Регуляция созревания ооцитов амфибий гонадотропными гормонами гипофиза

Содержание

Актуальность проблемы. Оогенез — один из важнейших этапов индивидуального развития. Он завершается созреванием ооцига и формированием зрелого яцйа. Термином «созревание» в работе обозначается комплекс изменений, происходящих в ооците под действием стимулирующего фактора: изменение структуры и свойств поверхностного (кортикального) слоя цитоплазмы, эндоплазмы и ядра оодага (Детлаф и др., 1964, 1965). Последнее претерпевает мейоз и у всех позвоночных до оплодотворения находится на метафазе второго деления созревания. Для того, чтобы снермий мог проникнуть в зрелый ооцит, последний должен овулировать — выйти из оболочек, окружающих его в период оогенеза и обеспечивающих его связь с материнским организмом.

В теле самки ооцигы созревают и овулируют под влиянием гонадотропных гормонов гипофиза. Незадолго до наступления сезона размножения окруженный фолликулярными оболочками ооцит приобретает способность созревать, а иногда и овулировать при перенесении в солевой раствор, без дополнительной стимуляции. Это так называемые спонтанные созревание и овуляция. Чжу-Си и Ван Ю-лан (Tchou-Su and Wang Yu-Lan, 1958) воспроизвели созревание окруженных фолликулярными оболочками ооцигов амфибий in vitro. Это позволило подойти к изучению механизмов взаимодействия стимулирующих созревание факторов с ооцитом и окружающими его фолликулярными оболочками. Так, было показано, что обработка энуклеированных оощпов жаб суспензией гипофизов не приводит к изменению их свойств (Детлаф и др., 1964, 1965), а ингибиторы синтеза РНК и белка (актиномицин Д и пуромицин) подавляют созревание интактных ооцигов од влиянием суспензии гипофизов (Детлаф, 1966). На основании этих данных было высказано предположение о том, что, вызывая созревание ооцига, онадотропные гормоны гипофиза действуют на его ядро (зародышевый

1-узырек) (Детлаф и др., 1964,1965- Детлаф, 1966). Поскольку ооциты, у которых f ¦¦¦¦. зародышевый пузырек был заменен ядром со стадии бластулы, не приобретали f i оообностъ к циготомии, был сделан вывод о необходимости кариоплазмы для приобретения цитоплазмой ооцита способности к цитотомии (Детлаф и др., 1964, 1965).

Основные цели нашего исследования состояли в дальнейшем изучении механизма действия гонадотропных гормонов гипофиза, стимулирующих созревание и овуляцию ооцитов амфибий, и роли кариоплазмы в становлении свойств зрелого яйца.

Научная новизна работы. Автором впервые показано, что генетический материал л ооцита не принимает участия в регуляции реинициации мейоза и независимо и параллельно с Шуетцом (Schuetz, 1967) и Масуи (Masui, 1967) высказано предположение о том, что действие гонадотропинов на созревание ооцитов опосредованно фолликулярными клетками (Скоблина, 1968). В ходе дальнейших исследований удалось разрешить существовавшее в литературе противоречие относительно роли ядер фолликулярных клеток в стимулированном гонадотропинами созревания ооцитов. Было показано, что подавление акхиномицином Д (АД) созревания ооцитов, стимулированного гонадотропными гормонами, которое рассматривалось как доказательство участия ядер фолликулярных клеток в контроле созревания, обнаруживается только при использовании высоких концентраций гормонов и обусловлено гиперстимуляцией образования циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Ядра фолликулярных клеток не контролируют стимулированное гонадотропинами созревание ооцитов, но контролируют стимулированный ими стероидогенез. Поскольку после обработки фолликулов АД и гонадотропином образуется достаточное для созревания ооцитов количество прогестерона, можно думать, что в фолликуле амфибий, как и в ряде стероидогенных систем млекопитающих, существуют два пути регуляции сгероидогенеза: зависимый и независимый от ядра. Показано, что ядра фолликулярных клеток контролируют процесс овуляции. Действие гонадотропинов на овуляцию ооцитов травяной лягушки опосредуется не только простагландином F2a, как предполагалось ранее (Schuetz, 1986- Chang et al, 1995), но и прогестероном. Впервые удалось воспроизвести созревание ооцитов амфибий и осетровых рыб под действием холестерина. Показано, что действие холестерина и гонадотропных гормонов подавляется хлорамфениколом, ингибитором синтеза бежа в митохондриях. В действии гонадотропных гормонов на образование прогестерона, созревание и овуляцию ооцигов амфибий принимают участие хлорные каналы и/или ионы хлора. Они участвуют также в регуляции спонтанного созревания ооцитов, лишенных фолликулярных клеток.

