала антимикробных средств, применяющихся для лечения больных животных.

ГЛАВА П. МЕТАБОЛИЗМ БРУЦЕЛЛ.

Метаболизм является основной характеристикой жизни. Каждое биологическое явление, каждый признак живого организма представляет собой определенный результат сопряженных биохимических реакций. Поэтому неудивительна тенденция современных естественных наук перевести разнообразные биологические явления на язык биохимических терминов и понятий (В.Г.Петровская, 1967).

В этой связи изучение метаболизма болезнетворных микроорганизмов позволяет раскрывать биомолекулярные основы их патогенности и вирулентности.

Специфические условия среды обитания микробов накладывают свой отпечаток на их метаболизм. Изменения типов колоний микроорганизмов (гладких, шероховатых и слизистых и т. д.) по природе являются биохимическими мутациями и, хотя некоторые детали биосинтеза поверхностных антигенов и факторов, обусловливающих вирулентность, стали известны совсем недавно, тем не менее ясно, что изменение этих признаков связано с изменением в синтезе или в активности ферментов, прямо или косвенно контролирующих образование компонентов клеточной поверхности (В.Браун, 1968). Эти особенности обмена веществ с успехом используются в дифференциации бактерий (Н. Д. Иерусалимский, 1963).

Бактерии, как и другие микроорганизмы, нуждаются в определенных питательных веществах, в которые должны входить все химические элементы, необходимые для построения клеточного материала, активности ферментов и работы транспортных систем. Кроме того, питательные вещества должны поставлять в клетку материал, используемый для генерирования биологически полезной энергии.

I. Питательные потребности бруцелл.

По характеру исходных материалов, потребляемых для биосинтеза компонентов бактериальной клетки, бруцеллы относятся к типичным гетеротрофам, а по способу получения энергии из окружающей среды-к хемоорганотрофам. Способность первых генераций культур Brucella abortus фиксировать COg не противоречит этому, так как не обеспечивает клетку необходимым количеством углерода при отсутствии органических веществ.

Бруцеллы нуждаются в источниках углерода для внутриклеточного синтеза олигосахаридов и полисахаридов, составляющих до 60% сухого вещества бактериальной клетки (Э.Роуз, 1971). К наиболее доступным источникам углерода и энергии относятся углеводы (М.А. Бабич и др., 1970). Полисахариды питательной среды плохо используются бруцеллами. Мгтапэку et а1. (1937), С. П. Меринов и др. (1966) считают, что бруцеллы способны гидролизовать крахмал. Кроме того, у них обнаружена гиалуронидаза, осуществляющая распад макромолекулы гиалуроновой кислоты (Л.А.Урода, 1951; Н.О.Анина-Радченко, 1956).

Углеводы интенсивно потребляются бруцеллами в виде моносахаридов. В связи с этим моносахариды являются обязательным компонентом питательных сред для большинства патогенных микроорганизмов. Наиболее часто для этих целей используется глюкоза.

В литературе имеются лишь немногочисленные сообщения о потребности бруцелл в углеводах. Многие авторы указывают на необходимость включения глюкозы в состав питательных сред в количестве от 0,5 до 1,5% (Н.А.Михайлов и др., 1972; Ю. А. Тараканов и др., 1973).

В настоящее время известно, что ассимиляция микроорганизмами глюкозы зависит от влияния условий окружающей среды. Например, АЗ^епЪегп^а{(1952) показали, что интактные клетки бруцелл интенсивнее метаболизируют эту гексозу при слабокислой реакции среды (рН — 6,6), чем культуры, растущие в слабощелочной среде.

Установлены также видовые особенности в потреблении глюкозы основными типами бруцелл. Так, например, штаммы Вг. БтБ, по сравнению с другими видами бруцелл, значительно интенсивнее ассимилируют глюкозу (, 1961).

Потребность бруцелл в углеводах может быть различной и в отдельные фазы роста бактериальной культуры (Т.С.Милейковская, Л.Н.

Федорова, 1974). В. П. Корунов и др. (1975), установили, что при глубинном выращивании бруцелл на различных средах глюкоза поглощается в течение всего периода культивирования. Однако наибольшее ее потребление наблюдается в фазе логарифмического роста бактерий.

Потребность гетеротрофных микроорганизмов в различных саха-рах может быть восполнена также благодаря механизму взаимопревращения углеводов. Например, в синтетических средах глюкоза может быть заменена эритритом, галактозой и фруктозой, а штаммы Br. suis используют ксилозу, маннозу и трегаллозу (wundt, 1961).

