Измерительная аппаратура и методы анализа, использующие светорассеяние, нашли широкое применение в различных областях науки и техники. Измерение различных характеристик рассеяния света применяется для анализа бактерий и клеток в биологии, состава и качества крови в медицине. Данные светорассеяния могут быть при этом представлены в двух видах: светорассеяние от ансамбля частиц и от одиночных частиц. Интерпретация данных второго вида проще и более информативна. Тем не менее, даже при анализе данных рассеяния света от одиночных частиц приходится решать ряд сложных задач физической оптики.
В теории взаимодействия электромагнитной волны с малой частицей существует два основных класса задач.
Прямая задача. Вычисление поля рассеяния по известным свойствам частицы и падающего на неё излучения.
Обратная задача. Определение свойств частицы путем анализа рассеянного ею поля.
За последние сто лет были сделаны значительные успехи в развитии методов решения прямой задачи. Точные решения существуют для огромного количества типов частиц, таких как однородные и неоднородные сферы, эллипсоиды, цилиндры и других. Наиболее полный обзор методов по расчету полей рассеяния от частиц произвольной формы представлен в монографии [1].
Обратная задача светорассеяния принадлежит к типу некорректных задач. Информация, требуемая для однозначного определения частицы, должна включать в себя: 1) векторную амплитуду и фазу поля, рассеянного во всех направлениях, и 2) поле внутри частицы [2]. Поле внутри частицы непосредственно измерить нельзя (при некоторых условиях его можно только аппроксимировать полем падающей волны). Измерение амплитуды и фазы рассеянного поля в принципе возможно, но на практике почти не достижимо. Обычно для исследования доступны измерения интенсивности света, рассеянного в нескольких направлениях, либо зависимость интенсивности рассеянного света от угла в некотором диапазоне углов. Поэтому почти всегда перед исследователем стоит задача попытаться описать частицу, располагая данными в меньшем объеме, чем это необходимо в идеальной теоретической постановке задачи. Однако это не обязательно приводит к безнадежному положению. Зачастую дополнительная информация о частицах оказывается достаточной для их описания.
Роль дополнительной информации в решении обратной задачи, существование, единственность и устойчивость получаемого решения в теории рассеяния рассматриваются в сборнике под редакцией Болтса [3].
Анализ рассеяния света широко используется для определения характеристик частиц различного рода: биологических клеток, бактерий и т. п. В связи с развитием лазерной техники, средств автоматизации измерений и обработки данных в научных исследованиях и при технологическом контроле получили широкое распространение проточные цитометры. Скорость регистрации в таких приборах достигает до 1000 частиц в секунду. Таким образом, требования к скорости анализа данных светорассеяния становятся более жесткими.
Описанные в научной литературе работы, связанные с разработкой методов анализа одиночных частиц, демонстрируют некоторые возможности использования светорассеяния при определении морфологических характеристик одиночных частиц. Однако используемый в большинстве из них метод подгонки теоретических расчетов к экспериментальным результатам (метод наименьших квадратов, МНК) требует больших затрат времени и вряд ли найдет широкое применение при высокоскоростном анализе частиц. Поэтому представляется важным дальнейшее совершенствование методов определения параметров частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния). При этом новые подходы в решении обратной задачи должны характеризоваться малым временем оценки параметров (1−10 мс) и достаточной точностью.
В настоящее время для анализа одиночных частиц широко применяется техника проточной цитометрии (см., например, обзоры [4, 5, 6, 7]). Создание и применение проточных цитометрических систем для автоматического анализа и разделения частиц в гидрозолях открыло новые возможности для исследований в области биологии и медицины. Цитометрия в потоке представляет собой большой шаг вперед по сравнению с обычными микроскопическими методами, при использовании которых анализ нескольких частиц занимает несколько часов. Измерение светорассеивающих свойств частиц в таких системах позволяет получать информацию об их морфологических характеристиках (размер, форма, особенности внутренней структуры, коэффициент поглощения и т. д.). Уникальность методики цитометрии в потоке состоит в том, что измерения выполняются на отдельных частицах с большой скоростью. Это обеспечивает высокую статистическую точность и позволяет надежно выявлять малые популяции. При этом анализаторы подобного типа обладают достаточно высокой производительностью и надежностью результатов анализа.
