Регуляция процессов пролиферации и апоптоза компонентами сфингомиелинового цикла при гепатоканцерогенезе

Актуальность темы

Рак печени различного генеза в настоящее время имеет широкую распространенность и является острейшей медикосоциальной проблемой. Ежегодно в мире от гепатоцеллюлярной карциномы погибает 1 25 000 человек [80]. Заболеваемость этим злокачественным новообразованием имеет географические отличия. В Европе злокачественные опухоли гепатобилиарной зоны встречаются у 1 — 3 чел. на каждые 100 тыс. населения, в различных регионах Африки и Дальневосточной Азии ими заболевают 10 — 15 чел. на 100 тыс. населения [57]. В России первичный рак печени составляет 3 — 5% в общей структуре злокачественных новообразований. Ежегодно регистрируется более 8000 новых случаев заболевания. Мужчины заболевают в 2 раза чаще, чем женщины. В 1992 году интенсивный показатель заболеваемости раком печени и внутрипеченочных желчных протоков в России составил 5,7 на 100 000 населения, а в 2001 году.

— 4,9 на 100 000 населения [23]. В России наибольшие показатели заболеваемости данным злокачественным новообразованием были отмечены в республике Саха (Якутия) — 11,0 на 100 000 населения.

Исследование механизмов гепатоканцерогенеза является актуальной задачей современной онкологии. Известно, что злокачественная трансформация сопровождается прибавлением клеточной массы, которое опережает клеточную гибель либо за счет активации процессов пролиферации, либо вследствие угнетения процессов апоптоза, а чаще всего.

— за счет сочетанного нарушения обоих этих процессов [24, 169, 171]. Блокирование процесса апоптоза, связанное с постоянным действием промоторов опухолевого роста, приводит к фенотипическим изменениям трансформированных клеток, которые приобретают повышенную способность к пролиферации и утрачивают способность к дифференцировке. Благодаря этим свойствам они имеют преимущества перед клетками нормальных тканей при росте и выживании в одинаковых условиях [24, 48, 65,74,157].

Долгое время считалось, что традиционно используемые в онкологической практике лекарственные препараты вызывают гибель опухолевых клеток путем повреждения ДНК клеток или блокированием в них важнейших путей метаболизма [58, 72]. Сейчас достоверно известно, что антибластомная активность многих из этих препаратов также связана со способностью индуцировать в клетках — мишенях апоптоз [4, 74, 107, 156, 163, 164]. Поэтому поиск и отбор лекарственных средств, способных индуцировать апоптоз, представляет собой важное направление в оптимизации схем терапии злокачественных заболеваний.

Благодаря успеху липидологии стало известно, что липиды являются не только основным структурными элементом клеточных мембран, но также играют определяющую роль в различных клеточных процессах, в том числепролиферации и апоптозе. Важное значение в регуляции клеточных функций принадлежит продуктам расщепления сфингомиелина: церамиду и сфингозину- [108, 117, 120, 121, 122, 136]. Известно, что сфинголипиды являются иммуномодуляторами и вторичными мессенджерами, играющими существенную роль в гистогенезе тканей, росте и дифференцировке клеток, онкогенезе [2, 30, 34, 59, 60, 72, 84, 134, 100, 161].

Однако ряд вопросов, важных для понимания роли компонентов сфингомиелинового цикла в регуляции пролиферации и апоптоза при гепатоканцерогенезе, остается неисследованным. Кроме того, является актуальным изучение компонентов сфингомиелинового цикла с целью поиска новых факторов антиканцерогенеза, применение которых позволит существенно снизить риск развития рака печени и улучшить результаты химиотерапии больных данной патологией. Цель работы: изучить роль компонентов сфингомиелинового цикла в регуляции процессов пролиферации и апоптоза при экспериментальном гепатоканцерогенезе.

Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Оценить влияние сфингомиелина и церамида на морфологическую картину печени крыс в процессе экспериментального гепатоканцерогенеза.

2. Изучить влияние сфингомиелина и церамида, заключенных в липосомы, на пролиферативную активность и индукцию апоптоза клеток гепатоцеллюлярной карциномы на модели in vitro.

3. Оценить изменение пролиферативной активности и индукции апоптоза клеток печени крыс в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы, а также при курсовом внутривенном введении липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, в динамике гепатоканцерогенеза на модели in vivo.

4. Исследовать активность сфингомиелиназы и церамидазы, содержание компонентов цикла сфингомиелина (сфингомиелин, церамид, сфингозин) в норме и в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы, а также после курсового введения липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, на фоне развития гепатоцеллюлярного рака.

