Оптимизация лечения детей, больных контагиозным моллюском, на основе изучения клинических и иммунологических показателей (клинико-лабораторное исследование)

Актуальность темы

Контагиозный моллюск — доброкачественное вирусное заболевание, вызываемое ортопоксвирусом, который относится к семейству Poxviridae, подсемейству Chordopoxviridae, роду Molluscipoxvirus. Заболевание характеризуется появлением на коже и слизистых оболочках полушаровидных узелков величиной от булавочной головки до горошины с центральным пупковидным углублением (Скрипкин Ю.К., Мордовцев В. Н., 1999). Это заболевание встречается в основном у детей и имеет тенденцию к частым рецидивам (Smith K.J., Skelton Н., 2002). По данным ГУ ЦНИКВИ заболевание контагиозный моллюск составляет около 10% от общего числа обращающихся за амбулаторной помощью на приёме у детских дерматологов.

В последнее время наблюдается патоморфоз дерматозов, отмечается явная тенденция к увеличению торпидно текущих, резистентных к проводимой терапии кожных болезней (Кубанова А.А., Тихонова Л. И., 2004). Ухудшение экологической обстановки, неправильное питание и другие неблагоприятные факторы могут оказывать влияние на частоту возникновения и характер клинического течения контагиозного моллюска.

Наряду с характерной клинической картиной заболевания, в последнее время наблюдается большое количество атипичных клинических проявлений контагиозного моллюска, особенно у детей, одним из диагностических критериев для подтверждения контагиозного моллюска является обнаружение в содержимом узелков внутриклеточных базофильных включений, так называемых «телец моллюсков» или «телец Гендерсона — Патерсона» при бактериоскопическом исследовании (Скрипкин Ю.К., Мордовцев В. Н., 1999). Однако при длительном течении заболевания, при атипичных клинических проявлениях не всегда удаётся определить внутриклеточные базофильные включения. При визуальной оценке клинической картины также возможны диагностические ошибки. Возможности светового микроскопа не позволяют обнаружить возбудитель.

— 7 В то же время для диагностики вирусных заболеваний широко используются молекулярные методы исследования. Данные литературы свидетельствуют о возможности использования направленной амплификации видоспецифических фрагментов геномной ДНК вируса в полимеразной цепной реакции при диагностике контагиозного моллюска (Гинзбург A. JL, 1996).

Проведение полимеразной цепной реакции обеспечивает высокую специфичность обнаружения вируса контагиозного моллюска в биоматериале от больных детей и позволяет использовать этот метод для дифференциальной диагностики заболевания. До настоящего времени в Российской Федерации не были разработаны методы молекулярной идентификации вируса контагиозного моллюска, также не встречались данные об исследование морфологической структуры вируса контагиозного моллюска.

Прогноз инфекционного заболевания, по мнению многих авторов, зависит от способности иммунной системы элиминировать патоген в результате активации (развития иммунного ответа) иммунокомпетентных клеток (Земсков А.В., Земсков В. М., Караулов А. В., 2005). Результаты изучения основных иммунорегуляторных, цитотоксических, активированных клеток, иммуноглобулинов, цитокинов, особенно обладающих цитотоксическим, противовирусным эффектом и участвующих в клеточных механизмах защиты у больных контагиозным моллюском, помогут выяснить роль иммунной системы в развитии различных клинических проявлений заболевания (распространенные или ограниченные высыпания).

Одним из основных методов лечения детей, больных контагиозным моллюском, является механическое удаление содержимого каждого элемента с его последующей обработкой дезинфицирующими средствами (Скрипкин Ю.К., Мордовцев В. Н., 1999). В последние годы у больных контагиозным моллюском показана эффективность крио — и лазеротерапии, иммуномодуляторов, интерферонов, противовирусных препаратов наружного и системного применения (Zabawski Е.J., 2000). Однако ни один из методов лечения контагиозного моллюска у детей не дает гарантированного результата и очень часто наблюдаются рецидивы заболевания. Таким образом, очевидна необходимость оптимизации ведения больных контагиозным моллюском с внедрением новых диагностических методов, изучением состояния иммунной системы, использованием полученных данных для обоснования и оценки эффективности назначения лечебных мероприятий, что определило цель и задачи исследования.

