Биоинженерия – использование микроорганизмов, вирусов, трансгенных растений и животных в промышленном синтезе

Введение

Биоинженерия одно из самых современных направлений науки, возникшее на стыке физико-химической биологии, биофизики, генной инженерии и компьютерных технологий. Бурное развитие этих областей за последние годы позволило ученым перейти от простого исследования природных биообъектов к их изменению и усовершенствованию, улучшению их полезных свойств, к созданию совершенно новых биологических объектов, не существующих в природе. Сфера деятельности биоинженерии простирается от создания искусственных органов для компенсации сниженных или утраченных физиологических функций (биомедицинская инженерия) до разработки генетически модифицированных организмов, например, сельскохозяйственных растений и животных (генетическая инженерия).

Среди задач биоинженерии — искусственные белки, выполняющие заданные функции; новые клеточные структуры, обладающие полезными свойствами, и даже целые живые организмы, сконструированные для нужд человека.

В основе биоинженерии — применение технических подходов для решения медицинских проблем в целях улучшения охраны здоровья. Эта инженерная дисциплина направлена на использование знаний и опыта для нахождения и решения проблем биологии и медицины.

Производство продуктов микробного синтеза первой фазы К наиболее известным промышленным продуктам микробного синтеза относятся: ацетон, спирты (этанол, бутанол, изопропанол, глицерин), органические кислоты (лимонная, уксусная, молочная, глюконовая, итаконовая, пропионовая), ароматизаторы и вещества, усиливающие запахи (глутамат натрия). Спрос на последние постоянно увеличивается из-за тенденции к употреблению малокалорийной и растительной пищи, для придания вкусу и запаху пищи разнообразия. Ароматические вещества растительного происхождения можно производить путём экспрессии генов растений в клетках микроорганизмов. Методом генной инженерии в клетки Е. coli введён ген, кодирующий синтез а-антитрипсина человека, ингибирующсго активность эластазы. Его образование бактериями достигает 15% синтеза всех клеточных белков. Таким образом, получают препарат эглин, применяемый для компенсации врождённого отсутствия а-антитрипсина, приводящего к тяжёлой форме эмфиземы лёгких. Иммуномодулятор бестатин, ингибитор поверхностных пептидаз лимфоцитов, продуцирует Streptococcus olivoretuculi. Микроорганизмы — продуценты ингибиторов других важных в медицине ферментов. Например, ингибитор амилазы, синтезируемый Streptococcus tendae, блокирует гидролиз крахмала и снижает содержание сахара в крови; назначается больным диабетом. Каптоприл из культуральной жидкости стрептококков препятствует образованию ангиотензина II и снижает артериальное давление (АД) у гипертоников.

Производство продуктов микробного синтеза второй фазы С использованием микроорганизмов получают витамины В1, В2 (продуценты— бактерии, грибы родов Candida, Pichia, Ashbya); фолиевую, пантотеновую кислоты, пиридоксаль, витамин В12 (продуценты — Propionibacterium shermanii, Pseudomonas denitrificam или метаногенные бактерии). Витамин С производят путём химического синтеза, однако этап высокоселективного дегидрирования D-сорбита в L-сорбозу осуществляют с помощью уксуснокислых бактерий.

Крупномасштабное производство антибиотиков способно давать десятки тысяч тонн продукта в год. Усовершенствование производства антибиотиков связано с селекцией культур, резистентных к бактериофагам, а также с применением мутантных штаммов, у которых отсутствуют системы обратного подавления синтеза антибиотиков. Крупная веха в истории антибиотиков — возможность химической модификации природных (образуемых микроорганизмами) антибиотиков. В настоящее время производят большое количество полусинтетических антибиотиков — направленное изменение структуры антибиотика позволяет расширить спектр действия и, отчасти, снять проблему устойчивости к антибиотикам.

Производство аминокислот, органических кислот, витаминов Производство аминокислот относится к одной из наиболее передовых областей биотехнологии. Аминокислоты получают путем химического синтеза или экстракцией из белковых гидролизатов.

Незаменимые аминокислоты могут получаться микробиологическим путем более эффективно, чем путем химического синтеза, так как при биологическом синтезе используемые микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме. Как продуценты лизина изучаются Brevibacterium lactofermentum и бактерии рода Corynebacterium, также предложены способы биотехнологического получения изолейцина, треонина при использовании E. coli. Большинство исследованных штаммов микроорганизмов независимо от их систематического положения преимущественно накапливают L-аланин и глутаминовую кислоту. Значительно меньше штаммов и в меньшем количестве выделяют аспарагиновую кислоту, лейцин, валин, изолейцин, лизин. За рубежом 60% мощностей по производству аминокислот занимают глутаминовая кислота, далее идут метионин, лизин и глицин. Глутаминовая кислота производится при участии в качестве продуцента штамма Corynebacterium.

С помощью микроорганизмов можно получить до 60 органических кислот. Многие из них получаются в промышленном масштабе — итаконовая, молочная, уксусная, лимонная, яблочная, янтарная. Эти пищевые кислоты используются как регуляторы кислотности и консерванты. Лимонную кислоту получают с помощью Yarrowia lipolytica, Aspergillus niger, молочную — Endomycopsis fibuligera, Rhisopus oryzae, Lactobacillus casei, янтарную — Anaerobiospirillum succiniproducens. Уксусную кислоту получают путем микробиологической конверсии водорода и углекислого газа бактериями Acetobacterium woodi и Clostridium aceticum.