Основные положения, выносимые на защиту.

1.

Введение

липосом, нагруженных церамидом, приводит к подавлению экспериментального гепатоканцерогенеза, индуцированного N-нитроздиэтиламином, и препятствует формированию гепатоцеллюлярной карциномы.

2.

Введение

липосом, нагруженных сфингомиелином, в моделях in vitro и in vivo, приводит к наиболее выраженному подавлению пролиферации и индукции апоптоза трансформированных гепатоцитов на ранних стадиях формирования гепатоцеллюлярной карциномы.

3.

Введение

церамида, заключенного в липосомы, при индукции гепатоцеллюлярного рака на моделях in vitro и in vivo подавляет пролиферацию и активирует апоптотическую гибель трансформированных гепатоцитов на поздних стадиях гепатоканцерогенеза.

Научная новизна.

Впервые показано, что курсовое введение липосом, содержащих сфингомиелин, на фоне индукции гепатоцеллюлярного рака приводило к более длительному течению воспалительного процесса и задержке формирования гепатоцеллюлярной карциномы до 35 суток по сравнению с группой животных — опухоленосителей, без введения липосом. При введении липосом, нагруженных церамидом, на фоне введения Nнитроздиэтиламина, отмечено наличие минимальной степени выраженности воспалительного процесса и не выявлено структур злокачественных опухолей на протяжении всего периода наблюдений.

Впервые проведено комплексное исследование влияния метаболитов цикла сфингомиелина, заключенных в липосомы на активность пролиферативных процессов и индукцию апоптоза трансформированных гепатоцитов в динамике гепатоканцерогенеза на моделях in vitro и in vivo. Выявлено, что сфингомиелин, введенный в составе липосом, в моделях in vitro и in vivo, на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы приводит к наибольшему подавлению уровня пролиферации и наиболее выраженной индукции апоптоза трансформированных гепатоцитов на ранних стадиях опухолевого роста (до 35 суток). При введении церамида, заключенного в липосомы, аналогичное влияние на изучаемые показатели наблюдалось на поздних стадиях (60 — 90 сутки) формирования гепатоцеллюлярного рака.

Впервые показана корреляционная зависимость между увеличением содержания сфингомиелина и повышением пролиферативной активности клеток гепатоцеллюлярной карциномы в процессе канцерогенеза. При этом отмечена обратная корреляционная зависимость между снижением содержания церамида и сфингозина и повышением пролиферативной активности трансформированных гепатоцитов.

Установлено, что курсовое введение липосом, нагруженных церамидом на фоне введения N — нитроздиэтиламина iv vivo приводит к активации сфингомиелиназы и церамидазы и повышению содержания церамида и.

13. сфингозина с достижением максимальных значений данных показателей на 60 — 90 сутки наблюдений, что способствует, по данным корреляционного анализа, наибольшему снижению пролиферативной активности и индукции апоптоза гепатоцитов на данном этапе наблюдений. Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты исследования существенно расширяют фундаментальные представления о механизмах регуляции пролиферативной активности и апоптотической гибели клеток метаболитами сфингомиелинового цикла в динамике гепатоканцерогенеза. Данные о взаимосвязи активности ключевых ферментов сфингомиелинового цикла с интенсивностью процессов пролиферации и апоптоза могут послужить основой для выбора дополнительных информативных критериев при оценке биохимических характеристик трансформированных гепатоцитов, которые, в свою очередь можно использовать в качестве факторов прогноза опухолевой трансформации. Полученные данные показывают принципиальную возможность использования сфингомиелина и церамида с целью ингибирования гепатоканцерогенеза и служить основой для создания новых противоопухолевых и антиканцерогенных средств. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Апробация работы.

Основные результаты работы представлены на VIII Русско — Корейском Международном симпозиуме (Томск, 2004) — на конференции молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2005) — симпозиуме FEBS № 05 — 28W «Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders», (Dijon, France, 2005) — V Сибирском Физиологическом съезде, (Томск, 2005) — 9 International Conference «Eicosanoids and Other Bioactive Lipids in Cancer, Inflammation and Related Diseases», (San Francisco, USA, 2005) — Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», (Тюмень, 2005) — на региональной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», (Томск, 2006) — на Всероссийской научно — практической конференции «Онкология сегодня. Успехи и перспективы», (Казань, 2006). Объем и структура диссертации.