О.В.Кондратьева и В. М. Степанов (1969) показали, что при росте бруцелл на синтетических средах многоатомные спирты — маннит, сорбит, дульцит, а также лактоза и рамноза не могут служить для них источниками углерода и энергии. Питательные потребности бруцелл основных видов оказались при этом различными. Например, ара-биноза, манноза, мальтоза и сахароза усваивались бруцеллаш вида Br. suis, В ТО время как культуры Br. melitensis и Br. abortus не росли на средах, содержащих эти сахара. Рибоза стимулировала рост штаммов Br. abortus И Br. suis, но не Br. melitensis,.

Присутствие в среде четырехатомного спирта эритрита стимулирует рост большинства штаммов бруцелл. Поэтому считают, что эритрит' f содержащийся в большом количестве в амниотической жидкости отдельных видов животных, является фактором роста для вирулентных культур этих бактерий (Kippie, 1956; Stoenner ei al-., 1957; Mirsa et al., 1976; Joshi, 1976).

Однако в этом вопросе нет единого мнения. В частности, в литературе имеется рад сообщений, авторы которых опровергают наличие прямой корреляции между вирулентностью бруцелл и их потребностью в эритрите (Meyer, 1956; Crouch et ai., 1967). По данным Tripathi et al. (1977) стимулирование роста культур бруцелл.

— гг эритритом зависит от субстрата, на котором выращиваются бактерии. Наибольшее стимулирование роста бруцелл они наблюдали при внесении эритрита в синтетическую среду.

Другую группу питательных веществ, необходимую для биосинтеза бактериальных клеточных структур, образуют азотсодержащие соединения. Их основное назначение состоит в том, чтобы доставлять в клетку материал для формирования аминныхи Н£ и иминных (- Ш-) групп в молекулах аминокислот, нуклеотидов, гетероциклических оснований и других химических соединений, входящих в состав протоплазмы (Н.Д.Иерусалимский, 1963),.

Атомы азота существуют в естественных условиях в состоянии различной степени окисленности от +6 (к Од) до -3 (к Различные микроорганизмы могут использовать неорганические соединения, содержащие атом азота во всех этих состояниях за исключением, быть может, валентности +6 (я О3). Для большинства бактерий наиболее доступным является ион аммония (Э.Роуз, 1974).

Вопрос о возможности использования бруцеллами неорганических соединений в качестве единственного источника азота изучался многими авторами. С. П. Меринов и В. А. Широков (1977) установили, что бруцеллы способны ассимилировать минеральный азот за счет прямого аминирования кетокислот.?ш^ (1961) приводит данные, свидетельствующие о возможности выращивания культур бруцелл в среде с сульфатом аммония как единственным источником азота. При этом в среде обязательно должны находиться факторы роста — витамины (тиамин, биотин, никотиновая кислота, пантотенат кальция), а также ионы железа и глюкозы.

Для полноценного роста культур патогенных микроорганизмов чаще всего необходимы готовые аминокислоты (Н, Ф. Гамалея, 1939;

Н.Д.Иерусалимский, 1949; И. Е. Халецкая и Ю. В. Галаев, 1971).

Считают, что бруцеллы лшпены способности выделять протеоли-тические ферменты в окружающую среду, так как они не разжижают желатину и не вызывают пептонизации молока (П.А.Вершилова, 1972). Это подтверждено также В. П. Коруновым (1974) при изучении динамики изменения полипептидов среды в процессе глубинного культивирования бруцелл периодическим способом. Он пришел к выводу о том, что питательные потребности бруцелл в источниках аяота удовлетворяются, в основном, за счет свободных аминокислот и их аминов.

Не все аминокислоты, обычно встречающиеся в составе белков, одинаково потребляются бактериями. П. И. Кашкин с соавт. (1968) подразделили аминокислоты на три группы: совершенно необходимые для роста, стимулирующие рост и не являющиеся необходимыми для роста (несущественные).