Впервые показано, что кариоплазма не участвует в созревании кортекса ооцига и становлении его способности к кортикальной реакции, но необходима для приобретения цитоплазмой способности контролировать преобразование ядер спермиев в пронуклеусы и стимулировать в них синтез ДНК. Она необходима также для образования мейозиндувдрующего фактора у аксолотля. Научно-практическое значение. Знание механизмов действия гонадотропных гормонов, стимулирующих созревание и овуляцию ооцитов у амфибий, необходимо прежде всего потому, что является составной частью наших представлений о становлении регуляции этих процессов в филогенезе. Оно позволяет обнаружить общие и специфические черты, присущие различным таксономическим группам. Одним из примеров может служить стимуляция гонадотропинами стероидогенеза в преовуляторном фолликуле, характерная для всех позвоночных, и принципиально разная роль стероидов в мейозе низших позвоночных и млекопитающих. Благодаря относительной легкости воспроизведения in vitro процессов созревания и овуляции ооцигов у амфибий оно может служить удобной моделью для изучения регуляции процессов, обнаруживающих сходство у различных групп животных (например, взаимодействие стероида и эйкозаноида в процессе овуляции ооцитов у амфибий и млекопитающих). Кроме того, знание механизма действия гонадотропных гормонов, стимулирующего созревание и овуляцию ооцитов, необходимо для совершенствования методов разведения в неволе редких и исчезающих видов амфибий.

Новое представление о роли ядерного материала ооцига и фолликулярных клеток в рефляции гонадотропными гормонами созревания и овуляции ооцитов включено в учебные курсы биологии развития высшей школы.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ИБР, Межлабораторном семинаре по биологии развития, на Конгрессе по эмбриологии (Париж, 1968), 4-й франко-чешской конференции (Прага, 1990), Европейских (Иерусалим, 1991, Тулуза, 1995) и 12 Международном (Вена, 1993) конгрессах по биологии развития.

Главные результаты работы и сделанные на их основе

выводы изложены в обобщенном виде в настоящем докладе.

Работа выполнена в Лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д. П. Филатова Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН, Отделе физиологии университета г. Турку, Отделе зоологии Хельсинского университета. Краткая характеристика объектов и методов исследования

Ооциш амфибий, являющиеся основным объектом наших исследований, представляют собой крупные клетки (диаметром 1−2 мм), окруженные тремя слоями клеток: ближайшими к ооциту фолликулярными клетками, клетками теки и перитониальным эпителием. В анимальной области ооцита расположено крупное ядро — зародышевый пузырек (ЗП). В процессе созревания ооцитов ЗП перемещается к поверхности ооцита и разрушается. Кариоплазма смешивается с цитоплазмой, а хромосомы собираются на формирующемся веретене, которое располагается непосредственно под поверхностью анимальной области ооцита, перпендикулярно к ней. Ядро ооцита претерпевает два деления созревания и останавливается на метафазе второго деления (метафаза II).

Большая часть опытов была проведена на ооцигах травяной лягушки Rana temporaria. Кроме того, в работе были использованы ооциш шпорцевой лягушки Xenopus laevis, жабы Bufo bufo, испанского тритона Pleurodeles waltl и севрюги Acipenser stellatus.

У оперированной под наркозом или забитой декапитацией самки удаляли яичник (и) или его часть, разделяли с помощью отточенных пинцетов на небольшие фрагменты, состоящие из 1−10 (в опытах с овуляцией 1−5) окруженных фолликулярными оболочками ооцитов (фолликулов) и культивировали различное их количество (от 20 до 100) в разном объеме среды, обычно раствора Ринтера для холоднокровных (от 2 до 7,5 мл). Для стимуляции созревания ооцигов in vitro в большинстве случаев использовали суспензию гомологичных гипофизов, исключение составляли ооциты шпорцевой лягушки, созревание которых стимулировали хориогонином человека из разных источников (отечественный хориогонин Московского эндокринного завода, хориогонины NIH, CR-121 (Sigma, США) и Profasi (Serono, Италия)). Показано (Tchou-Su et Wang Yu-lan, 1958), что для созревания ооцитов необходимо подвергнуть их гормональной обработке в течение определенного (гормонозависимого) периода, по прошествии которого ооциты созревают и после перенесения в раствор Рингера без гормона (гормононезависимый период). Основные преобразования ооцита происходят именно в этот период. Продолжительность гормонозависимого периода сокращается по мере приближения сезона размножения в природе. Созревание ооцигов вызывали также стероидами, главным образом прогестероном.