ВЫВОДЫ:

1. При курсовом внутривенном введении церамида в составе липосом на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы N — нитроздиэтиламином в печени животных не выявлено структур злокачественных новообразований.

Введение

липосом, содержащих сфингомиелин, задерживало мофологически зарегистрированное фомирование гепатоцеллюлярной карциномы на семь дней по сравнению с группой животных с гепатоцеллюлярным раком без введения липосом.

2. Добавление сфингомиелина, заключенного в липосомы, в суспензию трансформированных гепатоцитов in vitro до 35 суток наблюдений снижало пролиферативную активность на 42% и повышало уровень индукции апоптоза клеток в 1,9 раза по сравнению с аналогичными показателями клеток гепатоцеллюлярной карциномы.

Введение

липосом, нагруженных церамидом, in vitro приводило к снижению синтеза ДНК на 51% и активации апоптоза клеток печени в 2 раза по сравнению с соответствующим показателем трансформированных гепатоцитов на поздних этапах исследования (60 — 90 сутки).

3. При курсовом введении липосом, содержащих сфингомиелин, in vivo, набольшее подавление уровня пролиферации на 44% и индукции апоптоза в 2,2 раза по сравнению с группой животных — опухоленосителей, без введения липосом, отмечено на ранних стадиях развития гепатоцеллюлярной карциномы (до 35 суток).

Введение

церамида в составе липосом in vivo приводило к снижению пролиферативной активности на 40% и стимуляции апоптотической гибели клеток печени в 3,1 раза на 90 сутки наблюдений по сравнению с аналогичными показателями группы животных с развитием гепатоцеллюлярного рака без введения липосом.

4. Процесс гепатоканцерогенеза у крыс сопровождается активацией сфингомиелиназы и церамидазы на 35 сутки наблюдений и дальнейшим снижением активности ферментов на 90 сутки эксперимента, а также увеличением содержания сфингомиелина и снижением содержания сфингозина и церамида на всех сроках эксперимента в сравнении с аналогичными показателями группы интактных животных.

5. Курсовое введение липосом, содержащих сфингомиелин, на фоне развития гепатоцеллюлярного рака приводило к выраженной активации сфингомиелиназы и церамидазы на 28 и 35 сутки наблюдений, к 90 суткам развития гепатоцеллюлярной карциномы происходило снижение активности данных энзимов.

Введение

липосом, нагруженных церамидом, на фоне на фоне введения N — нитроздиэтиламина у крыс приводило к активации сфингомиелиназы и церамидазы.

6. Была получена прямая корреляционная зависимость между увеличением содержания сфингомиелина и повышением пролиферативной активности клеток гепатоцеллюлярной карциномы в процессе канцерогенеза и обратная корреляционная зависимость между снижением содержания компонентов сфингомиелинового цикла (церамида, сфингозина) и повышением пролиферативной активности трансформированных гепатоцитов. Увеличение количества церамида и сфингозина было связано с повышением уровня апоптотической гибели клеток в процессе канцерогенеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящее время литературные данные, свидетельствующие о роли компонентов сфингомиелинового цикла в развитии гепатоцеллюлярного рака крайне немногочисленны. Известно, что фосфолипиды являются важным структурным компонентом хромосом, хроматина, ядерного матрикса. Сфинголипиды являются регуляторами активности ферментов и участвуют в функционировании ряда медиаторных систем, нарушение которых приводит к дисбалансу между процессами пролиферации и апоптоза при канцерогенезе. Многие авторы полагают, что одной из причин усиления пролиферации трансформированных клеток может быть изменение баланса между сфинголипидами, которые могут действовать кооперативно, противоположно или независимо друг от друга, определяя тем самым судьбу клетки (апоптоз, пролиферация, дифференцировка и т. д.) [66, 72]. Вероятно, одной из причин усиления пролиферации опухолевых клеток может быть изменение структуры сфингоидных оснований и жирнокислотных остатков в церамидах опухолей по сравнению с нормой [33, 73].

Таким образом, изучение роли сфинголипидов в механизмах регуляции пролиферации и апоптоза при канцерогенезе позволит расширить представления о патогенезе рака печени, а также обосновать поиск новых препаратов, которые могут существенно снизить риск развития рака печени и войти в новые схемы терапии злокачественных новообразований.

Эти обстоятельства послужили отправным пунктом при постановке цели, которая заключалась в изучении роли компонентов сфингомиелинового цикла в регуляции процессов пролиферации и апоптоза при экспериментальном гепатоканцерогенезе. При этом предполагалось:

1. Оценить влияние сфингомиелина и церамида на морфологическую картину печени крыс в процессе экспериментального гепатоканцерогенеза.