Цель исследования. Оптимизация лечения детей, больных контагиозным моллюском, с учетом клинических особенностей течения заболевания и иммунологических показателей. Задачи исследования:

1. Изучить факторы риска возникновения и особенности клинического течения контагиозного моллюска у детей в современных условиях.

2. Разработать метод обнаружения вируса контагиозного моллюска с использованием направленной амплификации фрагментов его ДНК в полимеразной цепной реакции.

3. С помощью электронной микроскопии изучить морфологическую структуру вируса контагиозного моллюска.

4. Изучить уровень циркулирующих иммунокомпетентных клеток с различными дифференцировочными антигенами (CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+, CD21 +, CD38+), иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG) и цитокины (интерфероны альфа и гамма, фактор некроза опухолей, интерлейкины 2,6,8) и на основании полученных показателей установить их особенности у детей с различной клинической картиной заболевания.

5. Изучить эффективность применения полусинтетического препарата микробного происхождения (ликопида) в комплексной терапии детей, больных контагиозным моллюском.

Научная новизна.

Впервые установлено, что в современных условиях контагиозный моллюск достоверно чаще возникает у детей в возрасте от 1 до 7 лет, часто болеющих острыми респираторно-вирусными инфекциями (ОРВИ), перенесших гнойно-воспалительные заболевания (отиты, ангины, пиелонефриты), детские инфекции (ветряная оспа, краснуха, скарлатина) и характеризуется распространенными высыпаниями, нередко атипичными, с экзематизацией и частыми рецидивами. У 18,8% детей выявляются клинические проявления других заболеваний вирусного происхождения (вульгарные бородавки, простой герпес).

Впервые обоснована структура видоспецифических праймеров, использование которых при постановке полимеразной цепной реакции обеспечивает высокую специфичность обнаружения вируса контагиозного моллюска в биоматериале больных детей и позволяет использовать этот метод для дифференциальной диагностики заболевания.

Впервые показано, что применение у детей, больных контагиозным моллюском, полимеразной цепной реакции и электронно-микроскопического анализа повышает качество и достоверность диагностики заболевания.

Впервые установлено, что у детей с распространенными высыпаниями контагиозного моллюска и страдающих частыми ОРВИ, другими заболеваниями вирусного и бактериального генеза, наблюдаются как достоверное повышение количества зрелых Тлимфоцитов (СДЗ+) и лимфоцитов, обеспечивающих первую линию защиты (СД8+, СД16+), так и показателей активированного состояния иммунной системы (иммуноглобулины, цитокины) наряду со снижением относительного количества основных иммунорегуляторных клеток (СД4+). У детей с ограниченными высыпаниями имеются сдвиги меньшего количества иммунологических параметров при отсутствии признаков активации клеток иммунной системы.

— 10 В результате применения полусинтетического иммуномодулирующего препарата микробного происхождения глюкозаминилмурамилдипептида ликопида) после удаления высыпаний контагиозного моллюска у детей исчезают рецидивы заболевания, уменьшается частота ОРВИ, которые сопровождаются положительной динамикой лабораторных показателей активности патологического процесса.

Практическая значимость. Предложен лабораторный метод идентификации вируса контагиозного моллюска с помощью полимеразной цепной реакции. Показано, что электронно-микроскопическое исследование позволяет выявить скопления типичных форм вируса в пробах от больных.

Разработаны показания к применению полусинтетического иммуномодулирующего препарата микробного происхождения ликопида, которые заключаются в том, что после удаления высыпаний ликопид назначается по 1 мг 3 раза в день в течение 10 дней детям с распространенными высыпаниями, часто рецидивирующим течением, особенно после перенесенных заболеваний бактериального и вирусного генеза.

Основные положения, выносимые па защиту:

Особенности контагиозного моллюска в современных условиях характеризуются возникновением распространенных, рецидивирующих и атипичных высыпаний, с экзематизацией достоверно чаще у детей в возрасте от 1 до 7 лет, часто болеющих ОРВИ, после перенесения гнойно-воспалительных заболеваний (отиты, ангины, пиелонефриты), детских инфекций (ветряная оспа, краснуха, скарлатина).