Микроорганизмы содержат много витаминов, которые чаще всего входят в состав ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств данной культуры микроорганизмов и условий культивирования. Некоторые витамины микроорганизмы синтезируют, другие напротив усваивают в готовом виде из окружающей среды. Культура, способная синтезировать какой-либо витамин, называется автотрофной по отношению к нему, если культура не способна синтезировать данный витамин, она является авто-гетеротрофной.

Витамины синтезируют в основном химическим путем или получают из естественных источников. Однако эргостерин, рибофлавин (В2), витамин В12 и аскорбиновую кислоту (микроорганизмы используются как селективные окислители сорбита в сорбозу при производстве витамина С) получают микробиологическим путем. Для синтеза витаминов В1, В2, В6, В12 и аскорбиновой кислоты также используют кефирные грибки, а бифидобактерии — группы В, РР (никотиновая кислота) и Н, однако пока эти микроорганизмы не используются как продуценты витаминов в промышленных масштабах.

Изменяя условия среды, содержание отдельных витаминов можно увеличить. Так, количество рибофлавина зависит от интенсивности аэрации и содержания железа в среде. Количество витаминов в клетках, а также их выделение из последних можно изменить при помощи микроэлементов. Существует производство рибофлавина на основе использования дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbia gossypii. Рибофлавин продуцируется также видами Clostridium и Ascomycetes. Микроводоросль Dunalieiia viridis культивируется с целью получения в-каротина.

Микроорганизмы являются источником получения липидов специального назначения с заранее определенными свойствами. Микробные жиры заменяют растительные (а в ряде случаев и превосходят) и могут использоваться в разных отраслях промышленности, с.-х., медицине.

Получение пищевых ароматизаторов микробиологическим путем может быть более выгодным и продуктивным, чем их химический синтез или другие традиционные способы. Так, в США был разработан экологически безопасный биокаталитический способ синтеза ванилина из глюкозы с использованием генетически модифицированного штамма E. coli и грибного фермента дегидрогеназы. Аромат ванилина при биотехнологическом его получении оказался в несколько раз интенсивнее обычного.

Весьма перспективно использование грибных культур в качестве продуцентов сырных, грибных, рыбных ароматизаторов. Освоены биотехнологические способы получения веществ, имитирующих ароматы земляники, малины, банана, кокоса, яблока, персика, миндаля.

Микроорганизмы являются важным источником получения полимерных материалов на основе полисахаридов. Ценным микробным полисахаридом является декстран, образуемый бактериями рода Leucomonstoс. Декстран служит основой получения медицинских препаратов (кровезаменителей) и препаратов для биохимических исследований — сефадексов и др. молекулярных сит. Нуклеозиды, нуклеотиды и их производные также можно получать с помощью микроорганизмов.

Большинство пищевых красителей синтезируют химическим путем, но некоторые натуральные пигменты микроорганизмов могут быть с успехом использованы в качестве красителей для пищевых продуктов. Так, из гриба Monascus получен натуральный красный пищевой краситель. Из бактерий с Канарских островов получен розовый краситель для мороженого, крема, мыла. Такие красители безвредны и придают стойкий цвет продуктам, что позволяет предположить, что в будущем микробиологическому производству красителей будет уделяться больше внимания, чем в настоящее время

Производство спиртов и полиолов

Этиловый спирт используется для технических нужд — для производства синтетического каучука, как растворитель, для синтеза других веществ, а также на изготовление напитков и медицинские нужды. Спиртовое брожение — хорошо изученный биохимический процесс. Спиртовое брожение вызывают чаще всего дрожжи, реже некоторые бактерии (Sarcina) и плесневые грибы (Mucor). В промышленности дрожжи обычно разделяют на верховые и низовые. Верховые дрожжи интенсивно ведут брожение и труднее осаждаются. К ним принадлежат спиртовые и хлебопекарные дрожжиSaccharomyces cerevisiae, а также винные дрожжи из вида Saccharomyces elipsoideus. К низовым дрожжам относятся виды, используемые в пивоваренной промышленности. В производстве процесс брожения ведут 2 — 3 суток.

В ходе брожения углеводы распадаются в конечном итоге до этилового спирта, углекислого газа и воды. Промежуточный продукт — ацетальдегид. Если к питательной среде добавить сульфиты, которые связывают ацетальдегид, при брожении можно получить значительное количество глицерина, что и применяется в промышленности. В этом случае основной конечный продукт брожения — трехатомный спирт глицерин. В процессе спиртового брожения могут накапливаться изоамиловый, амиловый и изобутиловый спирты (сивушные масла). Некоторые дрожжи и бактерии способны продуцировать бутанол, а также 2,3-бутандиол. Эти продукты обычно синтезируют из нефти, однако микробное получение этанола и других спиртов вызывает все больший интерес.

В России большая часть этанола получается микробиологическим путем из растительного сырья. Сырьем могут быть гидролизаты древесины, меласса, крахмал, молочная сыворотка. Отходы производства этанола содержат белки, углеводы, рибофлавин и др. витамины, и могут использоваться как кормовая добавка.

