Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов

Актуальность проблемы.

На современном этапе для успешного выполнения приоритетных национальных проектов и правительственных программ в сфере здравоохранения, которые традиционно ориентированы на предупреждение распространения и ликвидацию актуальных и социально-значимых инфекционных заболеваний, важное значение приобретает совершенствование методов их лабораторной диагностики.

Актуальной задачей является разработка и внедрение в практическую медицину и систему эпиднадзора технологий, отвечающих следующим требованиям: высокая чувствительность, прецизионная специфичность, информативность, объективность, экспрессность, высокая производительность, универсальность (выявление различных возбудителей в любом типе клинического материала), биобезопасность для исполнителей, возможность автоматизации процесса. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на выявлении уникальных фрагментов геномов инфекционных агентов, соответствует данным требованиям, существенно расширяет возможности диагностики, позволяет обнаруживать некультивируемые и труднокультивируемые формы микроорганизмов [16,89,161,278,281]. Универсальность метода ДНК-диагностики и автоматизация практически всех этапов анализа позволяют осуществлять одновременное выявление нескольких инфекционных агентов, способных вызывать определенный тип патологии, проводить скрининговые обследования различных контингентов населения в профилактических целях.

Несмотря на обилие публикаций, посвященных методу ПЦР и его использованию в диагностике отдельных нозологических форм, работы содержащие материалы комплексных ПЦР исследований инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей, достаточно редки. Данные о частоте выявления возбудителей зачастую противоречивы, а проблемы ПЦР обследования обширных контингентов одновременно на несколько различных инфекционных агентов и определения роли и места молекулярно-биологических методов в общей системе лабораторной диагностики инфекционных заболеваний освещены недостаточно.

Широко распространенные социально значимые инфекционные заболевания, такие как острые кишечные и негонококковые урогенитальные инфекции, хеликобактериозы и вирусные гепатиты приносят значительный вред здоровью жителей России и экономический ущерб [34,35,65,90]. Кроме этого, хеликобактериозы и гепатиты существенно снижают продолжительность жизни, а негонококковые урогенитальные инфекции отрицательно влияют на репродуктивную функцию. Активизация и оптимизация внедрения современных технологий в диагностику этих инфекций способствует своевременному назначению этиотропной терапии, уменьшению продолжительности лечения и количества осложнений.

В связи с вышеизложенным, особую актуальность приобретают вопросы выбора наиболее значимых направлений и объектов исследования, создания и подбора тест-систем для ПЦР-диагностики, их апробации и адаптации к медицинской практике, разработки оптимальных алгоритмов применения как отдельных диагностикумов, так и сочетаний нескольких тест-систем для улучшения технологичности, повышения эффективности и уменьшения стоимости исследований.

Цель работы — оптимизировать и адаптировать собственные (экспериментальные) и коммерческие ПЦР тест-системы к решению задач диагностики острых кишечных инфекций, хеликобактерной инфекции, негонококковых урогенитальных инфекций, вирусных гепатитовразработать стратегию и тактику использования метода ПЦР для наиболее рационального и эффективного выявления возбудителей этих заболеваний.

Задачи исследования: 1. Провести оптимизацию методов ПЦР-диагностики для выявления актуальных патогенов — возбудителей ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ.

2. Разработать алгоритмы диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ с использованием оптимизированных нами методов на основе отечественных ПЦР тест-систем.

3. Апробировать и адаптировать к практической диагностике систему молекулярно-биологических методов выявления актуальных бактериальных возбудителей ОКИ — бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia, Campylobacter и генов, ответственных за патогенность энтеробактерий.

4. Оценить возможности метода ПЦР при изучении распространения бактерий Н. pylori у больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии, а также при внутривидовом типировании и выявлении генов факторов патогенности Н pylori.

5. Разработать экономичный вариант метода ПЦР для оценки вирусной нагрузки у больных вирусными гепатитами В и С, изучить особенности репликации вирусов гепатитов В, С, D, G при монои смешанном инфицировании, определить эффективность и значимость вертикального пути передачи вирусов гепатитов В и С в Нижегородском регионе.

6. С помощью комплексного ПЦР исследования получить новые знания о распространении и особенностях циркуляции наиболее значимых возбудителей НУГИ (U. urealyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex MI) у взрослых и детей, и о возможной связи отдельных представителей НУГИ с формированием различных форм патологии.

7. На основе полученных новых знаний определить роль и место молекулярно-биологических методов в лабораторной диагностике НУГИ, ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов, провести апробацию разработанных алгоритмов их диагностики в практической медицине.

Научная новизна работы.

Впервые в Нижегородском регионе проведено освоение и внедрение в практическое здравоохранение и систему эпиднадзора метода ПЦР. На основе многолетних системных исследований группы возбудителей актуальных инфекционных заболеваний (ОКИ, хеликобактерная инфекция, НУГИ, вирусные гепатиты) получены новые данные о распространенности и особенностях циркуляции инфекционных агентов среди населения.

Разработаны оптимальные алгоритмы применения амплификационных методов для решения задач диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов, НУГИ. Определены роль и место данных технологий в общей системе диагностических исследований для наиболее рациональной и эффективной реализации последних.

Впервые разработаны экспериментальные лабораторные тест-системы для выявления бактерий рода Shigella, и генов токсинов энтеробактерий (термолабильного — LTтермостабильного — STшигатоксина первого типаVT1).

Впервые установлено, что использование ПЦР при первичном обследовании больных с подозрением на ОКИ позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella по сравнению с классическим микробиологическим исследованием.

Впервые в РФ проведен многолетний мониторинг (18 лет) клинических изолятов энтеробактерий. Установлены особенности циркуляции в Нижнем Новгороде штаммов энтеробактерий, содержащих гены факторов патогенности. Наиболее распространены варианты, имеющие оперон инвазивности (Shigella ssp., E. coli). Показано, что циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий не характерна для Нижегородского региона. Выявлены единичные случаи обнаружения гена шигаподобного токсина первого типа у представителей Shigella ssp., Е. coli. Впервые выявлен факт наличия у Е. coli 0127 генетических структур, сходных по нуклеотидной последовательности с геном адгезии холерного вибриона.

Показана широкая распространенность Н. pylori среди больных разных возрастов с различными типами гастродуоденальной патологии в Нижнем Новгороде (частота выявления 58,9±2,9% у детей и 82,9±1,8% у взрослых). Выявлена циркуляция токсигенных вариантов Н. pylori в бактериальной популяции. Варианты cagA + составили 76,4±3,8%, а варианты vakA + -66,0±6,7% в популяции соответственно.

Определена активность репликации вирусов у больных хроническими гепатитами В и С разных возрастов при моноинфицировании, частота выявления вирусных нуклеиновых кислот составляла 48±2,4 — 50± 1,9%. Установлено, что эффективность репликации вирусов гепатитов В, С, D, G снижается при смешанном инфицировании (вирусные нуклеиновые кислоты выявлялись суммарно в 25,5±1,4 — 37,4±2,4% случаев в зависимости от состава ассоциации).

Определена вероятность вертикальной передачи вирусов гепатитов В и С в Нижнем Новгороде — 12,8±2,8% и 10,2±0,86% соответственно.

Впервые изучена циркуляция наиболее распространенных в Европе генотипов вируса гепатита С (la, lb, 2, За) на территории г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области. Показано доминирование генотипов lb и За, частота их выявления несколько варьировала по годам от 48,4±3,6 до 54,3±3,4% и от 46,1±4,2 до 51,6±3,6% соответственно.