Направленная амплификация концевой последовательности фрагмента гена ДНК-зависимой РНК — полимеразы вируса контагиозного моллюска с использованием пары праймеров в полимеразной цепной реакции обеспечивает быстрое видоспецифическое обнаружение возбудителя в биоматериале от детей, больных контагиозным моллюском.

Лабораторная идентификация контагиозного моллюска, основанная на методе полимеразной цепной реакции и электронно-микроскопического анализа, повышает достоверность и качество диагностики.

У детей с распространенными высыпаниями контагиозного моллюска и страдающих частыми ОРВИ и другими заболеваниями вирусного и бактериального генеза имеются достоверные признаки активированного состояния иммунной системы наряду со сниженными показателями Т-клеточного звена иммунной системы.

Рецидивирующее течение контагиозного моллюска с распространенными высыпаниями у детей, страдающих частыми ОРВИ, другими заболеваниями вирусного и бактериального происхождения с измененными иммунологическими показателями явилось основанием для применения полусинтетического иммуномодулирующего препарата микробного происхождения ликопида. Ближайшие и отдаленные результаты лечения с учетом динамики иммунологических показателей свидетельствуют об обоснованности и целесообразности включения ликопида в терапию детей, больных контагиозным моллюском.

Апробация работы. Основные материалы, представленные в диссертации, доложены и получили положительную оценку на заседаниях Ученого Совета Федерального Государственного Учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (2002;2006), на Всероссийской научно-прикладной конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002) — на Всероссийской конференции «Достижения и перспективы развития дерматовенерологии» (Екатеринбург, 2006). Публикации. По материалам исследований опубликованы 4 печатные работы.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах компьютерного текста, состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов, глав собственных исследований (иллюстрированы 13 таблицами, 8 рисунками), заключения, выводов, указателя использованной литературы, включающего 142 источника отечественных и иностранных авторов.

выводы.

1. В результате обследования 80 детей в возрасте от 1 до 14 лет установлено, что у 60 (75%) из них рецидивы контагиозного моллюска возникают после частых ОРВИ, перенесенных гнойно-воспалительных заболеваний (отиты, ангины, пиелонефриты), детских инфекций (ветряная оспа, краснуха, скарлатина). Особенностями течения контагиозного моллюска у детей в современных условиях являются наличие распространенных (от 10 до 50 элементов), нередко с экзематизацией (у 12,5%), атипичных высыпаний с частыми рецидивами, особенно в возрастной группе от 1 до 7 лет.

2. Разработан метод идентификации вируса контагиозного моллюска с использованием направленной амплификации видоспецифических фрагментов геномной ДНК, который подтверждает и повышает надежность диагноза заболевания.

3. С помощью электронной микроскопии изучены морфологические особенности вируса контагиозного моллюска. При этом установлено, что вирус, взятый из биопсийных проб от больных, относится к I подтипу вируса контагиозного моллюска.

4. У детей с распространенными высыпаниями контагиозного моллюска и страдающих частыми ОРВИ и другими заболеваниями вирусного и бактериального генеза наблюдается достоверное (Р<0,01 везде) снижение относительного количества СД4 позитивных клеток и иммунорегуляторного индекса, повышение — СД8±, СД16±, СД38± клеток, уровня иммуноглобулинов (IgA, IgM), интерферона гамма, провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухолей альфа, интерлейкины 6,8), в то время как у детей с ограниченными высыпаниями содержание циркулирующих иммуноглобулинов и цитокинов определяется в пределах показателей лиц контрольной группы (Р>0,05).

— 1095. Использование в терапии детей, больных контагиозным моллюском полусинтетического препарата микробного происхождения глюкозаминилмурамилдипептида (ликопида) после удаления высыпаний достоверно способствует исчезновению рецидивов заболевания {у?=1,5 р<0,01) по сравнению с результатами лечения без применения этого препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В результате обследования 80 детей в возрасте от 1 до 14 лет установлено, что высыпания контагиозного моллюска у них начинались с мелких единичных элементов, но при отсутствии лечения приобретали распространенный характер после очередного обострения ОРВИ (до 5 -6 раз в год) у 31 больного, детских инфекций (ветряная оспа, краснуха, скарлатина) -у 17, после гнойно-воспалительных заболеваний (отиты, гаймориты, ангины, пиелонефриты) -у 12. Таким образом, появление высыпаний у 60 (75±7,7%) из 80 детей было связано с инфекциями.