В результате изучения потребностей бруцелл в факторах роста были составлены различные синтетические питательные среды. Koser (1941) применял для культивирования бруцелл синтетическую среду состоящую из 14 аминокислот, глюкозы и некоторых солей. Позднее, McGoiiough. et ai. (1947) установили, что необходимыми для роста культур Бг. suis являются, прежде всего, цисгин, гистидин, тирозин, фенилаланин и триптофан. Стимулирующим рост бруцелл действием обладали глицин, аргинин, глутаминовая кислота, лизин и метионин. С учетом этих данных они модифицировали среду Козера. Gerhardt et ai. (1950) получили хороший рост культур Br. abortus на синтетической среде, содержащей в качестве единственного источника азота аспарагин. Они считают, что оптимальной для роста культур Br. abortus является синтетическая среда, имеющая в своем составе аспарагин, глугаминовую кислоту и гистидин. В опытах Sander et ai. (1953) была показана непргодность данной синтетической среды для выращивания штаммов Br.suis. Максимальный рост культур Br. suis эти авторы получили в среде, содержащей глутамат, ала-нин, лизин, гистидин, метионин и цистин.

Аналогичный состав синтетической питательной среды для Вт. meiitensis предлагают использовать О. В. Кондратьева и В. М. Степанов (1968).

В.П.Корунов (1974) считает, что важнейшим источником азотистого питания Br. abortus являются глутаминовая кислота, цистеин, аланин, глицин, серин, триптофан, фенилаланин и гистидин. При уменьшении или отсутствии в среде указанных аминокислот бруцеллы способны утилизировать менее важные для их роста аминокислотыметионин, изолейцин и валин.

Н.И.Передереев (1973), А. М. Алимов и В. П. Корунов (1977), изучив питательные потребности различных штаммов Br. abortus и L. monocytogenes, пришли к выводу о необходимости для роста этих бактерий серосодержащей аминокислоты-цистин, а потребление других аминокислот листериями и бруцеллами имеет видовые и штам-мовые особенности.

Таким образом, имеющиеся данные различных авторов подтверждают мнение Rode et al. (1950) о том, что потребность в аминокислотах бруцелл различных видов имеет существенные особенности и синтетические питательные среды не могут быть одинаковыми для различных видов и штаммов бруцелл.

Установлена определенная последовательность в ассимиляции бруцеллами аминокислот, содержащихся в питательной среде. Например, Т. С. Милейковская и Л. Н. Федорова (1974) в процессе культивирования бруцелл вида suis глубинным методом в бульоне Хоттингера показали, что глицин и пролин не обнаруживаются в культуральной жидкости уже после первых 12 часов инкубирования. Интенсивно потреблялись также цистин, лизин, гистидин, аргинин, серин, ас-парагиновая кислота и треонин, которые не выявлялись в среде после 24−48 часового культивирования.

Н.ИЛер^цереев (1973) показал, что при глубинном культивировании бруцелл вида Br'.abortus наиболее интенсивно потребляются глутаминовая кислота и гистидин, что свидетельствует о важном значении этих аминокислот в обеспечении бактерий энергией и пластическим материалом.

Аналогичные данные получены В. П. Коруновым (1974), согласно которым при глубинном культивировании бруцелл вида абортус количество глутаминовой кислоты в среде уменьшается на 65−100% уже после 24 часового инкубирования, а к 48 часам полностью исчезает. В последующие сроки культивирования бруцеллы интенсивно утилизировали цистин, гистидин, глицин, пролин, медленнее — фенилаланин, триптофан, серин и аланин. Аминокислоты аргинин и тирозин начинали потребляться бруцеллами лишь в поздние сроки культивирования. При этом авторы установили существенные штаммовые особенности в ассимилировании бруцеллами отдельных аминокислот.

Некоторые аминокислоты, внесенные в синтетические среды, могут токсически влиять на бруцеллы (Gerhardt et al., 1950). В этой связи представляет интерес сообщение О. В. Кондратьевой и В. М. Степанова (1969) об ингибировании роста бруцелл различных видов при включении в состав’синтетических сред норлейцина, серина, лейцина, норвалина. Кроме того, на Bfr. abortua токсически влияли триптофан, аспарагиновая кислота, аргинин, орнитин и глицин. Влияние цистина на рост культур зависело от его концентрации в среде. При этом следует иметь в виду, что влияние отдельных аминокислот на рост бактерий зависит от его количества и набора аминокислот в синтетической среде (Л.Н.Титова, 1971).

Таким образом, приведенные данные указывают на наличие существенных различий в питательной потребности бруцелл отдельных видов, что, очевидно, обусловлено особенностью их метаболизма.

ВЫВОДЫ.

1. Сконструирована новая синтетическая среда, пригодная для ускоренного определения сахаролитических свойств бруцелл.