В работе использованы методы хирургического и энзиматического удаления фолликулярных оболочек, удаления ядра ооцита, пересадки цитоплазмы ооцита, пересадки ядер зародыша, активации ооцигов уколом и тепловым шоком. Использовали также методы световой и электронной микроскопии, радиоавтографии, радиоиммунолотического определения стероидных гормонов и цАМФ, флуоресцентный метод определения внутриклеточного рН, метод определения активности хлора в ооците с помощью ионселекгивных микроэлекгродов. Для изучения взаимоотношений ядра и цитоплазмы в процессе созревания ооцигов впервые использована пересадка ядер спермиев. Был разработан метод обработки спермиев травяной лягушки проназой, делающий их ядра доступными влиянию цитоплазмы ооцита. Статистическая обработка. В большинстве опытов для различных экспериментальных групп рассчитывали среднюю и ошибку средней (из трех параллельных). Для оценки достоверности различий (р<0.05) использовали t-критерий Огьюдента. В тех случаях, когда ооцигов было мало для параллельных определений, использовали рассчитанные доверительные интервалы для показателей качественной изменчивости (Теренгьев и Ростова, 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Роль ядра в решощиации мейоза в ооцитах травяной лшушки и севрюги

С ооцигов отточешшми пинцетами удаляли фолликулярные оболочки и -через разрез в центре анимальной области — ЗП. Опыты были проведены на 500 ооцигах 18 самок травяной лягушки и на 350 ооцитах 8 самок севрюга. Энуклеированные ооцигы обрабатывали суспензией гипофизов (СГ), приготовленной на растворе Рингера для ооцигов лягушек (1 гап на 30 мл) и на полостной жидкости (1 гап на 15 мл) для ооцигов севрюга. Через сутки после начала опыта ооцигы переносили в воду. Ооцигы лягушки активировали уколом стеклянной иглы, а ооциш севрюга осеменяли. Энуклеированные ооцигы лягушки в ряде случаев перед гормональной стимуляцией обрабатывали ингибитором ДНК-зависимого синтеза РНК актиномицином Д (10−20 мкг/мл, 2 ч).

Безъядерные ооцигы лягушки после гормональной стимуляции приобретают некоторые свойства зрелых яиц. Их поверхность становится блестящей, они не повреждаются, попадая в воду, а на укол отвечают активацией. Продолжительность гормонозависимого периода ооцигов влияет на объем перивигеллинового пространства, образующегося при активации безъядерных ооцигов, и на их тургор. Чем короче гормонозависимый период, тем выше тургор ооцигов и тем больше у них перивителлиновое пространство. Безъядерные оощлы, предварительно обработанные АД, в растворе Рингера с СГ не претерпевают описанных изменений. Безъядерные оощтш севрюги, выдержанные в полостной жидкости с СГ и осемененные, внешне не отличаются от осемененных и не начавших дробиться зрелых яиц. У них уплощается анимальный полюс, образуется заметное перивителлиновое пространство, набухают, просветляются и приобретают клейкость оболочки. У таких ооцитов пигмент часто имитирует борозды дробления, иногда образуются неполные борозды («защипки»). При удалении ядра в гормононезависимый период образование «защипок» и борозд наблюдали почти у всех ооцитов, но упорядоченного дробления не было.

Свидетельством зрелости кортикального слоя яйца является его способность к кортикальной реакции — выделению кортикальных гранул под влиянием активирующего стимула. В активированных после гормональной обработки безъядерных ооцитах лягушки и севрюги наблюдалась кортикальная реакция.

У ооцигов травяной лягушки и севрюги с продолжительным гормонозависимым периодом кортекс созревает в отсутствие ЗП (Скоблина, 1968, Skoblina, 1969). С другой стороны, кариоплазма необходима для приобретения цитоплазмой способности к циготомии (Детлаф и др., 1964- Скоблина, 1968- Smith and Ecker, 1969). Претерпевает ли какие-то изменения цитоплазма ооцигов, созревающих в отсутствие кариоплазмы?

В ряде электронномикроскопических работ (Wartenbeig and Schmidt, 1961- Balinsky and Davis- 1963, Gansen, 1966- Айзенштадг и Детлаф, 1968- Kessel and Subtelny, 1969) обнаружено, что созревание цитоплазмы ооцигов у амфибий сопровождается исчезновением в ней пористых пластинок (annulatae lamellae) и появлением большого количества мелких гладкоконтурных пузырьков, образующих шаровидные скопления в поверхностной зоне ооплазмы. Мы изучали мембранные структуры ооцигов, созревающих in vitro после удаления ЗП. В процессе созревания оперированных ооцитов, так же как и контрольных, исчезают пористые пластинки, а в поверхностной зоне цитоплазмы появляются шаровидные скопления мелких, до 200 нм в диаметре, гладкоконтурных пузырьков. В среднем количество этих скоплений и их размеры меньше, чем в норме. Основным источником этих пузырьков в оперированных ооцитах являются, по-видимому, пористые пластинки (Айзенштадг и Скоблина, 1970).