При получении спирта из древесины перед гидролизом древесину размельчают до стружек толщиной 3 мм, шириной 10 — 70 мм и длиной 25 мм. Гидролиз идет в больших (до 50 кубометров) гидролизных аппаратах, которые наполняют стружкой, добавляют 0,5%-ный раствор Н2SО4 и вводят пар давлением 1−1,2 МПа. Варка идет 40—50 мин. Выход сахара 45— 48% от сухой массы древесины. Реакция среды полученного гидролизата кислая, рН 1,8—2,2, поэтому гидролизат нейтрализуют известковым молоком, в котором содержится 1,1 —1,2 кг/л извести; в гидролизате сравнительно мало азота и фосфора, поэтому предварительно к каждому кубическому метру гидролизата добавляют 0,3 кг суперфосфата и 0,15 кг сульфата аммония. При температуре 85 °C через гидролизат продувают воздух, рН среды 5−6. Гипс осаждают, а прозрачную часть гидролизата после охлаждения используют для сбраживания. Спирт получают и из мелассы. Предварительная подготовка питательной среды очень проста — мелассу разбавляют и добавляют питательные соли. Для приготовления напитков используют спирт, полученный только из пищевого сырья. Для технических нужд используют спирт, полученный из гидролизатов древесины, сульфитного щелока.

Сдвиг в сторону получения микробиологического этанола наблюдается и в др. странах. Найдены бактерии Zymomonas mobilis, которые вдвое эффективнее сбраживают углеводы в этанол, чем дрожжи. В Бразилии производство топливного спирта вносит наибольший вклад в энергобаланс страны и составляет миллиарды литров.

Ферментация мелассы различными видами Clostridium acetobutilicum, другими бактериями, вызывающими маслянокислое брожение, может быть использована для получения не только этанола, но и ацетальдегида, уксусной кислоты, этилацетата и диэтилового эфира. Субстратом для такого брожения могут быть зерновые, мелассно-зерновые заторы или меласса. Если среду готовят из зерна, например, кукурузы, то сначала получают муку грубого помола, ее смешивают с водой из расчета 6—8 кг муки на 100 л воды. Затем затор варят 2 ч под давлением 0,2 МПа и стерилизуют. Охлажденную до 37—42°С массу сбраживают в течение 2 суток, рН среды 5−7. В процессе брожения из глюкозы образуется смесь, содержащая 6 частей бутилового спирта, 1 часть этилового спирта и 3 части ацетона. Разработаны методы получения ацетона и бутилового спирта из сульфитного щелока и гидролизатов древесины. В ацетоно-бутиловом брожении в первый период образуется уксусная и масляная кислоты, выделяется водород и углекислый газ. Затем масляная кислота восстанавливается до бутилового спирта.

Штаммы-продуценты первичных метаболитов получают путем индуцированного мутагенеза, так как в природе мутации, ведущие к сверхпродукции одного из метаболитов вредны. Нарушения в обмене веществ приводят к снижению конкурентоспособности и жизнеспособности микроорганизмов. Первичные метаболиты синтезируются природными микроорганизмами в количествах, необходимых лишь для удовлетворения их потребностей. Мутантные формы микроорганизмов могут синтезировать аминокислоты вплоть до концентрации 100 г/л (для сравнения — организмы дикого типа накапливают аминокислоты в количествах, исчисляемых миллиграммами).

Продуценты белка

Производство микробной биомассы — самое крупное микробиологическое производство. Микробная биомасса может быть хорошей белковой добавкой для домашних животных, птиц и рыб. Производство микробной биомассы особенно важно для стран, не культивирующих в больших масштабах сою (соевую муку используют как традиционную белковую добавку к кормам).

При выборе микроорганизма учитывают удельную скорость роста и выход биомассы на данном субстрате, стабильность при поточном культивировании, величину клеток. Клетки дрожжей крупнее, чем бактерий, и легче отделяются от жидкости при центрифугировании. Можно выращивать полиплоидные мутанты дрожжей с крупными клетками. В настоящее время известны только две группы микроорганизмов, которым присущи свойства, необходимые для крупномасштабного промышленного производства: это дрожжи рода Candida на n-алканах (нормальных углеводородах) и бактерии Methylophillus methylotrophus на метаноле.

Микроорганизмы можно выращивать и на других питательных средах: на газах, нефти, отходах угольной, химической, пищевой, винно-водочной, деревообрабатывающей промышленности. Экономические преимущества их использования очевидны. Так, килограмм переработанной микроорганизмами нефти дает килограмм белка, а, скажем, килограмм сахара — всего 500 граммов белка. Аминокислотный состав белка дрожжей практически не отличается от такового, полученного из микроорганизмов, выращенных на обычных углеводных средах. Биологические испытания препаратов из дрожжей, выращенных на углеводородах, которые проведены и у нас в стране и за рубежом, выявили полное отсутствие у них какого-либо вредного влияния на организм испытуемых животных. Опыты были проведены на многих поколениях десятков тысяч лабораторных и сельскохозяйственных животных. В непереработанном виде дрожжи содержат неспецифические липиды и аминокислоты, биогенные амины, полисахариды и нуклеиновые кислоты, а их влияние на организм пока еще плохо изучено. Поэтому и предлагается выделять из дрожжей белок в химически чистом виде. Освобождение его от нуклеиновых кислот также уже стало несложным.

В современных биотехнологических процессах, основанных на использовании микроорганизмов, продуцентами белка служат дрожжи, другие грибы, бактерии и микроскопические водоросли.