Исследованы особенности распространенности наиболее значимых возбудителей НУГИ — U. urealyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II. Они обнаружены у 68,0±1,3% женщин и 40,0±3,8% мужчин. Показано многолетнее стабильное сохранение распределения возбудителей по частоте выявления. В течение всего периода наблюдения чаще других обнаруживались U. urealyticum (54,2±1,4% у женщин, 29,7±3,6% у мужчин) и М. hominis (25,8±1,3% у женщин, 14,5±2,7% у мужчин). Остальные виды инфекционных агентов определялись существенно реже.

На основе анализа частоты выявления возбудителей НУГИ в разных возрастных группах установлены этапы колонизации макроорганизма уреаплазмами, микоплазмами и вирусами группы гепеса. Показана связь возбудителей НУГИ с нарушениями репродуктивной функции и воспалительными процессами в различных отделах урогенитального тракта.

На клонированные фрагменты генов термолабильного токсина (ЬТ) фактора адгезии (СРА1), которые впервые использованы в качестве ДНК зондов для выявления соответствующих генов и конструирования лабораторных вариантов ПЦР диагностикумов получены патенты Российской Федерации № 2 031 948; № 2 049 822 соответственно. Патент получен и на алгоритм использования метода ПЦР для выявления возбудителей НУГИ у детей первых лет жизни — № 2 271 003.

Теоретическое значение работы.

Работа является одной из первых в Российской Федерации, в которой рассматриваются проблемы комплексного подхода к ПЦР диагностике инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей.

Предложена система адаптации отечественных ПЦР тест-систем к решению задач практической медицины и эпиднадзора, а также разработки алгоритмов рационального использования метода ПЦР в диагностике актуальных инфекционных заболеваний.

Полученные новые данные о распространенности труднокультивируемых форм возбудителей расширяют представления об эпидемиологических особенностях ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитах.

Предложенные алгоритмы диагностики НУГИ, ОКИ, парентеральных вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции с применением метода ПЦР могут быть использованы в дальнейшем при разработке новых диагностических стандартов. Перечни ведущих инфекционных агентов, предложенные для одновременного выявления при комплексной ПЦРдиагностике НУГИ и ОКИ могут служить основой комплектации мультиплексных ПЦР-тест-систем с детекцией продуктов амплификации методом биочипов.

Практическое значение работы.

Разработанные ДНК-зонды и созданные на их основе лабораторные варианты ПЦР систем впервые в Российской Федерации позволили проводить скрининг штаммов энтеробактерий на наличие генов факторов патогенности (термолабильного — LTтермостабильного — STшигатоксина первого типа — VT1) и детекцию бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Escherichia в клиническом материале.

На основе авторских тест-систем, а также адаптации и модификации имеющихся отечественных ПЦР-диагностикумов, отработки схем их индивидуального и комплексного применения предложены алгоритмы использования метода ПЦР в диагностике бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитов.

Внедрение в практику разработанных алгоритмов позволили усовершенствовать этиологическую диагностику и систему эпиднадзора и мониторинга за возбудителями актуальных социально-значимых инфекционных заболеваний.

Оптимизация использования тест-систем, проведение одномоментного выявления наиболее распространенных и этиологически значимых инфекционных агентов, исследование пула потенциально инфицированных субстратов позволили в 1,5−2,5 раза повысить эффективность выявления возбудителей, уменьшить продолжительность и на 30−50% снизить стоимость исследований.

Предложенные нами принципы применения ПЦР в диагностике бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитов используются диагностическими лабораториями медицинских учреждений Н.Новгорода.

Внедрение в практику.

Получены патенты Российской Федерации: -№ 2 031 948 «Фрагмент ДНК LTf, предназначенный для выявления гена термолабильного энтеротоксина энтеробактерий» (27.03.1995 г.) — -№ 2 049 822 «Фрагмент ДНК CFv, используемый для выявления энтеробактерий, обладающих фактором колонизации CFA I» (10.12.1995 г.) — -№ 2 271 003 «Способ выявления наиболее значимых возбудителей негонококковых урогеннитальных инфекций (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex T/IT) у детей с использованием метода ПЦР» (27.02.2006 г.).

Разработана медицинская технология: ^"Комплексное ПЦР-обследование пациентов с инфекционно-аллергическими заболеваниями органов дыхания", 2008 г. Разрешение № 209/084 от 21.04.09 Минсоцздрава РФ.

Материалы работы послужили основой для следующих документов: -пособие для врачей «Полимеразная цепная реакция для выявления пилорического хеликобактера», 2000 г. утверждено председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН Покровским В. И., протокол № 5 от 28.11.2000 г;

— методические рекомендации «Метод ПЦР-диагностики в обследовании новорожденных и детей первого года жизни», 2000 г. утверждены Главным государственным санитарным врачом Нижегородской области Петровым Е. Ю.;

— пособие для врачей «Принципы отбора, хранения и транспортировки биологических субстратов для проведения ПЦР-диагностики бактериальных и вирусных инфекций», 2002 г. утверждено председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН Покровским В. П., протокол № 4 от 25.12.2001 г.;

— пособие для врачей «Комплексное ПЦР-обследование на наличие возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций женщин с гинекологической патологией и отягощенным акушерско-гинеколгическим анамнезом», 2005 г., утверждено Председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН Покровским В. И., протокол № 5 от 02.12.2005 г.

И были использованы при составлении: -книги для практического врача «Диагностика и биокоррекция нарушений антиинфекционного гомеостаза в системе «мать-дитя», г. Нижний Новгород, 2004 г.;

— аналитического обзора «Молекулярно-биологические методы в микробиологической диагностике», 1998 г.;

— аналитического обзора «Современные методы диагностики ИППП», 2007 г. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Для успешного внедрения и использования метода ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний необходимо проведение стадий адаптации, оптимизации диагностикумов, определение наиболее важных и существенных аспектов, требующих привлечения ПЦР.

2. ПЦР может успешно использоваться для первичной скрининговой детекции бактериальных возбудителей ОКИ в лабораторной диагностике и санитарно-эпидемиологическом надзоре. Эффективность этиологической диагностики возрастает при одновременном выявлении ведущих инфекционных агентов: бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Y. enterocolitica.

3. Использование отечественных ПЦР тест-систем позволяет проводить не только первичную индикацию Н. pylori, осуществлять оценку количества инфекционного агента и контролировать эффективность антихеликобактерной терапии, но и получить ряд существенных характеристик микроорганизма, таких как наличие генов факторов патогенности cagA и vakA, устойчивости к антибиотикам — макролидам без культивирования микроорганизма.

4. Наиболее значимыми направлениями использования ПЦР в решении проблемы парентеральных вирусных гепатитов является определение результативности противовирусной терапии, интенсивности репликации вирусов при монои смешанном инфицировании, совершенствование профилактики вертикального пути передачи вирусов. Для этого успешно может быть использован разработанный нами экономичный полу количественный вариант ПЦР.

5. ПЦР является основным методом детекции возбудителей НУГИ, позволяющим эффективно выявлять любой из микроорганизмов этой группы (вирусы, бактерии). Наиболее эффективно и экономически оправдано одновременное выявление у пациента пяти наиболее значимых и распространенных возбудителей: U. urealyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II в пуле субстратов (смеси соскобов слизистых уретры, вагины, цервикального канала у женщинсмеси соскоба слизистой уретры и осадка мочи у мужчинсмеси слюны, мочи, слезного отделяемого у детей), в которых наиболее вероятно их присутствие.