Итак, при обработке гонадотропными гормонами гипофиза безъядерных ооцитов травяной лягушки и севрюги у них, как и у ядросодержащих, созревает кортекс и заметно меняется тонкое строение цитоплазмы. На этом основании мы пришли к выводу о том, что генетический материал ооцита не принимает участия в стимуляции гонадотропными гормонами, по крайней мере, этих изменений ооцита. Скорее всего он вообще не участвует в стимулирующем действии гонадотропинов, а подавляющее созревание ооцитов действие ДД связано с его влиянием на ДНК ядер фолликулярных клеток, значительное количество которых сохраняется на поверхности ооцита при их хирургическом удалении (Скоблина, 1968- Dettlaff and Skoblina, 1969). Одновременно в литературе появились данные о том, что гонадотропные гормоны гипофиза действуют на фолликулярные клетки, вызывая в них синтез прогесгероноподобного вещества, которое и стимулирует созревание ооцита (Masui, 1967- Schuetz, 1967). Созревание ооцитов, стимулированное гонадотропными гормонами, подавлялось АД, а стимулированное прогестероном — нет (Schuetz, 1967).

Итак, генетический материал ооцита не принимает участия в регуляции его созревания. Однако, кроме генетического материала, ЗП содержит большое количество кариоплазм. Играет ли она роль в становлении свойств зрелого яйца?

Роль кариоплазмы в становлении свойств зрелого яйца

Уже упоминалось, что кариоплазма необходима для приобретения цитоплазмой способности к циготомии (Детлаф и др., 1964- Скоблина, 1968- Smith and Ecker, 1969). Большой интерес представляют механизмы цигоплазматического контроля активности ядер. Один из аспектов этой проблемы — цигоплазматаческий контроль делений ядер и синтеза в них ДНК. Существование такого контроля было доказано путем пересадки в ооцигы и яйца шпорцевой лягушки ядер клеток мозга, в норме не делящихся и не синтезирующих ДНК (Gurdon, 1967, 1968, 1969). По данным Гердона, способность цитоплазмы контролировать поведение ядер возникает в процессе созревания ооцитов, при переходе кариоплазмы в цитоплазму. Вопрос об участии кариоплазмы в становлении способности цитоплазмы контролировать поведение ядер оставался открытым. Мы предприняли попытку ответить на этот вопрос, изучая поведение пересаженных ядер в цитоплазме ооцитов жаб, созревших в отсутствие кариоплазмы, а также в цитоплазме интактных ооцитов на последовательных стадиях созревания, вплоть до его завершения. Для пересадки использовали обработанные проназой спермин травяной лягушки.

При пересадке спермиев в цитоплазму зрелых яиц они веда себя сходно со спермиями, проникшими в яйцо в процессе осеменения: их ядра, образуют пронуклеусы, синтезируют ДНК, переходят к делению. В созревающих безъядерных ооцитах ядра спермиев не включают 3Н-тимидина и не претерцевают изменений. На основании полученных результатов можно утверждать, что для преобразования ядер спермиев в пронуклеусы и начала синтеза в них ДНК необходима кариоплазма (Скоблина, 1974- Skoblina, 1976). Недавно показано, что для инициации синтеза ДНК в ооцитах шпорцевой лягушки необходим ядерный фосфопротеин — циклин Е (Chevalier et al., 1996).

Результаты опытов с пересадкой ядер спермиев в ооциты, находящиеся на разных стадиях созревания, свидетельствуют о том, что между переходом кариоплазмы в цитоплазму и началом преобразования ядер спермиев в пронуклеусы существует значительный разрыв во времени. Действительно, если ядра спермиев находились в цитоплазме ооцитов в момент разрушения оболочки ядра или были пересажены в это время, они не увеличивались в объеме и не включали 3Н-тимидин. Даже при пересадке ядер спермиев на стадии появления первых прометафаз II (в момент фиксации большинство ооцитов уже находилось на стадии метафазы II) синтез ДНК начинался в единичных ядрах через 4 ч после инъекции. При пересадке на более поздних стадиях большинство пересаженных ядер включало 3Н-тимидин уже через 2 ч после инъекции. На этом основании мы высказали предположение о том, что преобразование ядер спермиев в пронуклеусы и синтез в них ДНК становятся возможными не в момент формирования метафазы И, а несколько позже (Скоблина, 1974, Skoblina, 1976). Это предположение подтвердилось в опытах Зиглера и Масуи (Zigler and Masui, 1973), наблюдавших преобразование пересаженных ядер клеток мозга только после приобретения яйцами Rana pipiens способности к активации.