Кроме проточных цитометров существует ряд принципиально других приборов, в которых для анализа одиночной частицы используется её удержание в оптических [8, 9] и электростатических [10, 11] ловушках. Устройства, в которых частица удерживается в фиксированном положении, а вращающийся детектор или система неподвижных детекторов используются для записи индикатрисы, требуют относительно большого времени для измерения индикатрисы одиночной частицы и не позволяют накапливать данные от многих частиц для статистической обработки.
Сигналы светорассеяния в приборах могут быть представлены разными способами, поэтому методы для анализа данных светорассеяния будут отличаться. На рис. 1 представлено обобщение методов решения обратной задачи и приборов, измеряющих светорассеяние.
Одним из методов, позволяющим оценивать параметры рассеивающих частиц, является метод наименьших квадратов. Для сферических частиц величины размера d и показателя преломления п подбираются так, чтобы обеспечить наилучшую аппроксимацию экспериментальных данных рассчитанных по теории Ми. Данный метод широко использовался последнее время в связи с увеличением вычислительных мощностей компьютеров. Первоначально МНК использовался в экспериментах, связанных с индикатрисами одиночных зафиксированных частиц [11]. В этой работе применялась техника удержания частицы электрическим полем в луче лазера (Differential II, Science Spectrum, Inc.). В работе [12] была измерена индикатриса рассеяния частицы полистирольного латекса с диаметром 1099.6 нм. Использование МНК позволило определить диаметр и показатель преломления одиночной частицы: d = 1200+10 нм и п = 1.59+0.01. Возможности МНК в дальнейшем расширены [13]. В этой работе измерялись индикатрисы одиночных биологических клеток с использованием техники Differential И. Применяли МНК для модели сферической частицы с покрытием. В результате были определены параметры бактерий Staphylococcus epidermidis: диаметр 353±5 нмтолщина мембраны 25±5 нмпоказатель преломления цитоплазмы 1.50+0.01- показатель преломления мембраны 1.54+0.01.
Рис. 1 Обобщение методов решения обратной задачи и приборов, измеряющих светорассеяние.
В проточной цитометрии МНК использовался в ряде работ [14, 15]. Так, состав пятикомпонентной смеси, состоящей из частиц с размерами 1.1, 5.0, 10.0, 15.6 и 19.5 мкм, определен [14] на основе данных по светорассеянию, измеренных на проточном цитометре. Для полистирольных латексных частиц получено достаточно хорошее согласие между измеренной функцией рассеяния и вычисленной по теории Ми. Из сравнения индикатрис рассеяния, рассчитанных по теории Ми для гомогенных сфер, определены [15] распределение по размерам и среднее значение показателя преломления для спор.
Метод наименьших квадратов с использованием точной теории рассеяния является наиболее точным методом решения обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц. Однако он требует длительных вычислений и точного задания начальных параметров подгонки. Одной из первых попыток найти решение обратной задачей светорассеяния через создание эмпирических уравнений был метод оптического картографирования, предложенный Quist и Wyatt [16]. В дальнейшем этот метод получил развитие в определении распределения частиц по размеру и показателю преломления [17].