Апробация работы.

Диссертация апробирована на Ученом Совете ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28.02.2008 г., протокол № 2.

Результаты работы доложены и обсуждены на II Съезде Биохимического общества РАН, г. Москва 1997 г.- на I Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 1999 г.- на II Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 2000 г.- на III Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 2001 г.- на Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины», г. Москва, 2002 г.- на Всероссиской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», г. Москва, 2002 г.- на Всероссиской научнопрактической конференции «Медицинская микробиология — XXI век», г. Саратов 2004 г.- на Всероссиской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», г. Москва, 2004 г.- на Научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Н. Новгород, 2004 г.- на VII Российском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней», г. Н. Новгород, 2006 г.- на Научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И. Н. Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Н. Новгород, 2006 г.- на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2007», г. Москва, 2007 г.- на Международном симпозиуме «Папилломавирусная инфекция и злокачественные образования. Интегрированная система надзора и профилактики», г. С-Петербург, 2009 г.- на X Международном медицинском форуме «Профилактика заболеванийоснова качества медицинской помощи и благополучия человека», г. Н. Новгород, 2009 г.

Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории молекулярно-генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями ФГУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной» Роспотребнадзора. Исследования осуществлялись в рамках Федеральной Программы «Здоровье населения России», отраслевой научно-исследовательской программы МЗ РФ № 034 «Эпидемиология и микробиология» по договору «Новые технологии в профилактике, диагностике и лечении инфекционных заболеваний и использование их в эпиднадзоре» и ведомственной (отраслевой) целевой программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006;2010 г. г» по комплексной теме «Разработка комплексных мероприятий по диагностике, профилактике, лечению и эпиднадзору за актуальными инфекциями».

В настоящее время предложенные нами алгоритмы ПНР диагностики ОКИ, хеликобактериоза, вирусных гепатитов, НУГИ используются практическими лабораториями медицинских учреждений Нижнего Новгорода, применяющими метод ПЦР, что увеличивает точность индикации патогенов и приносит существенный экономический эффект за счет оптимизации расхода диагностикумов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 69 печатных работ, среди них — 10 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ- 9 — в других журналах- 42 —в материалах конференций, съездов, форумов, 3 — патенты- 5 -методические материалы.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 94 отечественных и 304 зарубежных источника. Работа изложена на 310 страницах, компьютерного текста. Включает 46 таблиц, 38 рисунков и 2 приложения. Личный вклад.

260 Выводы.

1. Научно обоснованы и разработаны оптимальные алгоритмы использования метода ПЦР для диагностики бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов и НУГИ на основе метода ПЦР. Показано, что диагностическая и экономическая эффективность выявления возбудителей повышается за счет одновременной ПЦР-детекции наиболее значимых патогенов в смеси информативных субстратов.

2. Разработка комплекса собственных тестов и использование экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем позволили провести мониторинг клинических изолятов семейства Enterobacteriacea на наличие генов токсигенности, инвазивности за длительный период времени и определить особенности циркуляции таких штаммов. Использование скрининговых ПЦР-тестов для первичного обследования больных с подозрением на ОКИ более чем в 2 раза увеличило эффективность выявления основных возбудителей бактериальных ОКИ — бактерий родов Shigella и Salmonella по сравнению с классическим микробиологическим методом.

3. Выявлена высокая эффективность колонизации макроорганизма Н. pylori, начинающаяся с первых лет жизниустановлены высокие показатели частоты выявления хеликобактера как у детей, так и у взрослых с различными формами гастродуоденальной патологии. Показано широкое распространение генов токсигенности cagA и vakA среди клинических изолятов Н. pylori. Предложен экономичный полуколичественный вариант ПЦР-детекции Н. pylori, позволяющий контролировать эффективность антихеликобактерной терапии и прогнозировать отдаленные результаты лечения.

4. Установлено, что на территории Нижнего Новгорода и Нижегородской области, на протяжении 6 лет (2000 — 2006 гг.) доминируют генотипы ВГС lb и За, имеется тенденция к увеличению количества случаев инфицирования пациентов ВГС двух генотипов. Установлена высокая частота (10%) передачи ВГС внутриутробно и при родах. Показано, что возбудители вирусных гепатитов менее активно реплицируются при смешанном инфицировании (ВГВ+ВГСВГС+ВГОВГВ+ВГ0- ВГВ+BrC+BrG), по сравнению с моноинфекцией. Выраженного доминирования одного из вирусов над другим при микстинфекциях не установлено.

5. Показано широкое распространение возбудителей НУГИ (40−68%) среди взрослого населения как здоровых, так и больных с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта. Характерно широкое распространение ассоциаций этих микроорганизмов. За 12-ти летний период наблюдений распространенность инфекционных агентов сохранялась на высоком уровне, неизменными оставались средние показатели частоты выявления определенных видов микрооргнизмов по годам и сезонам.

6. Установлены возрастные этапы колонизации макроорганизма возбудителями НУГИ: для вирусов группы герпеса характерно инфицирование макроорганизма в первые годы жизни воздушно-капельным и контактно-бытовым путями передачичастота выявления U. urealyticum резко возрастает в период полового созревания с преимущественным половым путем передачи инфекционного агента, для М. hominis показаны два этапа колонизации: первый происходит внутриутробно и/или в процессе родов, второй этап — в период полового созревания преимущественно половым путем.

7. Высокая частота выявления U. urealyticum и М. hominis у здоровых людей свидетельствует о том, что попадание этих бактерий в организм человека, как правило, не вызывает развитие заболевания, а приводит к формированию компонента общего микробиоценоза человека — микробиоценоза мембран.

Заключение

.

Совершенствование методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний всегда являлось одним из важнейших направлений медицинской микробиологии. В настоящее время актуальной задачей является разработка и внедрение в практические исследования технологий, с высокой чувствительностью, специфичностью, производительностью. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на выявлении уникальных фрагментов геномов возбудителей, соответствует этим требованиям и существенно расширяет возможности диагностики. Универсальность метода ПЦР и автоматизация основных этапов анализа позволяют осуществлять одновременное выявление нескольких инфекционных агентов, способных вызывать определенные типы патологии, проводить скрининговые обследования различных контингентов населения в профилактических целях. В то же время метод сложен в исполнении требует значительных материальных затрат. В связи с этим встают вопросы оптимизации метода: выбора наиболее значимых объектов исследованиясоздания и адаптации ПЦР тест-систем к решению проблем практической медициныразработки оптимальных алгоритмов применения как отдельных диагностикумов, так и сочетаний нескольких тест-систем для повышения эффективности и уменьшения стоимости исследований.

В настоящей работе мы стремились системно подойти к применению ПЦР для решения практических задач диагностики социально значимых бактериальных и вирусных инфекций, позиционировать молекулярно-биологические технологии в системе диагностических исследований для наиболее рациональной и эффективной их реализации.

Для достижения поставленной цели мы на модели бактериальных ОКИ, НУГИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов определяли существенные аспекты и проблемы в их изучении, для решения которых необходимо применения ПЦР. Разрабатывали оптимальные алгоритмы использования метода ПЦР в диагностике этих четырех актуальных инфекционных заболеваний, позволяющие получить максимальную информацию при минимальных материальных затратах.