Хорошо известно, что в цитоплазме ооцитов амфибий в процессе созревания под влиянием прогестерона образуется так называемый мейозиндуцирующий фактор (МИФ) (Masui and Markert, 1971). В дальнейшем было показано, что он образуется в процессе мейотических и митотичесих делений практически всех изученных видов от дрожжей до человека. У бесхвостых амфибий МИФ образуется в цитоплазме и в отсутствие кариоплазмы (Masui and Markert, 1971). Представляло интерес выяснить, так ли это у других живошых. Наши опьгш были проведены на ооцитах испанского тритона (Skoblina et al., 1984). С сентября по май все достигшие дефинитивного размера и окруженные фолликулярными оболочками ооциты испанского тритона созревают под влиянием стероидных гормонов (прогестерона, тестостерона и синтетического стероида, обладающего гестагенной и эсгрогенной активностью) (10 мкг/мл). После обработки фолликулов бескальциевым раствором пинцетами удается удалить практически все фолликулярные клетки. Иногда после удаления фолликулярных клеток ооцигы начинают созревать спонтанно — без гормональной стимуляции. В четырех из девяти опытов через 48 ч после удаления фолликулярных оболочек созревало от 20 до 40% ооцигов. При инкубации ооцигов, окруженных фолликулярными клетками, никогда не наблюдали спонтанного созревания.

По-видимому, популяция ооцигов испанского тритона, достигших дефинитивного размера, гетерогенна и это сказывается на результатах энуклеации. У некоторых ооцигов ЗП локализован под поверхностью и их энуклеация осуществляется легко, практически без потери цитоплазмы. Такие энукдеированные ооциты всегда созревают после гормональной обработки. Их поверхность претерпевает характерное для зрелйх яиц перераспределение пигмента и они не повреждаются при активации (10% раствор Рингера при 36 °C, 25 мин). У большинства ооцигов ЗП расположен глубоко под поверхностью. При его удалении через разрез поверхности выходит заметное количество цитоплазмы. После гормональной обработки такие" энуклеированные ооцигы имеют различный вид: у одних пигментный рисунок меняется, у других — нет. Ранта в кортексе закрывается и незрелый энуклеированный ооциг по виду не отличается от незрелого интактного. При активации энуклеированные ооцигы с различным пигментным рисунком ведут себя по-разному. Ооциты с измененной пигментацией не повреждаются, тогда как ооцигы с неизмененной пигментацией необратимо повреждаются, их цитоплазма вытекает и заполняет пространство между поверхностью яйца и желточной оболочкой. Другими словами, кортекс таких ооцигов не приобретает сократимости, являющейся характерной чертой кортекса зрелого яйца.

Для того чтобы получить представление о состоянии цитоплазмы энукяеированных ооцигов с разным пигментным рисунком, мы выясняли, образуется ли в них МИФ. Контролем служили нормальные зрелые яйца. В опытах, проведенных на лишенных фолликулярных оболочек ооцигах-реципиентах получены следующие результаты. Инъекция цитоплазмы из интакшых зрелых яиц приводит к созреванию 25 из 40 ооцигов (62.5%), из энуклеированных ооцитов со зрелым кортексом — 40 из 54 (74%) и из энукяеированных ооцигов с незрелым кортексом — 9 из 60 (15%). Удаление фолликулярной оболочки приводит к созреванию 7 из 40 ооцигов. Другими словами, созревание 15% ооцитов в последней серии опыта представляет собой результат спонтанного созревания ооцитов-рецилиенгов, а не влияния инъецированной цитоплазмы. В цитоплазме энуклеированных ооцитов с незрелым кортексом МИФ, по-видимому, не образуется. Результаты опытов по влиянию кариоплазмы на созревание ооцитов испанского тритона представлены в табл. 1. В таблицу включены только результаты, полученные на ооцигах, у которых ЗП был расположен глубоко под поверхностью. Можно видеть, что в большинстве опытов процент созревания энулеированных ооцитов достоверно ниже, чем ишакшых (Skoblina et al., 1984).

Облучение фолликулов рентгеновскими лучами (40 Крад) и обработка их АД (5 и 25 мкг/мл, 2 ч) не влияли на созревание ооцитов под действием стероидных гормонов. Это свидетельствует о том, что снижение процента созревания энуклеированных ооцитов связно с отсутствием кариоплазмы, а не генетического материала ооцига. Следовательно, для образования МИФ в ооцитах испанского тритона в отличие от ооцигов других изученных видов амфибий (Masui and Market, 1971- Masui and Clarke, 1979) необходим какой-то элемент кариоплазмы. Данные о необходимости кариоплазмы для образования МИФ были получены позже на ооцигах другого представителя хвостатых амфибий — аксолотля (Gautier, 1987). Участие кариоплазмы в образовании МИФ

Таблица 1. Влияние энуклеации на созревание ооцитов испанского тритона после удаления у них фолликулярных оболочек