С технологической точки зрения наилучшими из них являются дрожжи. Их преимущество заключается прежде всего в «технологичности»: дрожжи легко выращивать в условиях производства. Они характеризуются высокой скоростью роста, устойчивостью к посторонней микрофлоре, способны усваивать любые источники питания, легко отделяются, не загрязняют воздух спорами. Клетки дрожжей содержат до 25% сухих веществ. Наиболее ценный компонент дрожжевой биомассы — белок, который по составу аминокислот превосходит белок зерна злаковых культур и лишь немного уступает белкам молока и рыбной муки. Биологическая ценность дрожжевого белка определяется наличием значительного количества незаменимых аминокислот. По содержанию витаминов дрожжи превосходят все белковые корма, в том числе и рыбную муку. Кроме того, дрожжевые клетки содержат микроэлементы и значительное количество жира, в котором преобладают ненасыщенные жирные кислоты. При скармливании кормовых дрожжей коровам повышаются удои и содержание жира в молоке, а у пушных зверей улучшается качество меха. Интерес представляют и дрожжи, обладающие гидролитическими ферментами и способные расти на полисахаридах без их предварительного гидролиза. Использование таких дрожжей позволит избежать дорогостоящую стадию гидролиза полисахаридсодержащих отходов. Известно более 100 видов дрожжей, которые хорошо растут на крахмале как на единственном источнике углерода. Среди них особенно выделяются два вида, которые образуют как глюкоамилазы, так и в-амилазы, растут на крахмале с высоким экономическим коэффициентом и могут не только ассимилировать, но и сбраживать крахмал: Schwanniomyces occidentalis и Saccharomycopsis fibuliger. Оба вида — перспективные продуценты белка и амилолитических ферментов на крахмалсодержащих отходах. Ведутся поиски и таких дрожжей, которые могли бы расщеплять нативную целлюлозу. Целлюлазы обнаружены у нескольких видов, например у Trichosporon pullulans, однако активность этих ферментов низкая и о промышленном использовании таких дрожжей говорить пока не приходится. Дрожжи из рода Kluyveromyces хорошо растут на инулине — основном запасном веществе в клубнях топинамбура — важной кормовой культуры, которая также может быть использована для получения дрожжевого белка.

В последнее время в качестве продуцентов белка стали использовать бактерии, которые отличаются высокой скоростью роста и содержат в биомассе до 80% белка. Бактерии хорошо поддаются селекции, что позволяет получать высокопродуктивные штаммы. Их недостатками являются трудная осаждаемость, обусловленная малыми размерами клеток, значительная чувствительность к фаговым инфекциям и высокое содержание в биомассе нуклеиновых кислот. Последнее обстоятельство неблагоприятно только в том случае, если предусматривается пищевое использование продукта. Снижать содержание нуклеиновых кислот в биомассе, употребляемой на корм животным, нет необходимости, так как мочевая кислота и ее соли, образующиеся при разрушении азотистых оснований, превращаются в организме животных в алантоин, который легко выделяется с мочой. У человека избыток солей мочевой кислоты может способствовать развитию ряда заболеваний.

Следующую группу продуцентов белка составляют грибы. Они привлекают внимание исследователей благодаря способности утилизировать самое разнообразное по составу органическое сырье: мелассу, молочную сыворотку, сок растений и корнеплодов, лигнини целлюлозосодержащие твердые отходы пищевой, деревообрабатывающей, гидролизной промышленности. Грибной мицелий богат белковыми веществами, которые по содержанию незаменимых аминокислот ближе всего к белкам сои. Вместе с тем белок грибов богат лизином, основной аминокислотой, недостающей в белке зерновых культур. Это позволяет на основе зерна и грибной биомассы составлять сбалансированные пищевые и кормовые смеси. Грибные белки имеют достаточно высокую биологическую ценность и хорошо усваиваются организмом.

Положительным фактором является и волокнистое строение выращенной культуры. Это позволяет имитировать текстуру мяса, а с помощью различных добавок — его цвет и запах. Хранят грибной мицелий обычно в замороженном виде.

В качестве субстрата грибами используются глюкоза и другие питательные вещества, а общим источником азота служат аммиак и аммонийные соли. После завершения стадии ферментации культуру подвергают термообработке для уменьшения содержания рибонуклеиновой кислоты, а затем отделяют мицелий методом вакуумного фильтрования.

Источниками белковых веществ могут служить и водоросли. При фототрофном способе питания и образования биомассы они используют углекислый газ атмосферы. Выращивают водоросли, как правило, в поверхностном слое прудов, где с площади 0,1 га можно получить столько же белка, сколько с 14 га посевов фасоли. Белок водорослей пригоден не только для кормовых, но и пищевых целей.

Наконец, хорошими продуцентами белка являются рясковые, которые накапливают протеина до 45% от сухой массы, а также до 45% углеводов. Однако, несмотря на свои малые размеры, они не принадлежат к вышеперечисленным производителям белка (микроорганизмам), так как не только являются многоклеточными организмами, но и относятся к высшим растениям.

Производство биомассы

В настоящее время существуют следующие основные типы биопроцессов:

— производство биомассы (например, белок одноклеточных);

— клеточных компонентов (ферменты, нуклеиновые кислоты и т. д.)

— метаболитов (химические продукты метаболической активности), включая первичные метаболиты, такие как этанол, молочная кислота;

— вторичные метаболиты ;

— односубстратные конверсии (превращение глюкозы во фруктозу);

— многосубстратные конверсии (обработка сточных вод, утилизация лигноцеллюлозных отходов).

Человек традиционно получает белки, жиры и углеводы (основные компоненты пищи) из животных и растительных источников. Уже сегодня эти источники не покрывают все увеличивающиеся потребности человечества. Выяснилось, что белки и жиры микроорганизмов с успехом могут заменить белки и жиры традиционного происхождения. Преимущества микроорганизмов как продуцентов белка состоит в высоком содержании белка в биомассе и высокой скорости роста микроорганизмов.