Спектральный подход в нахождении решения обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц был развит Ludlow и Everitt [18,19]. Разложив поле рассеяния в ряд Гегенбауэра, авторы показали, что точка среза спектра однозначно связана с размером частицы. Авторы предположили, что из спектра также можно определить показатель преломления частицы. Быстрое преобразование Фурье было использовано Min и Gomez [38], чтобы определить размер частиц с известным показателем преломления с точностью 3%. Данный метод позволял определять размер частицы из индикатрисы, измеренной в углах от 9° до 18°. Аппроксимационное решение обратной задачи светорассеяния для частиц сравнимых с длиной волны был предложен Warner и Hirleman [20], которые продемонстрировали работоспособность метода для определения размера и показателя преломления частицы, лежащей на поверхности. Индикатриса, измеренная в углах 10° - 65°, аппроксимировалась функцией Гаусса и параметры частицы определялись из параметров полученной функции. Ulanowski и др. [21] использовали метод нейронных сетей (neural network), чтобы найти решение обратной задачи светорассеяния для сфер. Типичное время обучения такой нейронной сети и определения параметров частицы равнялись соответственно 50 секунд и 50 миллисекунд. При этом использовался пакет MATLAB 4.2, работающий на 166-МГц Intel 80 586 процессоре. Рабочая область метода ограничивалась 0.5 мкм < d/2 <1.5 мкм по размеру и 1.2 < т < 1.27 по относительному показателю преломления.
Данные светорассеяния от одиночных частиц интенсивно используются в различных практических приложениях. Особенно это актуально в медицинской диагностике, при анализе состава клеток крови. При этом теоретические [22, 23, 24, 25] и экспериментальные [26, 27, 28, 29, 30, 31, 32] исследования рассеяния на одиночных клетках крови обеспечивают дальнейшее развитие методов анализа.
Техника сканирующей проточной цитометрии была предложена В. П. Мальцевым [34] и развивалась в 1994 — 2001 в лаборатории лазерной фотохимии Института химической кинетики и горения. Если цитометр стандартной конфигурации позволяет измерять сигналы светорассеяния в 2−3 фиксированных телесных угла, то сканирующий проточный цитометр (СПЦ) позволяет регистрировать дифференциальное сечение рассеяния, — индикатрису, в диапазоне полярных углов от 5 до 120 градусов. Это дает большие возможности в области определения параметров отдельных частиц и идентификации частиц по светорассеянию.
К началу наших работ, одной из нерешенных задач, очень важной с точки зрения повышения точности измерений на СПЦ, являлась определение влияния параметров оптической схемы СПЦ на измеряемые характеристики частиц. Решение данной задачи позволило бы выявить источники ошибок измерения характеристик исследуемых частиц и после их выявления — устранить. Знание того, какие параметры оптической схемы СПЦ и насколько влияют на измерение характеристик частиц, будет в дальнейшем способствовать проектированию и изготовлению нового поколения СПЦ.
Другая задача — это расширение области применения и повышение точности параметрического метода решения обратной задачи светорассеяния. Основным моментом в получении параметрического решения обратной задачи является выбор параметров индикатрисы. Выбор обусловлен следующими факторами: 1) однозначная связь параметра с характеристикой исследуемой частицы, 2) наименьшая погрешность вычисления характеристики исследуемой частицы по параметру, 3) наименьшая ошибка определения параметра для экспериментально измеренной индикатрисы на СПЦ. Зачастую из-за низкого уровня сигнала по отношению к шуму либо ошибок измерений, вносимых оптической схемой цитометра, некоторые параметры не удовлетворяют третьему условию, что и ограничивает область применения параметрического решения обратной задачи светорассеяния.
Данная диссертационная работа посвящена разработке физических решений, развивающих технику СПЦ и методы параметрического решения обратной задачи светорассеяния для сферических частиц.
Цель и задачи работы.
Цель настоящей работы состоит в следующем:
— развитие методов определения параметров сферических частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния для одиночных частиц), способных в более широком диапазоне по размерам и с высокой точностью определять характеристики сферических частиц;
— повышение точности измерения параметров сферических частиц на СПЦВ задачи работы входило:
— Определение влияния ошибок параметров оптической схемы СПЦ на погрешности измеряемых характеристик сферических частиц.
— Проведение исследований по разработке на базе СПЦ новых методов анализа, идентификации и классификации различных частиц.
При этом новые методы анализа одиночных частиц должны отвечать малому времени оценки параметров (1−10 мс в проточной цитометрии).
Научная новизна работы.
Научная новизна диссертационной работы определяется следующими результатами полученными впервые.