Номер Ооцигы в р-ре Рингера Ооцигы, обработанные стероидными гормонами самки интактные энуклеированные число %созревания число % созревания число % созревания

1 20 25 70 78* 20 0*

2 30 0 60 100* 20 25*

3 30 0 70 61* 40 22*

4 30 20 60 68*

5 30 0 70 57* 20 0*

6 «20 0 40 52* 50 16*

7 20 40 60 75* 50 68*

8 20 20 20 100*

9 20 0 40 97* 40 65* - здесь и далее, если не указано иначе, р< 0,05. показано и для ооцитов морских звезд (Kishimoto et al., 1981). Оказалось, что для образования МИФ необходим содержащийся в кариоплазме ингибитор фосфатазы типа 2А (Picard et al., 1991).

Роль ящер фолликулярных клеток в регуляции гонадотропными гормонами созревания ооцитов и образования прогестерона

Вернемся к стимулирующему созревание ооцитов действию гонадотропных гормонов. На основании подавляющего действия АД на созревание окруженных фолликулярными клетками ооцитов амфибий, стимулированное гонадотропными гормонами гипофиза, и отсутствия подавляющего влияния на созревание ооцитов, стимулированное прогестероном, образующимся в фолликулярных клетках (Schuetz, 1967), создалось впечатление, что АД подавляет образование прогестерона. Известно, что начальная стадия стероидогенеза — превращение холестерина в прегаенолон — осуществляется в митохондриях (Simpson, 1979). Мы показали, что созревание окруженных фолликулярными клетками ооцитов травяной и шпорцевой лягушек и севрюга можно стимулировать холестерином в отсутствие гонадотропных гормонов гипофиза, а предварительная непродолжительная обработка СГ увеличивает процент созревания ооцитов в холестерине (Скоблина и др., 1980, Skoblina et al., 1981). При этом созревание ооцитов в СГ (Шмерлинг и Скоблина, 1976, Schmerling and Skoblina, 1978) и холестерине характеризуется некоторыми общими чертами: оно подавляется ингибитором синтеза белка в митохондриях хлорамфениколом, — ингибитором превращения холестерина в прегаенолон -аминоглютетимвдом и АД (табл. 2 и 3).

Эти данные как будто подтверждали предположение о том, что подавляющее созревание ооцитов действие АД связано с подавлением образования прогестерона. Однако в ряде случаев подавляющее влияние АД на созревание

Таблица 2. Влияние аминоглютетимида (АМГ) на созревание ооцитов травяной лягушки in vitro под действием холестерина и суспензии гипофизов

Но- Процент ооцитов, созревших в мер самки р-ре Рингера р-ре холестерина суспензии гипофизов р-ре холестерина с АМГ суспензии гипофизов с АМГ

1 0 28 80 0* 12*

2 0 46 60 0* 0*

3 0 82 88 16* 2*

4 0 90 100 50* 34*

5 0 68 98 24* 28*

Примечание. В раствор переходило ~ 5 мкг/мл 3Н-холестерина.-Для фолликулов каждой самки предварительно определяли зависимость процента созревания ооцитов от концентрации суспензии гипофизов. В опытах использовали концентрации суспензии, обеспечивающие высокий, но не максимальный процент созревания. Концентрация АМГ — 100 мкг/мл.

Таблица 3. Влияние хлорамфеникола (ХФ) и актиномицина Д (АД) на созревание ооцитов травяной лягушки in vitro под действием холестерина

Но- Процент ооцитов, созревших в мер самки р-ре Рингера р-ре холестерина р-ре холестерина с ХФД00 мкг/мл р-ре холестерина с АД, 25 мкг/мл

1 0 80* 18* 0*

2 14 84* 36* 54*

3 14 48* 16*

4 0 48* 14* 0*

5 0 86* 4* 4* ооцитов, стимулированное гонадотропинами, воспроизвести не удавалось, даже когда концентрация АД была увеличена до 100 мкг/мл (Wasserman and Masui, 1974). С другой стороны, высокие дозы радиации (40−50 крад), выключающие функцию ядер зародыша (Нейфах, 1961), не влияли на созревание in vivo ооцитов травяной лягушки (Гончаров, личное сообщение) и К pipiens (Masui, 1973). Причины различного влияния АД и радиации на созревание ооцитов амфибий оставались невыясненными (Masui and Clarke, 1979). Наши собственные и литературные данные убедили нас в том, что в опытах по влиянию ингибиторов на созревание ооцитов весьма существенную роль играет концентрация гормона (Snyder and Schuetz, 1973- Скобяина и Кондратьева, 1982). Поскольку концентрации гонадотропных гормонов, вызывающие созревание ооцитов разных самок, значительно различаются, мы использовали в каждом опыте несколько концентраций гормонов.