Термин белок одноклеточных (БОК) был предложен в 1966 г. для обозначения биомассы различных микроорганизмов (бактерий, дрожжей, грибов и водорослей). Кроме высокого содержания белка микробная биомасса содержит также жиры, нуклеиновые кислоты, витамины и минеральные компоненты. Источниками получения пищевого белка могут стать также белковые изоляты из различных видов зеленой биомассы, в том числе и из табака.

Для получения БОК используют самые разнообразные субстраты, включая парафины нефти, метан, водород, метанол, этанол, уксусную кислоту, углекислый газ, молочную сыворотку, мелассу, крахмал и целлюлозосодержащие отходы промышленности и сельского хозяйства.

Для промышленного использования перспективными являются термофильные (растущие при высоких температурах до 50о С) микроорганизмы. Качество биомассы оценивается по высокому содержанию белка, низкому содержанию нуклеиновых кислот и отсутствию вредных веществ.

Как пример промышленного производства биомассы можно привести получение хлебопекарных дрожжей. В производстве хлебопекарных дрожжей используют специально отобранные расыSaccharomyces cerevisiae. При отборе культуры принимают во внимание способность дрожжей сбраживать тесто, они должны обладать хорошей подъемной силой и ферментативной активностью, хорошо расти на мелассной среде в условиях глубинной ферментации и давать высокий выход биомассы. Клетки дрожжей должны легко отделяться от культуральной жидкости сепарированием или фильтрацией и хорошо сохраняться в прессованном виде. Подъемную силу дрожжей выражают в минутах, в течение которых определенное количество дрожжей развиваясь в определенном количестве теста, увеличивает его объем на предусмотренную стандартом величину. Для хороших дрожжей подъемная сила не должна превышать 75 мин.

Хлебопекарные дрожжи обладают и бродильной активностью, но чтобы направить использование углеводов субстрата только на образование биомассы, спиртовое брожение ограничивают всеми доступными средствами. Это достигается интенсивной аэрацией среды, а также поддержанием низкой концентрации сахара в ней (0,5—1,5%). При высокой концентрации сахаров наблюдается катаболитная репрессия ферментов цикла Кребса и переключение энергетического метаболизма преимущественно на брожение. Чтобы избежать этого, сахар в среду подают непрерывно с постоянной или возрастающей скоростью притока. Чтобы предотвратить чрезмерное размножение побочной микрофлоры, особенно так называемых диких дрожжей, удельная скорость роста которых выше, чем у хлебопекарных дрожжей, процесс ферментации обычно ведут по периодической схеме в течение 10—20 ч.

Товарные дрожжи обычно получают в три этапа. Сначала размножают первый посевной материал (задаточные дрожжи), затем вторые задаточные дрожжи и из них получают товарные дрожжи. Получение первых задаточных дрожжей идет без притока среды; длительность процесса 6—7 ч. На втором этапе стремятся полностью исключить спиртовое брожение, поэтому дрожжи выращивают в условиях очень интенсивной аэрации, лимитируя концентрацию сахара в среде, по проточному методу культивирования. Чаще всего длительность этого этапа 10 — 12 ч. Последний этап производства товарных дрожжей длится 10 — 24 ч. Биомассу дрожжей отделяют от культуральной жидкости, используя сепарирование, в три этапа, при двукратной промывке суспензии клеток водой для удаления остатков среды, бактерий и примесей. Получают концентрат дрожжей, содержащий 80—120 г/л сухой биомассы. Его охлаждают до 8—10°С, фильтруют на вакуум-фильтрах или фильтр-прессах и получают дрожжевую пасту с 70—75%-ной влажностью. После кондиционирования пасты водой до стандартной (75%) влажности, дрожжи фасуют в плитки массой 50, 100, 500, 1000 г и упаковывают. Хранят прессованные дрожжи при температуре 0 — 4 °C до 10 суток. Хлебопекарные дрожжи можно высушивать при температуре 30—40°С до влажности 8% и хранить до 6 мес.

Кормовые дрожжи получают с помощью Candida и Trichosporon. Выбирая культуру, надо следить, чтобы скорость ее роста в соответствующей среде была максимальной, в состав биомассы входило бы много белков, витаминов, чтобы культура в определенных условиях была вирулентной (могла конкурировать с сопутствующей микрофлорой). Кормовые дрожжи получают из доступных, дешевых, содержащих углерод видов сырья:

· углеводсодержащее сырье (гидролизаты древесных и сельскохозяйственных отходов, меласса, сульфитный щелок целлюлозной промышленности);

· природные и синтетические субстраты, содержащие органические кислоты, спирты и другие окисленные соединения углерода (отходы спиртовой промышленности — барда, отходы производства синтетических моющих веществ и др.);

· углеводороды (нефть, парафины, природные газы).

При производстве кормового белка не требуется получение жизнеспособной микробной массы, поэтому требования при выделении клеток более просты.

Живая биомасса молочнокислых бактерий, которая широко используется в молочной промышленности, в пищевой промышленности, в сельском хозяйстве и в ветеринарии, называетсямолочнокислые закваски. Кроме этого, живые клетки микроорганизмов используются для получениябактериальных удобрений, микробных инсектицидов [2, 3].

Биосинтез заражёнными клетками чужеродных белков лежит в основе некоторых современных промышленных способов получения белков, например, антигенов. Недавно промышленным способом были получены некоторые вирусные векторы и лекарственные белки, в настоящее время они проходят клинические и доклинические испытания.