Бактериальные возбудители ОКИ — бактерии родов Shigella и Salmonella представляют собой классические объекты медицинской микробиологии. Они давно и успешно выявляются бактериологическим методом. Выделение и культивирование бактериальных штаммов, являются «золотым стандартом» выявления шигелл и сальмонелл. В своих исследованиях по изучению возможностей ПЦР при детекции этих микроорганизмов мы предполагали получить положительный эффект за счет уменьшения продолжительности анализа.

Несмотря на несовершенство первых ПЦР тест систем для детекции бактерий родов Shigella и Salmonella их использование позволило сократить время исследования с 5-ти до 3 дней и повысило эффективность выявления возбудителей в 2 раза по сравнению с бактериологическим методом. В диагностикумах второго поколения («Amply-Inv» и «Ампли-сенс — Salmonella species 250») была проведена существенная модернизация в комплектации, повышено качество реактивов, что увеличило надежность и технологичность систем. Повышение чувствительности позволило получать результат без подращивания исследуемых проб. Эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella тест-системами второго поколения была в 2,2−2,6 раза выше, чем бактериологическим методом, а продолжительность исследования сократилась до одного рабочего дня. Высокая специфичность и чувствительность в сочетании с надежностью и простотой позволяют рекомендовать эти диагностикумы для практических исследований.

Расширение спектра выявляемых инфекционных агентов за счет использования тест-системы на бактерий рода Campylobacter и Yersinia enterocolitica позволило проводить комплексное ПЦР-исследование одновременно на 4 основных возбудителя бактериальных ОКИ. В результате этого эффективность этиологической диагностики ОКИ увеличилась при обследовании детей на 21,6%, взрослых — на 38,6%. Себестоимость комплексного ГГЦР исследования на 4 инфекционных агента существенно ниже себестоимости бактериологического исследования на эти возбудители. Все четыре ГГЦР тест-системы являются диагностикумами второго поколения и могут успешно использоваться практическими лабораториями.

Продемонстрированное в настоящем исследовании столь значительное преимущество ПЦР детекции бактерий родов Salmonella, Shigella над бактериологическим анализом (эффективность выявления выше в 2−3 раза), оказалось достаточно неожиданным. На наш взгляд, имеется несколько причин, определивших большую разницу в эффективности методов.

Более высокую чувствительность метода ПЦР можно объяснить ее способностью выявлять погибшие клетки, а также «некультивируемые формы» бактерий. Возможность пребывания грамотрицательных бактерий в «некультивируемом состоянии» показана относительно недавно [23, 71]. У «некультивируемых форм» бактерий резко снижена метаболическая активность, они не растут на питательных средах. Причинами перехода к некультивируемому состоянию являются неблагоприятные условия, в частности, действие антибиотиков. При исследовании клинического материала нередко часть проб отбиралась после начала антибиотикотерапии, которая могла вызвать переход бактерий в «некультивируемое состояние». В таких случаях метод ГГЦР имел заведомое преимущество перед бактериологическим исследованием. ПЦР является в настоящее время единственным надежным методом детекции подобных форм микроорганизмов. Обнаружение «некультивируемых форм» бактерий имеет важное практическое значение, так как при попадании в организм они восстанавливают вегетативную форму и вызывают заболевание.

Имеется ряд субъективных причин, влияющих на эффективность микробиологических исследований. В частности, существенное уменьшение финансирования диагностических исследований привело к снижению количества и качества анализов в практических лабораториях. S i i.

Кроме проблем ускорения исследования и повышения этиологической расшифровки ОКИ, существенным аспектом в диагностике бактериальных ОКИ является выявление штаммов имеющих факторы патогенности (токсины, факторы адгезии и инвазии). Классические методы выявления факторов патогенности крайне сложны и не позволяют исследовать значительное количество штаммов. Реальным вариантом решения задачи оказалось применение ДНК-зондов и ПЦР, выявляющих гены факторов патогенности. Этими методами нами был проведен многолетний мониторинг (1985;2005 гг.) циркуляции штаммов энтеробактерий, обладающих генами наиболее практически значимых факторов патогенности. Несмотря на существенную разницу диагностических возможностей зондов и различных вариантов тест-систем, получены непротиворечивые результаты. Для Нижегородского региона не характерна циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий, они регистрируются редко и быстро элиминируются. За весь период наблюдения отмечены два случая выявления штаммов, содержащих ген шигаподобного токсина 1 типа (1994 и 2003 гг.). Варианты с генами термолабильного, термостабильного, шигаподобного 2 типов не зарегистрированы. Наиболее распространенными оказались генетические детерминанты оперона инвазивности, что ожидаемо, так как они являются обязательным атрибутом бактерий рода Shigella. Гены факторов патогенности выявлялись только у шигелл и эшерихий. У представителей других изученных нами родов Enterobacteriaceae (Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Hafnia) они не обнаружены. Полученные результаты свидетельствуют, об отсутствии эффективного обмена генами факторов патогенности между энтеробактериями, хотя вероятность таких событий имеется [83]. В широких скрининговых исследованиях с целью мониторинга токсигенных штаммов нет необходимости. Целесообразно исследование на наличие генов факторов патогенности клинических изолятов этероробактерий, выделенных от больных с тяжелым течением заболевания.

Высокая степень гомологии геномных ДНК делает невозможными определение видовой принадлежности шигелл и серовариантов сальмонелл с использованием ПЦР. Несмотря на этот недостаток ПЦР экспресс-детекция на уровне родов бактерий Shigella, Salmonella, Campylobacter и на уровне вида бактерий Y. enterocolitica позволяет существенно повысить качество диагностики ОКИ. Наиболее целесообразно комплексное ПЦР обследование пациентов с подозрением на ОКИ, заключающееся в одномоментным выявлением всех четырех инфекционных агентов.

Изучение хеликобактерной инфекци и ее возбудителя Н. pylori представляло интерес по следующиму ряду причин. H. pylori открыт относительно недавно (1983 г.) и система диагностики хеликобактериоза в Российской Федерации еще не сложилась. Основные затруднения связаны с тем, что микробиологический метод выявления H. pylori доступен единичным отечественным диагностическим учреждениям. В частности, в Нижнем Новгороде за последние 16 лет, в течение которых проводилось изучение хеликобактера, ни одной из лабораторий не было освоено культивирование этих бактерий. Используемые в практической диагностике методы, основанные на микроскопии, недостаточно специфичны. В связи с этим, мы расценивали метод ПЦР как один из наиболее перспективных вариантов прямой, специфической детекции H.pylori. Кроме этого, при невозможности культивирования хеликобактера, нами ставилась задача оценить возможности ПЦР как способа изучения штаммовых особенностей этих микроорганизмов.

Метод ПЦР с высокой эффективностью выявлял H. pylori в биоптатах слизистой и желудочном соке. Желудочный сок, как субстрат с менее инвазивным получением и как более интегративный материал, рекомендован нами для исследования при детекции H.pylori. ПЦР в 2,5 раза эффективнее выявляет H. pylori, чем метод световой микроскопии отпечатков биоптатов. Наиболее близки к результатам ПЦР данные, получаемые микроскопией пристеночной слизи (браш-биопсия), но и этот вариант, как показано нами, уступает ПЦР в чувствительности.

Метод ПЦР позволил дать более объективную оценку инфицированности хеликобактером больных с гастродуоденальной патологией в Нижегородском регионе, она составила 58,9% у детей и 82,9% у взрослых. По нашему мнению высокая частота обнаружения H. pylori среди населения г. Нижнего Новгорода во многом обеспечивается за счет раннего инфицирования детей.