2. Изучить влияние сфингомиелина и церамида, заключенных в липосомы, на пролиферативную активность и индукцию апоптоза клеток гепатоцеллюлярной карциномы на модели in vitro.

3. Оценить изменение пролиферативной активности и индукции апоптоза клеток печени крыс в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы, а также при курсовом внутривенном введении липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, в динамике гепатоканцерогенеза на модели in vivo.

4. Исследовать активность сфингомиелиназы и церамидазы, содержание компонентов цикла сфингомиелина (сфингомиелин, церамид, сфингозин) в норме и в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы, а также после курсового введения липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, на фоне развития гепатоцеллюлярного рака.

В работе изучали роль компонентов сфингомиелинового цикла в регуляции процессов пролиферации и. апоптоза на модели экспериментального гепатоканцерогенеза и использовали трансформированные клетки, выделенные путем перфузии печени in situ.

Исследование морфологических показателей печени крыс при курсовом введении липосом, содержащих сфингомиелин, на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы показало более длительное течение воспалительного процесса и формирование гепатоцеллюлярной карциномы на более поздних этапах исследования по сравнению с группой животных, которым не вводили липосомы. При внутривенном курсовом (с 14 — х по 28 -е сутки) введении церамида, заключенного в липосомы, отмечена минимальная степень выраженности воспалительного процесса, при этом признаки структур злокачественной опухоли в исследуемых тканях отсутствовали в течение всего периода наблюдений.

Введение

липосом, содержащих сфингомиелин в моделях in vitro и in vivo, на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы, приводило к максимальному подавлению уровня пролиферации на ранних стадиях опухолевого роста (до 35 суток). При введении липосом, нагруженных церамидом, аналогичное снижение данного показателя наблюдалось лишь на 60 — 90 сутки наблюдений.

В представленной работе было изучено влияние сфингомиелина и церамида на активность процесса апоптотической гибели трансформированных клеток в динамике гепатоканцерогенеза.

Введение

липосом, нагруженных сфингомиелином приводило к активации процесса апоптоза трансформированных гепатоцитов в моделях in vitro и in vivo к 35 суткам гепатоканцерогенеза. На поздних этапах гепатоканцерогенеза (60 — 90 сутки) сфингомиелин не оказывал значительного влияния на данный показатель, тогда как церамид, введенный в составе липосом приводил к активации апоптотической гибели трансформированных гепатоцитов.

В результате проведенных исследований нами было показано, что введение компонентов сфингомиелинового цикла приводило к изменениям в активации ключевых ферментов сфингомиелинового цикла: сфингомиелиназы и церамидазы. Курсовое введение липосом, содержащих сфингомиелин на фоне развития гепатоцеллюлярного рака приводило к активации сфингомиелиназы и церамидазы к 35 суткам развития гепатоцеллюлярного рака, однако на поздних этапах гепатоканцерогенеза происходит снижение активности данных энзимов.

Введение

церамида в составе липосом на фоне введения N-нитроздиэтиламина у крыс приводило к активации сфингомиелиназы и церамидазы в течение всего периода наблюдений. Необходимо подчеркнуть, что сигналопередающий каскад от различных сфингомиелиназ активирует различные пути регуляции апоптоза и пролиферативной активности клеток.

Полагают, что активация кислой сфингомиелиназы приводит к усилению митогенной стимуляции посредством активации NF — кВ через ras — raf-MAPKK сигнальный путь (рис. 15).

СФИНГОМИЕЛИН.

СФИНГОМИЕЛИНАЗА.

ЦЕРАМИДАЗА.

Ингибирование.

BCL-2 Формирование пор в митохондриях.

Фрагментация ДНК Д.

ПРОЛИФЕРАЦИЯ.

АПОПТОЗ.

Рис. 15 Схема влияния метаболитов цикла сфингомиелина на внутриклеточные пути пролиферативных, про — и антиапоптических сигналов на основании данных литературы. Примечание: КК — казеинкиназа II, РК С — протеинкиназа С, МАРК, SAPK, JNK, ERK — митогенактивируемые протеинкиназы.