Метаболическая инженерия растений Метаболическая инженерия направлена на проведение трансгенной клеткой новых биохимических реакций. Эти реакции детерминируют ферменты, кодируемые чужеродными генами или собственными модифицированными генами. Растения представляют один из наиболее привлекательных объектов для метаболической инженерии. Имея одинаковые пути синтеза основных биологических соединений, растения отличаются поразительным разнообразием своих конечных продуктов: сахаров, ароматических соединений, жирных кислот, стероидных соединений и других биологически активных веществ. Растения дают человечеству десятки тысяч природных продуктов, многие из которых представляют большую ценность для фармакологии и промышленности.

Часто такими продуцентами важных лекарственных веществ являются уникальные тропические и эндемические растения, недоступные для их агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира. Выделение из таких растений генов, определяющих направленный синтез специфических органических соединений, и их перенос в подобранные соответствующие растения превращают их в новые продуценты важных биологически активных веществ.

Многие растения содержат предшественники биосинтеза ценных биологических соединений, однако они не имеют ферментов для их превращений в эти соединения. Часто для целей метаболической инженерии достаточно переноса в клетку только одного гена. Примером такого типа метаболической инженерии является получение новых растений — продуцентов скополамина. Скополамин, как и атропин, является антихолинэргическим лекарственным веществом.

Создание растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами В настоящее время не вызывает сомнений, что многие продукты, потребляемые с фруктами, овощами и злаками, могут проявлять фармакологические эффекты и блокировать развитие сердечно-сосудистых, раковых и других заболеваний. К таким природным соединениям растений относятся сульфорафан из брокколи, резвератрол из винограда, генистеин из сои, эпигаллокатехин-3-галлат из зеленого чая.

Ранее было практически невозможно с помощью селекции создать растения с повышенным содержанием витаминов. Однако с развитием биохимии растений стало более ясным, какие метаболические пути являются критическими для биосинтеза витаминов. Например, для синтеза в-каротина (провитамина А) в растениях необходима фитоен-синтетаза. Этот фермент участвует в конденсации двух молекул геранил-геранил дифосфата. Ген фитоен-синтетазы из нарцисса введен в рис и экспрессирован в эндосперме риса. Таким образом, получен «золотой рис», который может помочь 2 млрд. человек, страдающих от дефицита витамина А, для которых рис — основная пища. Получены трансгенные растения рапса (канолы), экспрессирующие ген фитоен-синтетазы, в семенах которых значительно повысилось содержание каротиноидов. Показана экспрессия этого же фермента в клубнях картофеля, что приводило к повышенному синтезу каротиноидов и лютеина.

Конструирование трансгенных растений — продуцентов целевых белков микробный синтез антибиотик инженерия Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для продукции различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных. За последние 20 лет множество ценных белков эффективно экпрессировано в растениях. Это белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Растительные системы имеют перспективы успешного использования для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе.

Рекомбинантные белки, экспрессируемые в растениях Первым фармацевтически значимым белком, экспрессированным в растениях табака и подсолнечника в 1986 г., явился человеческий гормон роста. С тех пор множество других ценных белков были синтезированы в самых различных растениях (табл.1).

Среди разнообразия рекомбинантных белков, продуцируемых растениями есть белки, используемые в молекулярно-биологических исследованиях (авидин), молочные белки, используемые в качестве пищевых добавок (казеин) и белки-полимеры для медицинских и промышленных целей (коллаген и эластин). Ценные биологически активные пептиды можно получать, встраивая их в состав запасных белков семян. Так, последовательность ДНК, кодирующая пентапептидный нейрогормон животных лейэнкефалин была встроена в ген 2S альбумина запасного белка семян Arabidopsis thaliana. Экспрессия этого гена в трансформированных растениях рапса и арабидопсиса позволила получить их семена с высоким содержанием рекомбинантного белка. Целевой пептид легко выделялся из рекомбинантного белка с помощью специфического протеолитического расщепления.

Примеры фармацевтически ценных белков, синтезируемых трансгенными растениями, приведены в табл.1. Многие из этих белков представляют собой продукты крови человека, такие как человеческий сывороточный альбумин (годовое производство более 500 тонн), цитокины и другие сигнальные молекулы.

Таблица 1. Некоторые белки, синтезируемые трансгенными растениями

До недавнего времени большинство белков экспрессировали в трансгенном табаке и экстрагировали из листьев. В основном, эти белки синтезировались на низком уровне, обычно менее 0.1% от растворимого белка клеток. В последние годы стали использовать другие системы трансформации и экспрессии, позволяющие нарабатывать белки в больших количествах. Более высокие уровни экспрессии получены в различных растениях с помощью обычной агробактериальной трансформации. Так гирудин, слитый с олеозином (белком из масляных телец), в семенах трансгенной канолы экспрессировался на уровне 0.3%. Трансформация хлоропластов геном человеческого гормона роста давала уровень экспрессии до 7%, а геном человеческого сывороточного альбумина — более 11% от растворимого белка клеток.

Некоторые белки, синтезируемые трансгенными растениями, уже производятся некоторыми западными компаниями или будут выпущены на рынок в ближайшие 5 лет. Например, авидин, трипсин и в-глюкуронидаза, выделяемые из трансгенной кукурузы, производятся фирмой Sigma-Aldrich (США). В скором времени должны быть подготовлены к промышленному производству коллаген, липаза, лактоферрин, лизоцим, синтезируемые трансгенными растениями. Следует отметить перспективность получения модифицированных растений, экспрессирующих новые формы антимикробных пептидов.