Для контроля эффективности противохеликобактерной терапии через 1 -2 недели после окончания курса лечения нами разработан и апробирован полуколичественный вариант ПЦР-детекции H.pylori. Анализ отдаленных последствий проведенной терапии показал, что результаты полуколичественного варианта ПЦР имеют прогностическое значение при оценке предполагаемого эффекта антихеликобактерной терапии.

Метод ПЦР (тест-система «Эритропол» фирма «Литех», г. Москва) дает возможность определить устойчивость Н. pylori к антибиотикам — макролидам. Из 97 образцов, в которых ранее выявлена ДНК Н. pylori устойчивые варианты выявлены в 3 случаях, что свидетельствует о низком уровне резистентности к макролидам штаммов Н. pylori, циркулирующих в Нижнем Новгороде.

Изучена возможность применения экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем для выявления генов патогенности у штаммов хеликобактера. С использованием диагностикума «Диаген-Helicobacter» (фирмы «Лагис», г. Москва) установлена широкая распространенность токсигенных CagA+ штаммов H. pylori (76,4%) — показано, что большая часть заболеваний желудка ассоциирована с токсигенными штаммами Н. pylori (63,4%), а при патологии двенадцатиперстной кишки чаще выявлялись CagA-отрицательные штаммы (82% от всех CagA-отрицательных изолятов);

Кроме этого, с использованием тест-системы «Хеликопол УА» (фирма «Литех», Москва) у 66% ПЦР-изолятов Н.ру1оп выявлен ген вакуолизирующего токсина УасА. Полный аллельный вариант гена установлен только у 55% УасА+ вариантов. Это связано нестабильностью работы тест-системы. Неспецифический синтез затрудняет интерпретацию результатов и использование этого диагностикума в практических исследованиях.

Методом гетеродуплексного анализа изучена возможность использования фрагмента гена CagA для определения генетического разнообразия штаммов Н.ру1оп. Показано, что фрагменты гена CagA у разных ПЦР-изолятов отличались между собой нуклеотидной последовательностью. По результатам гетеродуплексного анализа выявлено два варианта фрагментов. На наш взгляд ген Са§ А является перспективным в качестве одного из возможных маркеров для изучения штаммового разнообразия Н.ру1оп.

Таким образом, за счет оптимизации и адаптации экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем был разработан комплекс методов, дающий возможность проводить прямую, высокочувствительную, специфическую детекцию Н.ру1оп в клиническом материале, проводить оценку концентрации инфекционного агента, осуществлять ранний контроль эффективности противохеликобактерной терапии, определять устойчивость к макролидам, проводить маркирование клинических ПЦР-изолятов Н.ру1оп по наличию у них генов факторов патогенности Са§ А и УасА и по степени гомологии гена Cag А. Этот комплекс методов позволяет повысить качество диагностики хеликобактерной инфекции и в значительной степени компенсировать отсутствие возможности культивирования хеликобактера в практических диагностических лабораториях.

Парентеральные вирусные гепатиты являются одной из важнейших проблем здравоохранения, и их диагностике уделяется пристальное внимание. Основная масса задач по исследованию этих инфекций успешно решается различными иммунологическими методами. При анализе возможностей метода ПЦР в диагностике парентеральных вирусных гепатитов и сопоставлении результатов ПЦР исследований и ИФА тестов на ВГС и ВГВ установлена нецелесообразность использования ПЦР при массовом первичном скрининге. Вместе с тем показано, что применение ПЦР при первичном обследовании пациентов с клиническими признаками гепатита при отсутствии белковых маркеров инфекции позволяет выявлять ВГС в период «серонегативного окна».

По данным литературы [90] основное преимущество метода ПЦР перед другими диагностическими технологиями выявления ВГС и ВГВ состоит в том, он позволяет определить активность репликации НК вирусов, оценить их концентрацию в крови, объективно охарактеризовать стадию развития заболевания и контролировать эффективность противовирусной терапии. В связи с этим, разработка варианта ПЦР для обследования больных гепатитами С и В до начала лечения и последующего контроля терапии представлялись нам одним из существенных аспектов применения ПЦР в диагностике вирусных гепатитов. Для оценки концентрации вирусов был применен метод десятикратных серийных разведений: кДНК для ВГС и ДНК, выделенной из крови (плазмы или сыворотки) — для ВГВ. Такой подход, названный нами полу количественным, оказался достаточно объективным и информативным при оценке эффективности противовирусной терапии.

Предложенный вариант ПЦР значительно дешевле исследований с применением тест-систем, использующих гибридизационно-ферментное выявление продукта амплификации и ПЦР, базирующейся на технологии «Real time». Возможно, современные технологии более точно определяют концентрацию вируса. Однако, полученные с их помощью результаты также относительны, поскольку при определении концентрации амплификация исследуемого образца сопоставляется с результатами амплификации контрольной сыворотки и при этом нет возможности сравнить уровни ингибирования реакции в пробе и контроле.

Одним из важных этапов диагностики ВГС является определение генотипа возбудителя. Эта информация имеет как научное, так и практическое значение, поскольку лечение больных, инфицированных ВГС генотипа 1Ь, отличается от терапии заболеваний, вызванных вирусами других генотипов. Использование мультиплексной системы разработки ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора позволило нам изучить особенности распространения в Нижегородском регчетырех наиболее распространенных в Евразии генотипов ВГС — 1Ь, 1а- 2- За. За период 2001;2006 гг. установлено доминирование вариантов 1Ь и За. Частота их выявления варьировала по годам и составляла 48,4−54,3% и 46,1−51,6%, соответственно. Вирусы генотипа 2 и 1а обнаруживались с невысокой частотой от 0,5 до 3,6%. С 2004 г. наметилась тенденция увеличения количества случаев инфицирования пациентов ассоциациями ВГС двух генотипов. В период 2001;2003 г. г. частота обнаружения ассоциаций не превышала 1,7% и они являлись комбинацией генотипов 1Ь и За. В 2004 г. ассоциации выявлялись в 4,6% случаев и были представлены 2 видами -1ЬЗаи1а1Ь. К 2005 году частота выявления ассоциаций разных генотипов достигла 8% и имелось уже 4 типа ассоциаций: 1Ь За- 1а 1Ь- 1Ь 2- 1а 2. Увеличение количества микст-инфекций ВГС, вероятно, связано с неоднократным инфицированием больных. Высокая частота выявления вирусов генотипа 1Ь и вероятность реинфекции ими больных, ранее заразившихся ВГС других генотипов, свидетельствует не только о необходимости определения генотипа при первичном обследовании, но и о целесообразности повторного определения генотипа в случае активизации репликации вируса на фоне успешного лечения.

Методом ПЦР изучены особенности репликации НК вирусов при различных вариантах инфицирования. При вирусных гепатитах В, С, О (моноинфекции) частота выявления вирусных НК оставляла не менее 48%. При гепатитах смешанной этиологии наблюдалось снижением интенсивности репликации вирусных НК. При микстинфекции ВГС+ВГВ вирусные они выявлялись в 25,5%- при микст-инфекции ВГС+ВГС — 37,0%.