— Предложена безлинзовая оптическая схема СПЦ. Рассчитаны аппаратная и передаточная функции такой схемы. На основании полученных функций показано, что по своим основным характеристикам, а именно угловому разрешению и эффективности сбора рассеянного света, такая система не уступает стандартной системе. Попутно получено аналитическое выражение для аппаратной функции СПЦ с линзой.
— Рассчитаны передаточная и аппаратная функции для оптической системы СПЦ, в которой введены отклонения от осевой симметрии. Проанализировано влияние ошибок параметров оптической схемы СПЦ на погрешности параметров индикатрисы. Показано, что самым чувствительным параметром индикатрисы к ошибкам параметров СПЦ является Фурье-контраст. Установлено, что погрешности параметров индикатрисы: положение спектрального максимума, Фурье-контраста и спада, увеличиваются при увеличении размера исследуемой частицы при фиксированных параметрах СПЦ.
— Показано, что для того чтобы погрешность определения на СПЦ Фурье-контраста индикатрис сферических частиц с размерным параметром а<40 не превышали 1%, необходимо выполнения следующих условий: отношение диаметра диафрагмы на фотоприемнике к фокусному расстоянию Д// < 1.5×10″ 3, величина отклонения частицы от оптической оси СПЦ т < 2 мкм, величина отклонения оси сферического зеркала от оси капилляра е < 20 мкм.
— Предложены параметры индикатрисы для определения размера и показателя преломления сферических частиц в диапазоне размеров от 0.5 мкм до 1.5 мкм и показателей преломления от 1.37 до 1.65, позволяющие определять размер и показатель преломления со средней погрешностью 1.5% и 2.5% соответственно.
— На базе СПЦ получен не требующий калибровки метод определения объема эритроцитов и концентрации гемоглобина в них. Объем эритроцитов и концентрация гемоглобина в них определяется с точностью -0.3% и ~1% соответственно.
— Получена линейная связь размерного параметра, а с параметром положения спектрального максимума индикатрисы Р/, позволяющая вычислять размер частицы с погрешностью, не превышающей 2% по всему диапазону изменения, а от 12 до 100 и для любых значений показателя преломления в диапазоне от 1.35 до 1.6.
— С помощью использования Фурье-параметров индикатрисы реализовано параметрическое решение обратной задачи светорассеяния для сферических частиц с ядром. Эти частицы имеют следующие параметры: размерный параметр частицы 43<а<86, размерный параметр ядра 0.5а<�ас<0.7а, показатель преломления оболочки Цг=1.36, показатель преломления ядра 1.4< нс<1.6. При этом средняя точность определения размера частицы составляет 2% и точность определения размера ядра составляет 1.4%.
— Показана возможность классификации лейкоцитов на основные классы по сигналу СПЦ.
— На СПЦ с применением параметрического метода решения обратной задачи измерены распределения по размеру и показателю преломления двух монодисперсных проб с полистирольными частицами. Среднее значение и ошибка среднего составили для размеров 0.66±0.01 мкм, 0.86+0.01 мкм, для показателей преломления 1.582±0.007,1.671±0.003 соответственно для каждой из проб.
— Продемонстрировано уменьшение ошибки в определении размера вызванное процедурой поиска минимумов при использовании Фурье-параметра индикатрисы для обработки экспериментально измеренных индикатрис.
— На СПЦ осуществлены измерения коэффициента преломления капель иммерсионного масла, жировых шариков молока и концентрации гемоглобина в сферизованном эритроците с использованием интеграла индикатрисы.
Практическая и научная ценность.
Характерной особенностью развиваемой в данной работе технологии анализа одиночных частиц по светорассеянию является высокая скорость и универсальность. Индикатриса светорассеяния частицы измеряется со скоростью 300 штук в секунду. СПЦ — единственный в мире прибор, определяющий размер и показатель преломления одиночных частиц в реальном времени без процедуры калибровки. СПЦ является наиболее эффективным инструментом по сепарации частиц в различные категории.
Проведенные теоретические и экспериментальные исследования расширяют возможности техники сканирующей проточной цитометрии. Результаты работы могут быть использованы при проектировании СПЦ новой модификации, а также при создании анализатора клеток крови на базе СПЦ.