Экспрессия рекомбинантных антител в трансгенных растениях В 1989 г. Хиаттом с соавторами впервые достигнута экспрессия антител в растениях табака. Таким образом, было показано, что растения могут собирать сложные функциональные гликопротеины, состоящие из нескольких субъединиц. Типичные антитела представляют собой тетрамеры из двух идентичных тяжелых и двух легких цепей, однако есть более сложные формы, например секреторные антитела, представляющие собой димеры обычных антител и включающие две дополнительные полипептидные цепи. Если у животных для сборки таких антител нужны два типа клеток, то у растений эта сборка антител проходит в одной клетке. Для этого получено четыре различных типа трансгенных растений, синтезирующих отдельные цепи иммуноглобулинов. Скрещивание между этими трансформантами дало потомство, способное к сборке антител в одной клетке. Такие антитела обладали иммуногенностью, они накапливались в клетках в количестве до 1,3% от суммарного растворимого белка.

Кроме полноразмерных иммуноглобулинов в растениях успешно синтезированы разные их производные: Fab-фрагменты (fragment antigen binding), одноцепочечные вариабельные фрагменты (single-chain variable fragment, scFv), биспецифичные вариабельные фрагменты. Данные о синтезе некоторых антител трансгенными растениями приведены в табл.2.

Таблица 2. Антитела, синтезируемые трансгенными растениями

(РБ — растворимый белок; СВ — сырой вес) Антитела, полученные в растениях, могут быть одними из первых фармакологических белков, нарабатываемых в промышленных масштабах. Во многих исследованиях антитела получают в семенах злаковых и бобовых растений, что дает преимущество при их долговременном хранении при обычной температуре без потери активности. В семенах ячменя содержание диагностических антител достигало 150 мг/г веса семян. Из многих бобовых только горох и соя используются в настоящее время в качестве продуцентов рекомбинантных белков. Хотя соя дает сравнительно небольшой урожай по сравнению с кукурузой и рисом, содержание белка в семенах сои очень высокое — свыше 40%. Описан синтез человеческих антител к вирусу генитального герпеса в листьях и семенах сои. Горох дает такой же урожай, как и соя и содержание белка в его семенах такое же, однако цена его выращивания на 50% выше. В горохе были экспрессированы одноцепочечные антитела. Одни из таких антител против ракового антигена синтезировались на низком уровне под контролем семяспецифичного легуминового А-промотора. Другие антитела экспрессировались под семенным промотором USP и их синтез достигал 2% от общего белка семян. Семяспецифичный промотор фасоли был использован для экспрессии одноцепочечных антител в Arabidopsis thaliana.

Кроме того, антитела в растениях были получены методом агроинфильтрации, а также с использованием векторов на основе вирусов. Преимущества этих двух систем в том, что можно получить миллиграммы белка за несколько дней вместо нескольких месяцев, которые требуются для получения трансгенных либо транспластомных линий растений.

Различия в гликозилировании у растений и животных могут быть важны при использовании в медицине антител, синтезированных в растениях. У растений гликопротеины имеют два углеводных остатка, не встречающихся у млекопитающих — в (1,2)-ксилозу и б (1,3)-фукозу Общая схема гликозилирования белков в клетках животных и растений показана на рис.3

Возможно, эти олигосахаридные остатки могут стать аллергенами для человека, поскольку в крови подопытных животных обнаруживались специфические иммуноглобулины IgE против растительных углеводных детерминант, хотя в недавних экспериментах на мышах этот результат не подтверждается. В животных клетках ключевым ферментом, превращающим N-гликаны растений в N-гликаны млекопитающих, является в (1,4)-галактозилтрансфераза. Было проведено скрещивание трансгенных растений табака, синтезирующих этот фермент, с растениями — продуцентами тяжелой и легкой цепей антител. У полученного потомства, содержащего все три белка, до 30% иммуноглобулинов имели галактозилированные N-гликаны.

Многие рекомбинантные антитела, первоначально синтезируемые в растениях, секретировались в апопласт. Однако не так давно показано, что для усиления стабильности антител необходимо использовать сигнальный лидерный пептид и С-концевой сигнал KDEL (лизин-аспартат-глутамат-лейцин) для удерживания в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), а также для предотвращения добавления к антителам иммуногенных N-гликанов. Белки растений, связанные с ЭПР, содержат N-гликаны маннозного типа, являющиеся обычными и для животных и поэтому, они не должны быть иммуногенны. Недавно показано, что химерные мышино-человеческие антитела, имеющие KDEL-сигнал на легкой и тяжелой цепи, собирались в функциональную форму H2L2, и содержали 6−9 остатков маннозы.

В последнее время проводятся эксперименты по изменению гликозилирования белков человека в трансгенных растениях. Вероятно, эта проблема будет решена тем или иным путем и антитела, синтезированные в растениях, будут широко использоваться в медицине.

Одним из первых продуктов на основе трансгенных растений табака, подготовленным к крупномасштабному производству, является препарат CaroRx, представляющий собой секреторные антитела IgA против Streptococcus mutans — основного возбудителя кариеса. Эти антитела при нанесении их на зубы добровольцев оказались очень эффективными и предотвращали повторное заражение S. mutans на период до двух лет. Другие моноклональные антитела, экспрессированные в сое — антитела против генитального герпеса, могут также быть внедрены в производство. Эти антитела, несмотря на различие в гликозилировании, защищали мышей от вируса герпеса типа 2 так же хорошо, как и антитела, синтезированные в культуре клеток человека. Еще одни антитела, прошедшие фазу I клинических испытаний — scFv-антитела против лимфомы.