Такое ингибирование репликации НК возможно обусловлено явлением интерференции вирусов в клетке-хозяине. Чаще отмечалось размножение только одного из вирусов ассоциации. Случаи одновременной репликации двух вирусных НК составили максимально 19,0% от числа положительных проб при миксте ВГС+ВГО и минимально — 8,1% от числа положительных проб для пары ВГС+ВГВ. Случаев одновременной репликации НК трех вирусов не выявлено. Доминирования одного из вирусов в ассоциациях из двух или трех компонентов не установлено. Вирусные НК выявлялись, как правило, с близкими частотами. Исключение составила ассоциация ВГВ+ВПЭ. Репликация ДНК ВГВ наблюдалась в 2 раза чаще, чем репликация РНК ВГЭ. Вероятно это объясняется тем, что ВГОсателлит ВГВ, а не самостоятельный вирус. [90]. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости при проведение контроля лечения гепатитов смешанной этиологии выявления НК всех вирусов ассоциации.

Одной из важных проблем парентеральных вирусных гепатитов является профилактика вертикального пути передачи инфекции и ранняя диагностика гепатита у новорожденных и детей первого года жизни. Проведенные нами исследования показали, что несмотря на снижение активности вирусного процесса у беременных эффективность инфицирования детей достаточно высока и составляет 10,0% для ВГС и 12,8% для ВГВ. Этот полученный нами результат в 2 раза превышает аналогичный показатель развитых стран. Обследование больных ВГС беременных женщин (104 человека) на наличие у них вирусной РНК и проведение лечения РНК позитивных пациенток снизили инфицирование новорожденных до 4,8%. Полученные результаты подтверждают необходимость проведения ПЦР-детекции РНК ВГС у женщин, имеющих белковые маркеры ВГС, в дородовый период, а у детей группы риска по ВГС — в первый месяц жизни.

Одним из возможных источников инфицирования вирусными гепатитами является контаминированная донорская кровь. На основе анализа частоты встречаемости различных вариантов вирусных нагрузок у больных хроническим ВГС за период 1997;2006 гг. нами показана недостаточная эффективность и чувствительность отечественных ПЦР тест-систем на ВГС для проверки пулов донорской крови. Вероятность выявления вируса составляет 60 — 85%. Этот показатель не позволяет рекомендовать данный вариант для практического применения.

В то же время показана высокая экономическая целесообразность ПЦР обследования на вирусные гепатиты постоянных доноров крови группы риска (повышенная активность ферментов печени). При анализе 1746 образцов крови РНК ВГС выявлена в 7,5% случаев, а ДНК ВГВ — в 2,8%. Экономический расчет показал, что стоимость лечения больных в случае минимально возможного инфицирования донорской кровью в 74 — 172 раза превысила бы стоимость данного исследования.

Таким образом, метод ПЦР в системе диагностики вирусных гепатитов наиболее востребован при исследовании больных перед лечением и для проведения контроля его эффективности. Для этой цели, может быть применен разработанный нами экономичный полуколичественный вариант ПЦР и алгоритм его использования. Кроме этого, имеется еще ряд важных проблем, решение которых не возможно без использования методов РНК-ДНК диагностики: выявление мутантных форм ВГВ, детекция ВГС в период серонегативного окна, профилактика вертикального пути передачи гепатитов, изучение гепатитов смешанной этиологии, повышение безопасности службы крови и трансплантации органов.

Наиболее сложным и масштабным этапом нашей работы были исследования НУГИ, поскольку выявление возбудителей этих инфекционных заболеваний, в Нижегородском регионе ранее осуществлялись спорадически и объективной информации о них не было. Нами проведено изучение распространенности и особенностей циркуляции наиболее значимых и важных представителей этой группы: U. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Cytomegalovirus, Heipes simplex I/II. В результате было выявлено широкое распространение этих возбудителей среди взрослого населения — здоровых и бессимптомных носителей. Они обнаружены у 68% женщин и 40% мужчин, обследованных нами.

На протяжении восьмилетнего периода наблюдений сохранялось следующее распределение возбудителей по частоте их выявления: первое место занимали U. urealyticum (у женщин — 54,2%, у мужчин 30,2%) — второеM. hominis (уженщин — 25,8%, у мужчин — 14,5%) третье — Cytomegalovirus (у женщин — 10,8%) C. trachomatis (у мужчин — 6,7%) — четвертое — С. trachomatis (у женщин — 8,4%), Cytomegalovirus (у мужчин — 3,0%) — пятое — Herpes simplex T/II (у женщин — 2,4%, у мужчин — 1,2%).

Выявлена статистически достоверная разница в частоте выявления возбудителей НУГИ (за исключением хламидий) у женщин и мужчин. Инфицированность мужчин оказалась в 1,7 раза ниже. У женщин микоплазмы и уреаплазмы выявлялись в 1,8 раза чаще, чем у мужчингерпес — в 2 разацитомегаловирус — в 3,6 раза.

При общем преобладании моноинфекций, главным образом, ассоциированных с уреаплазмами, выявлено широкое распространение ассоциаций возбудителей НУГИ. Все инфекционные агенты, кроме U. urealyticum, чаще выявлялись в ассоциациях. Никаких выраженных взаимоотношений возбудителей (симбиоз, антагонизм) не обнаружено. Вероятность выявления той или иной ассоциации определялась только частотами обнаружения составляющих ее микроорганизмов. Преобладали варианты из двух возбудителей (77,2% -у женщин, 80,0% -у мужчин) с доминированием ассоциации уреаплазма-микоплазма (45,4% - у женщин и 45,0% - у мужчин). Варианты из 3 микроорганизмов составляли 20,7% ассоциаций у женщин и 20,0% ассоциаций у мужчин. Смешанные инфекции, при которых обнаружены 4 или 5 возбудителей, выявлены только у женщин, их доля среди ассоциаций составила 2,1%.

Показатели частоты выявления возбудителей НУГИ уженщин в динамике за 12 годовой период исследования изменялись следующим образом: с 1998 года 2001 наблюдался рост числа инфицированных до максимума в 2000;2001 годах. В этот период соответствующие показатели увеличились: для U. urealyticum с 43,8% до 56,5%- M. hominis с 19,2% до 31,1%- Cytomegalovirus с 9,3% до 13,8%- C. trachomatis с 7,1% до 9,9%- Herpes simplex I/II с 1,1% до 2,6%. В период 2002;2003 годы отмечалось снижение частоты выявления инфекционных агентов до уровней, близких значениям 1998 г. В 2004;2005 гг. снова наметился рост, но показатели 2001 года не достигнуты. С 2006 по 2009 гг. в основном происходило уменьшение частоты выявления инфекционных агентов. Как увеличение, так и уменьшение частоты обнаружения происходило синхронно для большинства выявляемых возбудителей (рис.27). Зависимости частоты выявления возбудителей НУГИ от сезона года нами не выявлено. Средние показатели числа инфицированных за все зимние, весенние, летние и осенние сезоны по каждому из выявляемых микроорганизмов имели близкие значения.

При обследовании мужчин и женщин с воспалительными процессами в органах мочеполовой системы и женщин с ОАГА нами отмечены более высокие значения частоты выявления U. urealyticum, M. hominis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II — у женщинU. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Herpes simplex I/II — у мужчин. Наиболее ярко это проявляется при воспалительных процессах в наименее глубоких отделах урогенитального тракта: уретрите у мужчин, вагините, кольпите у женщин, а также у женщин с первичным бесплодием.

При изучении распространенности папилломавирусов в Нижегородском регионе ВПЧ с генотипами высокого канцерогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 45 выявлены у 28,1% обследованных, не имевших признаков изменения эпителия слизистых. В группе женщин с дисплазией и/или эрозией эпителия шейки матки онкогенные папилломавирусы выявлялись немного чаще в 32,0% случаев. Использование мультиплексной тест-системы, выявляющей 12 генотипов ВПЧ позволило в 1,5 повысить эффективность выявления папиломавирусов по сравнению с результатами, полученными за счет использования 3 диагностикумов, детектирующих 6 генотипов ВПЧ.