Изучаемые штаммы Br. abortus расщепляли арабинозу, глюкозу, мальтозу, ксилозу, глицерин и фруктозу. SR — и вформы бруцелл утилизировали галактозу, глюкозу, фруктозу, глицерин ж ксилозу медленнее, по сравнению с s — формами.

2. В бесклеточных экстрактах бруцелл обнаружены декарбокси-лазы орнжтина, лизина, гистидина, аргинина, метионина, валина, цистеина и аспарагина. Особенностью SRи. R — форм этих бактерий является более высокая декарбоксилазная активность в отношении лизина, аргинина, орнитина и гистидина, а также отсутствие отдельных декарбоксилаз.

3. Вирулентные культуры бруцелл обладают более широким наборов" дезаминаз аминокислот. Однако, интенсивность дезаминирования аминокислот не зависит от вирулентности штаммов бруцелл.

Еформы бруцелл характеризуются более высокой, по сравнению с s-формами дезаминазной активностью в отношении треонина, триптофана, глутаминовой кислоты и отсутствием способности деза-минировать аргинин и лизин. Дезаминазная активность бруцелл варьирует в зависимости от условий их культивирования.

4. Бруцеллы осуществляют реакции переаминированияЛ.-кето-глутарата и пирувага аминогруппами различных аминокислот. Для.

Rмутантов свойственно медленное использование аланина в реакции переаминирования с (¿—кетоглутаратом, в то время как интенсивность образования этой аминокислоты из пирувата значительно выше, чем у типичных s-форм.

5. Окислительная активность SRййформ бруцелл ниже, чем у типичных 3 -форм. Они потребляют значительное количество кислорода в присутствии эритрита и глутаминовой кислоты. Интенсивность окисления эритрита не зависит от вирулентности бруцелл.

6. Бруцеллы вирулентного штамма обладают высокой эндогенной дегидрогеназной активностью. Э-формы этих бактерий существенно превосходят Кварианты по интенсивности редукции ТТХ в среде с ацетатом. Мутация в направлении К сопровождается повышением дегидрогеназной активности бруцелл в отношении пирувата.

7. Сравнительным изучением аминокислотного, углеводного и энергетического метаболизма бруцелл различной вирулентности и антигенности установлены следующие особенности вакцинного штамма 82: а) медленное ферментирование фруктозыб) отсутствие декарбоксилазной активности в отношении метио-нина, валина, цистеина, аспарагина, и напротив, высокая интенсивность декарбоксилирования аргинина, лизина, орнитина и гисти-динав) отсутствие дезаминаз лизина, аргининаг) низкая активность эндогенных дегидрогеназ, которая не подавляется сукцинатом натрия.

8. Окислительная активность бруцелл штамма 82 является характерной для вида вг. аЪог-Ьив. Вместе с тем они медленнее, чем вирулентный штамм окисляют аланин, рибозу, эритрит и арабинозу. Эти особенности метаболизма бруцелл вакцинного штамма 82 устойчиво сохраняются в процессе промышленного получения вакцины.

9. В результате проведенных исследований получены сведения, дополняющие существующие представления о биологии возбудителя бруцеллеза, которые могут быть использованы при таксономии и дифференциации бруцелл.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Изучением культурально-морфологических, серологических и биохимических свойств культур бруцелл штамма 82 различного происхождения показана стабильность его свойств.

При дифференциации вакцинного штамма 82, наряду с бактериологическими, серологическими и биохимическими тестами необходимо учитывать его следующие метаболические особенности: а) медленное по сравнению с вирулентными штаммами фермен-тирование Д-фруктозыб) способность восстанавливать 2,3,5-ТТХ в среде, содержащей 25 мкМ сукцината натрияв) низкую интенсивность окисления аланина, эритрита и рибозы.

2. Для определения окислительной активности бруцелл рекомендуется использовать прибор АЗИВ-2, позволяющий значительно упростить методику определения дыхательной активности бактерий. Разработана методика измерения окислительной активности бруцелл в отношении 12 субстратов.

3. Сахаролитическую активность бруцелл рекомендуется определять в синтетической среде следующего состава: двухзамещенный фосфорнокислый натрий безводный — 0,5 годнозамещенный фосфорнокислый калий безводный — 0,2 гхлористый натрий — 8,5 гбром-тимоловый синий — 0,005 гисследуемый углевод — 12,0 г и вода деионизированная — до I л.