Результаты опытов по влиянию АД на созревание ооцитов травяной лягушки сведены в табл. 4 (Skoblina et al., 1990- Скоблина и Кондратьева, 1992). Окруженные фолликулярными оболочками ооциты 12 самок в растворе Рингера оставались на стадии ЗП, ооциты еще трех (13−15) в той или иной мере созревали спонтанно. Все использованные нами концентрации СГ индуцировали созревание 98−100% ооцитов. После обработки АД созревание подавлялось при использовании высоких концентраций СГ (0,04−0,02 гап/мл). При концентрации

0,01 гип/мл подавление было менее выражено, а при 0,005 гип/мл оно полностью отсутствовало. Неожиданно оказалось, что созревание ооцитов даух из трех самок, часть ооцитов которых созревала спонтанно, достоверно подавлялось даже при использовании этой концентрации СГ. Облучение окруженных фолликулярными оболочками ооцитов травяной лягушки рентгеновскими лучами (50 крад) не вызывало подавления созревания ооцитов ни в одной из использованных нами концентраций СГ.

Результаты опытов, проведенных на фолликулах шпорцевой лягушки, представлены в табл. 5. В отсутствие гормональной обработки ооциты всех самок оставались на стадии ЗП. Поскольку при снижении концентрации отечественного хориогонина процент созревания ооцитов резко снижался, чтобы облегчить сравнение результатов, мы рассчитали отношение процента

Таблица 4. Подавляющее влияние акпшомицина Д (АД) (5 мкг/мл) на созревание in vitro окруженных фолликулярными оболочками ооцитов травяной лягушки

Номер самки Число фолликулов в опыте Доля созревших ооцитов, % в СГ (гип/мл) 0,04−0,005 в СГ (гип/мл) после обработки АД

0,04 0,02 0,01 0,

1−2 100 100 0−3 2−8 37−41 91

3−4 100 99−100 1−4 9−12 74−88 99

5−7 50 100 — 14−23 80−96 98

8−9 50 98−100 — 30−35 77−97 90

10−12 50 98−100 20−32 89

13−14* 100 100 0 0 0−2 40 в растворе Рингера созревало 50 и **100% ооцитов. созревания ооцитов после обработки АД и хориогонином к цроценту их созревания в соответствующей концентрации хориогонина. Снижение концентрации хориогонина тоже уменьшало подавляющее действие АД на созревание ооцитов шпорцевой лягушки. Если судить по изменению пигментного рисунка, то ооцигы шпорцевой лягушки после обработки их АД, как и в контроле, достигают мегафазы II (Скоблина и Кондратьева, 1992).

Итак, результаты наших опытов позволяют понять причины отсутствия в некоторых случаях подавляющего влияния АД (Merriam, 1972- Wasserman and Masui, 1974). В опытах на фолликулах одной и той же самки мы можем получить эффект подавления созревания ооцитов под влиянием АД или не получить его, просто меняя концентрацию гонадотропного гормона.

Вывод о контроле ядрами фолликулярных клеток созревания ооцитов, индуцируемого гонадотропными гормонами, был сделан на ранних этапах

Таблица 5. Подавляющее влияние акгиномицина Д (АД) (5 мкг/мл) на созревание in vitro окруженных фолликулярными оболочками ооцитов шпорцевой лягушки, стимулированное различными концентрациями хориогонина

Номер сам- Число фолликулов Процентное соотношение между долями ооцитов, созревших после предобработки АД и без нее при концентрации хориогонина, МЕ/мл ки в опыте

1 100 0 (0/100)* 0(0/82) — 50(23/46)

2 100 2 (2/100) 2,5 (2/82) — 45 (24/53)

3 100 8 (8/100) 35 (34/96) 71 (56/79) 74 (50/68)

4 50 — 0 (0//58) 54 (28/52)

5 50 59(52/88) 100 (40/40) 100(24/24)