Распространенными высыпаниями с частыми рецидивами достоверно чаще болели дети в возрасте от 7 до 14 лет по сравнению с детьми до 7 лет (Р<0,05). У 12,5% детей наблюдалась экзематизация высыпаний.

После механического удаления элементов контагиозного моллюска у этих 60 детей, как правило, наблюдались рецидивы заболевания до 5−10 раз за весь период наблюдения.

Кроме того, у 15 детей, кроме высыпаний контагиозного моллюска были вульгарные бородавки (у 12), пузырьковые элементы герпетической инфекции (у 3). У 5 детей не удалось выяснить провоцирующих факторов, вызывающих появление высыпаний контагиозного моллюска. У этих 20 (25±7,4%) детей высыпания носили ограниченный характер, после их удаления рецидивы были реже до 2−4 раз за время наблюдения.

Таким образом, клинический анализ результатов обследования детей, больных контагиозным моллюском позволяет заключить, что 75±7,7% детей страдали частыми ОРВИ, гнойно-воспалительными заболеваниями (отиты, гаймориты, ангины, пиелонефриты), после очередного рецидива/обострения которых появлялись высыпания, обусловливая частые с распространенными проявлениями рецидивы контагиозного моллюска, т. е. у детей имелись клинические признаки позднего иммунологического старта или вторичного иммунодефицита, которые являются основанием для включения в терапию больных иммунотропных препаратов и согласуются с результатами исследованиями ведущих педиатров, клинических иммунологов и аллергологов России (Д.В.Стефани, Ю. Е. Вельтищев, 1996; Ильина Н. И., Гущин И. С., Латышева Т. В. и др., 2001).

Проведенный нами анализ научной литературы по вопросам клинико-биологических особенностей контагиозного моллюска, биологических свойств возбудителя и методов лабораторных исследований в диагностике поксвирусных инфекций позволил сделать ряд выводов, определивших направления наших исследований.

Актуальность контагиозного моллюска среди кожно-венерических заболеваний людей не снижается, а наоборот, возрастает. Существует необходимость дифференциации контагиозного моллюска от ряда вирусных и кожных патологий у людей. Несмотря на некоторые успехи в терапии контагиозного моллюска, ранняя диагностика заболевания играет важную роль в эффективности лечения и проведения противоэпидемиологических мероприятий.

Современные молекулярно-биологические исследования недостаточно используются в нашей стране в диагностике контагиозного моллюска. Между тем исследования по изучению биологических свойств вируса контагиозного моллюска, организации и структуры его генома весьма интересны с позиций разработки новых методов лабораторной идентификации вируса.

Учитывая проблемы, связанные с выделением и размножением вируса контагиозного моллюска, амплификация специфических фрагментов его ДНК в полимеразной цепной реакции представляется наиболее перспективным лабораторным методом исследования в диагностике этого заболевания, как одного из наиболее чувствительных, специфичных, экспрессных и не требующих размножения микроорганизма в культуре клеток или организме лабораторных животных. Наибольшую значимость в этиологии заболевания имеет подтип I вируса контагиозного моллюска, нежели подтипы II, III и IV, в связи с чем основные усилия в разработке средств идентификации возбудителя целесообразно сосредоточить, прежде всего на подтипе I вируса контагиозного моллюска. Электронная микроскопия структуры поксвирусов, отличающая их от других семейств вирусов, может быть существенным показателем при комплексной идентификации возбудителя контагиозного моллюска в сочетании с другими методами анализа.

Поставленные задачи по идентификации вируса контагиозного моллюска на основе полимеразной цепной реакции и электронной микроскопии решены. При выборе праймеров для идентификации ДНК вируса контагиозного моллюска использовали нуклеотидную последовательность MOCDRNAP из базы данных GenBank (файл MOCDRNAP. GB). Она включает полные последовательности генов поли-А-полимеразы и двух субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Выбор исходной последовательности был обусловлен преимущественно высокой консервативностью подобных генов. Для поксвирусов характерна высокая генетическая стабильность, но встречаются и вариабельные участки, поэтому надёжнее было ориентироваться на заведомо консервативные районы генома.