Одной из важных проблем диагностики НУГИ является оценка эффективности проводимой терапии. Нами показано, что ПЦР позволяет проводить объективную оценку эффективности лечения. Наиболее устойчивыми к терапии оказались U. urealyticum, M.hominis. Они чаще других выявлялись при контрольных ПЦР исследованиях -. 40,2% и 23,3%, соответственно. Эта устойчивость, как было определено, связана с широким распространением антибиотикорезистентных форм этих микрорганизмов, в первую очередь, среди U. urealyticum, Поэтому в алгоритм выявления возбудителей НУГИ, базирующийся на комплексной одномоментной ПЦР детекции U. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Cytomegalovirus, Heipes simplex I/II, при выявлении U. urealyticum, M. hominis, вводится этап микробиологического исследования, одной из целей которого является определение антибиотикорезистентности этих бактерий.

Одним из важнейших аспектов НУГИ является их влияние на развитие беременности и плода. Инфекционные агенты из данной группы могут в случае реализации вертикального пути передачи вызывать различные патологические процессы у детей. Сравнение частот выявления возбудителей НУГИ у беременных женщин и новорожденных показало высокую вероятность передачи возбудителей НУГИ от инфицированных матерей новорожденным внутриутробно и во время родов: 44,3% для U. urealyticum- 58,5% для M. hominis- 39,3% для C. trachomatis- 55,6% для Cytomegalovirus- 16,7% для Herpes simplex I/II. Сходные результаты получены при обследовании 60 пар мать-ребенок, у них в 46% случаев выявлены одинаковые инфекционные агенты, преимущественно микоплазмы и цитомегаловирусы.

Анализ распространенности возбудителей НУГИ у детей разных возрастных групп позволил установить этапы колонизации макроорганизма вирусами группы герпеса и бактериями представителями родов Mycoplasma и Ureaplasma.

Цитомегаловирус и вирус герпеса простого обнаруживаются у новорожденных в 5,8% и 0,4% случаев, соответственно, что свидетельствует о том, что вертикальный путь передачи не является ведущим при инфицировании человека этими инфекционными агентами. В дальнейшем частота их выявления резко возрастает. Активная колонизация организма вирусами группы герпеса происходит в первые месяцы и годы жизни за счет других путей передачи (контактно-бытового, воздушно-капельного) и к 2-х летнему возрасту до 65% детей уже инфицированы цитомегаловирусом и до 8% - вирусом герпеса простого. С учетом того, что герпесвирусы могут длительное время пребывать в латентной форме, не размножаясь, показатели истинной инфицированности, по-видимому, еще выше.

От 23 до 31%) новорожденных инфицируются U. urealyticum внутриутробно и в процессе родов. Однако, по-видимому, в большинстве случаев уреаплазмы не вызывают заболеваний и элиминируются из организма. У детей старше года и до 13 лет частота выявления уреаплазм меньше, чем у новорожденных и составляет 4−8%. Большая часть человеческой популяции колонизируется U. urealyticum, начиная с 14-ти летнего возраста в период полового созревания и активной репродукции, в основном, за счет полового пути передачи. Частота выявления U. urealyticum в данный период у здоровых людей и бессимптомных носителей может превышать 50%.

Частота инфицирования детей M. hominis внутриутробно и при родах составляет 12 — 15%. Частота их выявления стабильно поддерживается на этом уровне до 13-ти летнего возраста. Второй этап колонизации макроорганизма так же, как и в случае с U. urealyticum, начинается с 14-ти лет и связан с половым путем передачи. Частота выявления M. hominis у здоровых людей в этот период достигает 25%.

Высокая частота выявления U. urealyticum и М. hominis у здоровых людей свидетельствует о том, что проникновение этих бактерий в организм человека не всегда приводит к развитию заболевания. При инфицировании может происходить формирование своеобразного компонента общего микробиоценоза человека — микробиоценоза мембран клеток слизистых оболочек.

Развитие заболеваний, обусловленных микоплазмами и уреаплазмами, зачастую вызывается не внешним инфицированием, а представляет собой сбой в микробиоценозе, приводящий к нарушению нормального взаимодействия макроорганизма и микроорганизма. По-видимому, это обусловлено нарушениями функционирования иммунной системы. Наряду с инфекционным агентом при воспалительных процессах, ассоциированных с уреаплазмами и микоплазмами, обнаруживаются аутоиммунные процессы. При одновременном обследование 38 больных женщин на возбудители НУГИ и антитела к нативной ДНК, кардиолипину, миоглобину, хорианическому гонадотропному гормону (исследование, совместное с лабораторией иммунохимии Нижегородского НИИЭМ), нами у всех инфицированных уреаплазмами и микоплазмами выявлено повышенное содержание аутоантител к одному или нескольким маркерам. Максимальные концетрации аутоантител и наибольшее разнообразие их сочетаний отмечено для больных с ассоциацией уреаплазма — микоплазма. У пациентов, инфицированных C. trachomatis, аутоиммунные процессы не выявлены. Данные об изменении функционирования иммунной системы при уреаплазмозах и микоплазмозах получены также рядом зарубежных и отечественных исследовательских групп [2, 22, 87, 196, 215, 368].

Из двух представителей семейства Molicuta наиболее потенциально опасными представляются бактерии M.hominis. На основании анализа акушерско-гинекологического анамнеза и результатов ПЦР нами в ряде случаев установлена связь этого инфекционного агента с внутриутробной гибелью плода. На первых этапах изучения НУГИ, когда практические врачи не уделяли должного внимания уреаплазм и микоплазм и не проводили лечения инфицированных ими беременных, M. hominis выявлялись в секционном материале от мертворожденных и умерших новорожденных чаще других возбудителей НУГИ.

Вирусы группы герпеса достаточно редко выявлялись у взрослых. Существенно чаще они обнаруживались у детей первых лет жизни. Они были ассоциированы с самыми различными патологическими процессами и заболеваниями, но достаточно часто ЦМВ и ВПГ1/П выявлялись и у детей без клинических признаков. Вирусы обнаруживались в основном в слюне и моче. В крови они выявлялись в 10 раз реже, чем в этих субстратах. Многие практические врачи склонны видеть опасность только при выявлении герпесвирусов в крови и обращают мало внимания на случаи, когда вирус находится в слюне и моче. Считаем, что нельзя недооценивать выявление цитомегаловируса и герпеса простого в других биологических жидкостях помимо крови. Поскольку репликация данных вирусов в организме человека независимо от субстрата выделения свидетельствует об иммунодефиците.

C.trachomatis, по нашим наблюдениям, соответствовал статусу патогенного микроорганизма. Этот инфекционный агент при попадании в организм взрослых и детей вызывал патологический процесс с определенными клиническими симптомами. Бессимптомное носительство и хронизация процесса выявлялись нами для C. trachomatis редко. При лечении хламидиоза в большинстве случаев наблюдалось выздоровление с эррадикацией возбудителя.

В диагностике НУГИ наиболее эффективно и целесообразно использование комплексного ПЦР обследования больных и контингентов риска, заключающееся в одномоментном выявлении пяти наиболее важных возбудителей (U.urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II) в смеси субстатов, в которых наиболее вероятно присутствие инфекционных агентов. Нами разработаны алгоритмы использования ПЦП при диагностике НУГИ взрослых и детей.