Имеется ряд сообщений об успешном синтезе в растениях и в суспензионных клетках растений мини-антител.

Синтез субъединичных вакцин в трансгенных растениях Впервые структурная идентичность и иммуногенность антигена, синтезированного в растениях, была подтверждена в 1992 г., когда были получены трансгенные растения табака, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). В дальнейшем теми же исследователями был показан иммунный ответ у мышей, вакцинированных антигеном, выделенным из листьев табака. Кроме того, получены растения картофеля и суспензионные культуры табака и сои, где антиген экспрессировался на уровне до 1700 мкг/г сухого веса. Показано, что HBs-антиген, синтезируемый растениями картофеля, вызывал у мышей более сильный иммунный ответ, чем продуцируемый дрожжами. Проведены испытания вакцины на основе трансгенного картофеля на добровольцах и показана ее иммуногенность при оральном введении.

Нами получены растения табака, экспрессирующие рекомбинантный ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Использование двойного промотора 35S увеличило синтез антигена до 0.05% от суммарного растворимого белка. Получены также трансгенные растения картофеля, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем этого же промотора и промотора гена пататина клубней картофеля. Содержание HBs-антигена в клубнях картофеля достигало более 1 мкг/г массы клубня и было максимальным в растениях, экспрессирующих ген НВsАg под контролем двойного промотора CaMV 35SS. Проведена очистка и аналитическая гельфильтрация HBs-антигена из трансгенных растений, показавшая, что продукт экспрессии гена HBsAg образует мультимерные формы и в агрегации HBs-мономеров в иммуногенные мультимеры участвует не менее 70−80 молекул мономеров.

К настоящему времени имеются публикации по синтезу более 50 различных человеческих и животных антигенов в трансгенных растениях. Некоторые данные по этим растениям приведены в табл.3.

Таблица 3. Субъединичные вакцины, синтезируемые трансгенными растениями

(РБ — растворимый белок; СВ — сырой вес) В настоящее время интенсивно разрабатывается концепция «съедобных вакцин» на основе трансгенных растений, чьи плоды, листья и семена годятся в пищу. В случае успеха отпадает потребность в дорогостоящей очистке антигенов, которая необходима при создании вакцин для парентерального введения. Различные субъединичные вакцины экспрессированы в растениях и для многих из них показана иммуногенность при оральном введении людям и животным. Антигены, экспрессируемые в растениях, защищены растительными клеточными стенками от протеолиза при прохождении пищеварительного тракта и могут быть легко доставлены к клеткам слизистой оболочки кишечника, ответственным за мукозную систему иммунитета.

Две вакцины, синтезируемые в растениях картофеля уже прошли стадию клинических испытаний — это субъединица В термолабильного токсина (LT-B) энтеротоксигенного штамма E. coli (ETEC) и капсидный белок вируса Норфолк (NVCP). Эти антигены, выделенные из двух важных кишечных патогенов, могут быть идеальными съедобными вакцинами, поскольку оба имеют мультимерную структуру и устойчивы к перевариванию в кишечнике человека. Каждый из этих белков накапливался в больших количествах в клубнях картофеля и правильно собирался в олигомеры. Клинические испытания рекомбинантной вакцины LT-B показали, что поедание добровольцами сырых клубней картофеля, содержащих 0.3−10 мг LT-B, приводило к образованию мукозных и системных антител с высокими титрами. Значительный прогресс достигнут в использовании семян кукурузы для экспрессии съедобных вакцин. Субъединица LT-B экспрессировалась в семенах на уровне до 0.1% от сырого веса и обладала иммуногенными и защитными свойствами при поедании мышами. Ассоциация с крахмалом облегчает очистку антигена из зерен кукурузы, и кроме того обеспечивает термостабильность антигена и его устойчивость к протеолитической деградации при попадании в желудочно-кишечный тракт. Последнее обстоятельство важно при оральном введении антигена. На основе семян кукурузы создана вакцина, защищающая свиней от вирусного гастроэнтерита. Уровень экспрессии белка для создания съедобных вакцин должен быть достаточно высок. Этого можно достичь, например, при трансформации пластид, что дает до 25% целевого белка от общего растворимого белка клеток.

Иногда антигены сшивают с другими белками для облегчения детекции, например, с геном в-глюкуронидазы (GUS). По GUS-активности мохно легко определить уровень экспрессии антигенов в трансформантах. В обоих случаях белки сохраняли свою иммуногенность.

Субъединицу холерного токсина (CTB) эффективно используют для сшивки с другими белками-антигенами и последующей трансформации растений. Например, была описана экспрессия эпитопа HVR1 вируса гепатита С, сшитого с CTB, на основе вируса табачной мозаики. Растения табака, инокулированные этим вирусом, синтезировали функциональный белок CTB-HVR1, реагирующий с моноклональными антителами против HVR1, а также с сывороткой крови людей, инфицированных вирусом гепатита С. Другие исследователи сшили эпитоп ротавирусного энтеротоксина NSP4 с CTB и трансформировали полученной конструкцией картофель. Эта работа была продолжена созданием мультикомпонентной вакцины, состоявшей из белка NSP4-CTB и фимбриального антигена из энтеротоксичного штамма E. coli, слитого с субъединицей холерного токсина CTA2. Два этих белка собирались в структуры, подобные целому холерному токсину, и сохраняли способность связываться с рецепторами кишечника. У орально иммунизированных мышей вырабатывались антитела против патогенных антигенов, а также уменьшились симптомы диареи после заражения ротавирусом.