Основная проблема, затрудняющая выбор праймеров — это высокое содержание GC-nap у данного вируса, следствием чего является большое количество тугоплавких шпилек (инвертированных повторов). Подобные структуры могут тормозить или даже полностью предотвращать амплификацию ДНК. Поэтому для подбора праймеров использовали только участки, свободные от шпилек. Достаточно протяжённых участков, пригодных для амплификации, оказалось совсем не много. При помощи программы OLIGO 4.0 было подобрано две пары праймеров с температурой отжига более 60 °C.

У первой пары праймер U989 комплементарен участку в конце гена поли-А-полимеразы (261.1292), a L1311 — в начале гена субъединицы 22К ДНКзависимой РНК-полимеразы (1192.1755). У второй пары оба праймера соответствуют концевой последовательности гена субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы с молекулярной массой 147К (2586.6455).

Праймеры первой пары содержат легкоплавкие шпилечные участки, которые обычно не мешают отжигу. Кроме того, длина образуемого ими ампликона равна 349N, тогда как вторая пара даёт более крупный ампликон (417N). В связи с этим была синтезирована только вторая пара (U5694.L6090).

Проведенные нами экспериментальные исследования показали, что применение пары праймеров VG5-VC6, комплементарных последовательностям гена ДНК-зависимой РНК-полимеразы вируса контагиозного моллюска, обеспечивает ферментативный синтез копий ДНК и видоспецифическое обнаружение возбудителя методом полимеразной цепной реакции в пробах и материалах, полученных от больных людей. Нами обонована структура праймеров для видоспецифической полимеразной реакции с ДНК вируса контагиозного моллюска и условия проведения реакции с выбранными праймерами. Показано, что видоспецифичность метода достигается отжигом праймеров при температуре 55 °C.

В отечественной лабораторной практике для идентификации возбудителей инфекционных заболеваний разработаны разные средства и методы пробоподготовки материалов для анализа направленной амплификации ДНК. В связи с этим сочли целесообразным экспериментально оценить метод пробоподготовки потенциально содержащих вирус контагиозного моллюска проб к анализу в полимеразной цепной реакции, с учетом рекомендованных в научной литературе подходов. Экспериментальными исследованиями нами показано, что неспецифическая нуклеосорбция высвобождаемой в ходе лизиса ДНК на микрочастицах стекла CPG-10/120 в присутствии высоких концентраций гуанидина тиоционата пригодна для подготовки потенциально содержащих вирус контагиозного моллюска проб к их анализу направленной амплификацией ДНК.

Таким образом, полученные результаты исследований показали пригодность выбранных нами праймеров для амплификации фрагментов гена ДНК-зависимой РНК-полимеразы вируса контагиозного моллюска и адаптированного метода пробоподготовки для выделения нуклеиновой кислоты возбудителя при изучении биопсийных материалов от больных людей с помощью полимеразной цепной реакции.

Исследования по изучению вируса контагиозного моллюска на основе электронно-микроскопического анализа позволило установить, что в биопсийных пробах, взятых от больных людей, можно выявить скопления типичных форм вируса контагиозного моллюска преимущественно в области ножки моллюска. При этом установлено, что вирусные частицы могут быть полиморфными и находиться на разных этапах морфогенеза. В то же время, использование в диагностике контагиозного моллюска только электронной микроскопии не позволяет провести идентификацию этого возбудителя в клинических материалах, т.к. выявляет только морфологические признаки, характерные лишь для семейства ортопоксвирусов.