Установлено, что ингибирование синтеза церамида приводило к увеличению циклина D1, которое влекло за собой повышение митотической активности гепатоцитов. Ингибирование активности церамидазы приводило к увеличению содержания церамида в клетках гепатомы, которое в свою очередь, изменяло ультраструктуру митохондрий и увеличивало выход цитохрома С в цитоплазму и активировало каспазу 3. Авторы считают, что кислая церамидаза может опосредовать гепатоканцерогенез, а ее антагонисты могут быть использованы в терапии рака печени.

Известно, что активация нейтральной мембраносвязанной сфингомиелиназы катализирует гидролиз сфингомиелина до церамида и фосфатидилхолина. На втором этапе церамидаза гидролизует церамид до сфингозина и жирной кислоты. Церамиды и сфингозины, как правило оказывают различные эффекты как на пролиферацию и дифференцировку клеток, так и на процесс апоптоза. Согласно данным других авторов, сфингозин способен индуцировать как пролиферацию, так и апоптоз. Изменение содержания сфингозина приводит к обратимому ингибированию протеинкиназы С, активации митоген — активируемых протеинкиназ (ERK, SAPK), активации фосфолипазы D с образованием, фосфатидной кислоты. Установлено, что фосфатидная кислота активирует гены с — fos, с — туе и индуцирует синтез ДНК, непосредственно участвуя в процессе пролиферации. С другой стороны сфингозин может влиять на экспрессию гена bcl — 2, тем самым регулируя процесс апоптоза. Ингибирование протеинкиназы С сфингозином и другими ингибиторами этого фермента резко усиливает проапоптотическое действие церамида. Клетки, устойчивые к апоптозу, не могут одновременно накапливать церамид и сфингозин. В нашем исследовании одновременное накопление церамида и сфингозина отмечено при курсовом введении липосом, нагруженных церамидом, животным с индукцией гепатоцеллюлярного рака на модели in vivo. В данной опытной группе выявлена обратная корреляционная зависимость между увеличением содержания церамида (г = - 0,89, р < 0,05) и сфингозина (г — 0,83, р < 0,05) и снижением пролиферативной активности гепатоцитов на фоне введения N — нитроздиэтиламина. Необходимо подчеркнуть, что повышение содержания церамида и сфингозина было связано с активацией уровня апоптотической гибели гепатоцитов (г = 0,87, р < 0,05) и (г = 0,92, р < 0,05) в данной опытной группе.

Таким образом, можно предположить, что именно комбинированное действие церамида и сфингозина является необходимым условием для подавления пролиферации и стимуляции апоптотической гибели в опухолевы клетках.

Особый интерес представляет изменение активности сфингомиелиназы и содержания сфингомиелина цикла на различных этапах воспалительного процесса и гепатоканцерогенеза. Так с 60 суток наблюдений, активность сфингомиелиназы у крыс, которым на фоне развития рака печени вводили липосомы, содержащие сфингомиелин снижалась и была менее выраженной по сравнению с аналогичными показателями в остальных опытных группах. Однако, на более поздних этапах развития рака печени концентрация сфингомиелина возростала к 90 суткам наблюдений. Как известно, уровень сфингомиелина — это динамическая величина, которая определяется скоростью его синтеза de novo и скоростью его деградации под действием сфингомиелиназы. Сфингомиелин в клетке может синтезироваться двумя путями: 1) при взаимодействии церамида с цитидинфосфат-холином- 2) при взаимодействии церамида с фосфатидилхолином и переносом холина на сфингомиелин. Снижение содержания сфингозина и церамида может указывать на преобладание синтеза сфингомиелина de novo на поздних этапах гепатоканцерогенеза. Необходимо подчеркнуть, как при развитии хронического гепатита, так и при развитии рака печени изменения активности сфингомиелиназы и содержания сфингомиелина сжожи на поздних стадиях течения хронического гепатита и на поздних этапах развития гепатоцеллюлярного рака [92]. Дальнейшие исследования позволят использовать эти критерии для прогнозирования процесса озлокачествления при развитии хронического воспалительного процесса печеночной паренхимы.

Таким образом, нами установлено, что регуляция как пролиферативной активности опухолевых клеток, так и индукции апоптоза может осуществляться компонентами сфингомиелинового цикла через влияние на функциональную активность ключевых ферментов метаболизма сфингомиелинового цикла, что приводит к сдвигам в содержании сфинголипидов, которые являются одним из компонентов сложного регуляторного пути передачи внутриклеточного сигнала. Выявленные возможности направленной регуляции метаболизма сфинголипидов в опухолевой клетке позволят найти более эффективные биохимические пути индукции програмированной гибели клеток, контроля их роста и дифференцировки для предотвращения процесса злокачественной трансформации.