В скобках: в числителе — процент созревших ооцитов после обработки АД, в знаменателе — без обработки. изучения процесса созревания, когда для его индукции использовали очень высокие концентрации СГ (Детлаф, 1966- Schuetz, 1967- наши опыты с энуклеацией ооцитов лягушки и севрюги). Позднее было обнаружено, что созревание ооцитов in vitro можно индуцировать по крайней мере на порядок более низкими концентрациями (Schuetz and Lessman, 1982- Скоблина и Кондратьева, 1982). У травяной лягушки, например, ооцигы большинства самок зимой созревают в 100% случаев под влиянием 0,005 гип/мл, а незадолго до сезона размножения — под влиянием 0,125−0,001 гип/мл. Между тем подавляющее влияние АД наблюдается именно при использовании высоких концентраций гормона. Та же тенденция обнаружена и на фолликулах шпорцевой лягушки — снижение концентрации гормона уменьшает подавляющее действие АД. Поскольку у обоих видов увеличение концентрации гормона при одной и той же концентрации АД приводит к подавлению процесса созревания, создается впечатление, что в этих условиях образуется фактор, подавляющий созревание. Его возникновение связано, по-видимому, именно с обработкой фолликулов АД, т. к. после подавления функции ядер облучением (50 крад) созревание ооцитов не подавлялось. Поскольку эта и более высокие дозы облучения не подавляли и созревание ооцитов лягушек in vivo (Masui, 1973- Гончаров, личное сообщение), выгод о том, что ядра фолликулярных клеток не контролируют процесс созревания ооцитов, представляется достаточно обоснованным. Необходимо подчеркнуть, что речь идет именно о процессе созревания ооцитов — разрушении ЗП и формировании МП, а не об овуляции, которая лишь коррелирует с созреванием ооцитов во времени (Schuetz, 1986). Показано, что ДД подавляет овуляцию ооцитов жаб, стимулированную высокими концентрациями СГ (Детлаф, 1966). Сходные данные недавно получены на ооцитах Sana dybomkii (Chang et al., 1995). В наших опытах АД подавлял овуляцию ооцитов травяной и шпорцевой лягушек при всех использованных концентрациях СГ. Другими словами, действие АД на овуляцию не связано с образованием подавляющего фактора, генетический материал фолликулярных клеток действительно контролируют этот процесс.

Полученные результаты привели к возникновению двух новых вопросов: что представляет собой подавляющий созревание фактор и означает ли отсутствие подавляющего влияния АД и радиации на созревание ооцитов амфибий, индуцируемое низкими концентрациями СГ, что ядра фолликулярных клеток не контролируют стероидогенез.

Представление о том, что в действии гонадотропных гормонов на их органы-мишени пАМФ играет роль одного из посредников, справедливо и для амфибий (Gavaud et al, 1979). В процессе созревания цАМФ отводится двоякая роль: стимулятора (Kwon and Schuetz, 1986) и ингибитора (Marot et al., 1977- Morrill et al., 1981- Ozon et al., 1979). Эс1радиш-17р рассматривается как другой возможный кандидат на роль ингибитора созревания (Schuetz, 1972- Lin and Schuetz, 1983,1985- Скоблина и Кондратьева, 1985). В приведенных ниже опытах мы определяли р адиоиммунологически содержание каждого из них (Скоблина и др., 1993- Skoblina et al., 1995b). пАМФ. Шпорцевая лягушка. В предварительных опытах на фолликулах пяти самок хорионический гонадотропин (NIH, CR-121, Sigma) был использован в концентрации 0,5−10 МЕ/мл. Ооциты всех самок созревали при концентрации хориогонина 2 МЕ/мл и выше. Заметное подавление созревания ооцитов у всех самок наблюдалось при 10 МЕ/мл после предобработки АД. Эти концентрации и были выбраны для определения цАМФ и эстрадиола-17р. В нестимулированных фолликулах шести самок уровень цАМФ колебался от 0,7+0,02 до 1,4+0,1 пМ/фолликул. АД не влиял на содержание цАМФ в нестимулированных фолликулах. В процессе созревания мы определяли уровень цАМФ в фолликуле и в среде, рассчитывали содержание цАМФ в среде на фолликул и складывали две эти величины, получая общее количество цАМФ, образовавшееся в фолликуле за время инкубации. Динамика образования цАМФ при различных вариантах обработки определена на фолликулах трех самок. Она оказалась сходной во всех случаях. В процессе созревания уровень цАМФ увеличивался во всех вариантах опытов. Нарастание общего количества цАМФ в процессе созревания связано с увеличением его секреции в среду культивирования. Наблюдались заметные различия между содержанием цАМФ в фолликулах различных самок. Данные для одной из них представлены на рис. 1. Если созревание индуцировали 2 МЕ/мл хориогонина, через 12 ч общее содержание цАМФ увеличивалось в два раза. Если созревание индуцировали 10 МЕ/мл хориогонина, то уровень цАМФ возрастал быстрее и значительнее — в 15 раз. При обработке АД и 2 МЕ/мл хориогонина общее количество цАМФ увеличивалось быстрее, чем в отсутствие АД, и превышало исходный уровень в 7,5 раза. Процент созревания ооцигов в этих вариантах опыта колебался между 80 и 100%. Если созревание индуцировали 10 МЕ/мл хориогонина после обработки АД, то уровень цАМФ в самом фолликуле уже через час увеличивался в 2,8 раза и в дальнейшем не менялся. Общее количество цАМФ на фолликул увеличивалось в этих условиях в 120 раз через 12 ч. Созревание ооцитов было полностью подавлено. Данные для двух других самок, использованных для