Анализ результатов исследования показателей иммунной системы выявил, что у детей в возрасте от 1 до 7 лет с распространенными высыпаниями контагиозного моллюска обнаружено достоверное снижение относительного количества СД4+ позитивных клеток (23,6±1,1% - основная группа, 23,7±2,8% -группа сравнения против 35±2,3% в контролер<0,001 везде), иммунорегуляторного индекса (0,5±0,08 — основная группа, 0,4±0,02 -группа сравнения против 1,8±0,2 в контролер<0,0001 и р<0,001 соответственно), повышение лимфоцитов (33,5±0,8% - основная группа, 34,7±0,6% -группа сравнения против 25±1,6% в контролер<0,01 и р<0,001 соответственно), относительного количества СД8± (49,1±0,7% - основная группа, 54,7±0,6% -группа сравнения против 21±1,6% в контролер<0,001 везде), СД16±(29,8±-1,0% - основная группа, 30,1±1,3% -группа сравнения против 12±1,3% в контролер<0,001везде), СД38± (3,2±1,1% - основная группа, 31,1±1,7% группа сравнения против 26,6±0,58% в контролер<0,001 и р<0,01 соответственно) клеток, уровня IgA (2,3±0,2 г/л — основная группа, 3,2±0,4 г/лгруппа сравнения против 1,13±0,08 г/л в контролер<0,05 и р<0,001 соответственно), IgM (1,2±0,06 г/л — основная группа, 1,2±0,1г/лгруппа сравнения против 0,94±0,07 г/л в контролер<0,05 везде), интерферона гамма (1829,6±42,2МЕ/мл — основная группа, 1920,±49МЕ/млгруппа сравнения против 1200±250 МЕ/мл в контролер<0,05 и р<0,001 соответственно), провоспалительных цитокинов: интерлейкина 6 (975±25пкг/мл — основная группа, 994±16пкг/млгруппа сравнения против 500±30 пкг/мл в контролер<0,001 везде), интерлейкина 8 (622±26пкг/мл — основная группа, 618±29 пкг/млгруппа сравнения против 300±20пкг/мл в контролер<0,001 везде), фактора некроза опухоли альфа (71,3±2,2 пкг/мл — основная группа, 72±1,9 пкг/млгруппа сравнения против 35±15 пкг/мл в контролер<0,05 и р<0,01 соответственно), а у детей в возрасте от 7 до 14 лет — достоверно повышены были относительное количество СД16+ (16,6±1,8% - основная группа, 29,8±5,6% -группа сравнения против 12±1,3% в контролер<0,05 и р<0,001 соответственно), СД38+ (36,6±1,1% - основная группа, 36,6±2,4% -группа сравнения против 26,6±0,58% в контролер<0,001 везде) позитивных клеток, уровень IgA (2,7±0,4г/л — основная группа, 3,8±0,5г/лгруппа сравнения против 1,54±0,42г/л в контролер<0,05 и р<0,001 соответственно), IgM (1,9±0,2 г/лосновная группа, 2,2±0,12г/лгруппа сравнения против 1,03±0,47г/л в контролер<0,05 и р<0,01 соответственно), фактора некроза опухоли альфа (71,±7,0 пкг/мл — основная группа, 71,0±2,6 пкг/млгруппа сравнения против 35±15 пкг/мл в контролер<0,05 и р<0,01 соответственно), интерлейкина 8 (720±80 пкг/мл — основная группа, 796±37 пкг/млгруппа сравнения против 300±20 пкг/мл в контролер<0,05 везде) Только у детей группы сравнения в возрасте от 7 до 14 лет достоверно снижены были относительное количество СД4±клеток (22,6 ±1,3% против 35, ±2,3% в контроле, р<0,001), иммунорегуляторный индекс (0,4±0,02 против 1,8 ±0,2% в контроле, р<0,001), повышеныСД8+ клетки (50,0±0,4% против 21, ±1,6% в контроле, р<0,001), уровень цитокинов: интерферона гамма (1985±53 МЕ/мл против 1200 ±250 МЕ/мл в контроле, р<0,001), интерлейкина 6 (1126±81 пкг/мл против 500 ±30 пкг/мл в контроле, р<0,05).

У детей с, ограниченными высыпаниями имело место достоверное повышение относительного количества лимфоцитов, СДЗ±, СД4±, СД8±, СД16±, СД38± клеток, уровень IgA, в то время как содержание цитокинов было в пределах показателей лиц контрольной группы. Следовательно, у детей с ограниченными высыпаниями контагиозного моллюска не было достоверного снижения уровня хелперов/индукторов и в периферической крови отсутствовали маркеры-медиаторы активации клеток иммунной системы.