На основании результатов проведенных исследований можно сделать вывод о том, ПЦР может рассматриваться как один из базовых методов в диагностике НУГИ и хеликобактерной инфекции и как метод первичного скрининга для выявления бактериальных возбудителей ОКИ. Метод ПЦР не целесообразен в качестве стартового этапа обследования пациентов с подозрением на парентеральные вирусные гепатиты. По стоимости и информативности препочтительнее тесты на НВБ-антиген для ВГВ и тесты на антитела для ВГС. Но ПЦР — единственным методов, который позволяет выявлять ВГС в период «серонегативного окна», обнаруживать мутантные по НВз-антигену формы ВГВ, регистрировать репликацию вирусных НК, объективно исследовать гепатиты смешанной этиологии, контролировать эффективность противовирусной терапии, проводить раннее выявление ВГВ и ВГС у детей, группы риска, определять генотипы вирусов гепатита.

Большая часть исследований проводились нами в режиме сопровождения лечебного процесса. ПЦР-детекция этиологических агентов позволила своевременно назначать и проводить эффективную антибактериальную и иммуномодулирующую терапию, сократить сроки пребывания больного в стационаре, сроки реабилитации и снизить риск возникновения осложнений. Все разработки непосредственно апробировались и внедрялись в практическую диагностику НУГИ, ОКИ, вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции и способствовали ее совершенствованию.

Наиболее объективные результаты получаются при ПЦР диагностике тех заболеваний, при которых инфекционные агенты выходят в биологические жидкости организма (кровь, мочу, слюну, слезное отделяемое) или локализуются на кожных и слизистых покровах. При диссеминации инфекции и очаговой локализации возбудителя ПЦР диагностика не эффективна.

Повышение эффективности выявления инфекционных агентов, уменьшение продолжительности и себестоимости анализа достигается одновременным анализом пула (смеси) субстратов, в которых вероятно присутствие наиболее значимых для данной патологии возбудителей.

Использование в современных ПЦР тест-системах с электрофоретическим выявлением ампликона внутреннего контрольного образца, антиконтаминационной модификации ампликонов и разработка тест-систем с флюоресцентной детекцией ампликона (технологии PCR-Real time и PCR-End point) значительно снизили вероятность контаминации и получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Но все эти совершенствования затрагивают только стадии ПЦР и детекции продукта амплификации. Как показывает практика, наибольший риск перекрестной контаминации, вызывающей ложноположительные результаты и возможность потери и порчи субстратов, приводящие к ложноотрицательным результатам, связаны со стадиями отбора, хранения и транспортировки материалов. Перекрестная контаминация возможна также и на стадии подготовки материала к ПЦР. Ввести объективный контроль этих стадий сложно, их успех, главным образом, определяет квалификация исполнителя.

Разработанные в ходе выполнения данной работы алгоритмы диагностики НУГИ, ОКИ, парентеральных вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции с применением метода ПЦР могут быть использованы в дальнейшем при подготовке новых диагностических стандартов. Предложенные перечни инфекционных агентов для комплексной диагностики НУГИ и ОКИ могут служить основой для комплектации мультиплексных ПЦР-тест систем с детекцией продуктов амплификации методом биочипов.

Учитывая опыт использования институтом молекулярно-биологических методов, и на основании исследований, проводимых при выполнении данной диссертационной работы на базе Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии в соответствии с приказом № 2 от 03.01.1995 г. Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации был сформирован первый в Волго-Вятском регионе многопрофильный ПЦР диагностический центр (Волго-Вятский региональный научно-практический центр по индикации, идентификации и таксономии микроорганизмов и организации противоэпидемической работы в экстремальных условиях). Основу деятельности центра составили направления нашей работы: выявление возбудителей НУГИ, ОКИ, хеликобактериоза, вирусных гепатитов. При проведении диагностических исследований используется комплексный подход, заключающийся в одновременном выявлении наиболее значимых возбудителей заболеваний. Разработанные алгоритмы диагностики инфекционных заболеваний и модификации технологий непосредственно после апробации внедряются в работу центра.

В настоящее время в Нижегородском регионе наиболее востребованными аспектами в работе центра являются: ч.

— по диагностике НУГИ — обследование семейных пар, планирующих рождение ребенка, взрослых с проблемами репродукции и воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, детей с подозрением на ВУИ, секционного материала от мертворожденных и умерших новорожденных. У данного контингента проводится выявление U. urealyticum, M. hominis, C. trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II, дополнительно проводится исследование на M. genitalium, T. gondii, папилломавирусы высокого канцерогенного риска;

— по диагностике ОКИ — исследование материала от больных с подозрением на ОКИ, анализ продуктов питания и смывов с объектов внешней среды при расследовании случаев вспышечной и спорадической заболеваемости. При этом, как правило, проводится одновременное выявление бактерий родов Salmonella, Shigella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica- -по диагностике хеликобактерной инфекции — обследование больных с гастродуоденальной патологией на наличие H. pylori до и после леченияопределение устойчивости H. pylori к макролидамв диагностике вирусных гепатитов — контроль эффективности противовирусной терапии, раннее выявление инфицирования вирусами гепатитов В и С детей, рожденных больными матерями, контроль постоянных доноров, выявление вирусов гепатитов G и TTV у детей больных лейкозами.

На основании запросов органов практического здравоохранения сформировался ряд новых направлений. Наиболее важные среди них:

— выявление возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания. При этом исследовании проводится детекция как труднокультивируемых форм (M.pneumoniae, С. pneumoniae, C. psittaci), так и традиционных инфекционных агентов (S.pneumoniae, H. influenzae). Эффективность выявления срептококка и хемофилла методом ПЦР в 1,5−2 раза выше, чем бактериологическим методом;

— выявление возбудителей гнойных и серозных менингитов. Проводится комплексное исследование ликвора на бактериальные и вирусные инфекционные агенты: S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, эетеровирусы, герпес простой и цитомегаловирус;

— обследование часто болеющих детей и детей с полилимфоаденопатиями на наличие активной репликации вирусов группы герпеса (цитомегаловирус, герпес простой, вирус Эпштейн-Барр, герпес тип 6).

В 90-е годы основными задачами центра являлись популяризация и внедрение в практику молекулярно биологических методов диагностики, подготовка специалистов и оказание методической помощи при организации ПЦР лабораторий в лечебных учреждениях и учреждениях санэпиднадзора. В настоящее время в условиях, когда работает множество лабораторий, использующих метод ПЦР, на первое место выходит референс функция (объективная оценка качества диагностики), а также проведение наиболее сложных и требующих высокой квалификации исследований при оперативном решении проблем, возникающих при диагностике инфекционных заболеваний в Нижегородском регионе.

Многопрофильность центра позволяет максимально эффективно использовать имеющуюся материальную базу, быстро и гибко реагировать на изменяющуюся ситуацию (осваивать новые объекты и направления). В настоящее время имеется возможность выявления возбудителей более 30 нозологических форм в режиме сопровождения лечебного процесса, а не ретроспективного исследования.

При участии и методической помощи Центра были организованы ПЦР лаборатории в Нижегородском НИИ детской гастроэнтерологии, Нижегородском областном диагностическом центре, Нижегородском областном центре переливания крови, Нижегородском областном кожно-венерологическом диспансере, инфекционной больнице № 2 Нижнего Новгорода, кожно-венерологическом диспансере Сормовского района Нижнего Новгорода и в целом ряде коммерческих медицинских организаций.