Структура работы.
Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка цитируемой литературы. Работа содержит 82 страницы текста, 30 рисунков, библиография из 50 наименований занимает 4 страницы.
Основные результаты работы докладывались на:
1. XXXIV Международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, апрель 1996 г.
2. IV международном совещательном семинаре «Фундаментальные науки в деятельности международного научно-технологического центра», Новосибирск, 23−27 апреля, 2001.
3. Всероссийской конференции «Медицинская физика — 2001», Москва, 26−30 июля, 2001.
4. Научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН, Новосибирск, 1996;2001 гг. и опубликованы в следующих изданиях:
1. Maltsev V.P., Chernyshev A.V., Semyanov К.А., and Soini E. Absolute real-time measurement of particle size distribution with the flying light-scattering indicatrix method. // Applied Optics. — 1996. — V. 35. — P. 3275 — 3280.
2. Maltsev V.P., Chernyshev A.V., Semyanov K.A., and Soini E. Absolute real-time determination of size and refractive index of individual microspheres. // Measurement Science and Technology. — 1997. — V. 8. — P. 1023 — 1027.
3. Semyanov K. A and Maltsev V. P, Sub-Micron Spherical Particles Analysis with the Scanning Flow Cytometry. // Particles and Particles Systems Characterization. -2000 V. 17, p. 225−229.
4. Скрибунов, И.В., Тарасов П. А., Семьянов K.A. и Тихонова М. А., Кинетика накопления препарата «Фотосенс» лейкоцитами и эритроцитами крови человека. // Лазерная Медицина. — 1999. Т. З, вып 3−4. стр. 62−63.
5. Semyanov K. A, Р. А Tarasov, Е. Soini, А. К Petrov and V. P Maltsev, Calibration Free Method to Determine the Size and Hemoglobin Concentration of Individual Red Blood Cells from Light Scattering. // Applied Optics. — 2000. V. 39, p. 5884 -58B9.
6. Scribunov I.G., P. A Tarasov, K.A. Semyanov, V.P. Maltsev, A.V. Chernyshev, E.R. Chernych, M.V. Tichonova, Kinetics of Accumulation of Aluminum (III)-Sulfophthalocyanine by Leukocytes Measured with a Scanning Flow Cytometer. //Proceedingsof SPIE. -2000. V. 4162p. 108 — 119.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
В диссертационной работе проанализированы методы и экспериментальные системы, позволяющие определять параметры одиночных частиц по данным светорассеяния. Главный результат исследования заключается в дальнейшем развитии технологии сканирующей проточной цитометрии. Относительно простая оптическая схема и несложные эмпирические уравнения позволяют решать очень важную проблему физической оптики, а именно определять параметры сферических частиц без привлечения каких — либо других методов.
Суммируя можно выделить следующие результаты данной работы:
1. Определены Фурье-параметры индикатрисы и проанализировано их поведение в зависимости от параметров сферической частицы.
2. Использование Фурье-параметров индикатрисы позволяет исключить влияние наличия граничного угла и позволяет решать обратную задачу светорассеяния для частиц с ядром.
3. Выяснено, что самым чувствительным параметром индикатрисы к отклонениям от симметрии оптической системы СПЦ является контраст.
4. Влияние смещения е оси капилляра от центра сферического зеркала на ошибку определения контраста можно существенно уменьшить соответствующим выбором положения фотоприемника относительно оптической оси системы СПЦ и положения траектории частицы относительно оси капилляра.
5. Использование Фурье-параметра индикатрисы при обработке экспериментально измеренных индикатрис позволяет уменьшить ошибки в определении размера вызванные процедурой поиска минимумов.
6. Расширена область применения решения обратной задачи светорассеяния для частиц сравнимых с длиной волны.
7. На СПЦ измерены распределения по объему сферизованных эритроцитов и концентрации гемоглобина в них.
Диссертационная работа выполнена при поддержке гранта СО РАН номер 702 000 и гранта РФФИ номер 00−02−17 467.