Содержание работы. 
Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины

Материалы и методы исследования

1. Образцы пуповинной крови (ПК) 3964 доношенных новорожденных полученные при физиологических и оперативных родах, прошедшие тестирование и внесенные в реестр неродственных доноров в г. Москве за период с 2003 по 2010 год. Сведения об общем объеме проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Объем проведенных исследований

Поскольку ряд показателей оценивались ретроспективно по данным медицинской документации, то не во всех случаях количество данных, включенных в расчет, совпадает с количеством образцов ПК.

После пережатия и пересечения пуповины производили пункцию сосудов пуповины специальной закрытой системой для забора пуповинной крови фирмы Green Cross объемом 250 мл, содержащей 35,5 мл антикоагулянта CPDA. Сбор крови осуществляли в течение 2−15 минут после родов (менее 5 минут — 3345 случаев (84,4%), от 5 до 10 минут — 345 случаев (8,7%) и более 10 минут — 274 (6,9%)), до отделения плаценты (n=3904 (98,5%)). В случае сбора крови после отделения плаценты (n=50 (1,5%)), плацента помещалась в специальную стерильную стойку и проводилась аналогичная процедура сбора ПК. Полученный материал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анализу не позднее 36 часов после процедуры сбора ПК.

Особенности течения беременности проанализированы у 1564 роженицы. Из 1564 обследованных рожениц — полностью здоровы — 248. Из 3964 новорожденных 2261 родились в результате первых родов, 1136 — вторых, 350 — третьих и 100 — роды четвертые и более (90 человек — 4-е роды, 14 человека — 5-е и 13 человека — 6-е). Процент мальчиков и девочек среди групп, составленных по порядковому номеру родов, не отличался. В каждой из групп девочек и мальчиков было приблизительно поровну. Вес плаценты проанализирован в 3299 случаях. Средний вес плаценты в группе составил — 580,57±4,92, диапазон: 77,0 г — 1138,0 г. Течение и осложнение родов прослежены у 1331 новорожденного. Все новорожденные были разделены на группы согласно способу родоразрешения: самостоятельные роды и роды путем кесарева сечения. Медиана длительности безводного промежутка составила 5 часов (от 20 минут до 19 часов 20 минут). Медиана длительности II периода родов (от начала потуг до рождения ребенка) составила 30 минут (от 10 минут до 1 часа 35 минут). Из 3964 образцов, для которых доступны данные относительно пола ребенка, мальчиков и девочек было 2069 (52,2%) и 1895 (47,8%), соответственно. Средняя масса при рождении была несколько выше у мальчиков (3629,24±18,25 г.; диапазон: 2270−5000 г.), чем у девочек (3467,23±18,17 г.; диапазон: 2300−4650 г.) (р<0,0001). Из 1564 новорожденных у 232 отмечалось изменение цвета околоплодных вод (224 — зеленые воды и 8 — кровянистые), что является косвенным признаком внутриутробной гипоксии плода, у 180 — во время беременности была диагностирована внутриутробная гипоксия плода, у 361 -отмечалось обвитие пуповины при рождении, у 109 — отмечалось внутриутробная задержка развития плода. Медиана гестационного возраста в группе без внутриутробной задержки развития составила 40 недель (диапазон — 33−42), а в группе с задержкой развития — 38 недель (диапазон — 37−41). Все новорожденные, у которых имеются сведения о степени зрелости плаценты на момент родов, были разделены на три группы по степени зрелости плаценты.

Выделение клеточного концентрата, содержащего стволовые клетки, проводилось в асептических условиях, в «чистом» помещении класса D двумя методами: методом двойного центрифугирования и аппаратным методом с помощью аппарата «Sepax S100», Biosafe, Switzerland (1986 и 1978 образца, соответственно). Все обработанные образцы были подвергнуты криоконсервации в роботизированном криокомплексе «BioArchive®», ThermoGenesis, USA. Непосредственно перед криоконсервацией, в каждый образец добавлялся криопротектор DMSO в смеси с декстраном-40 в количестве 20% от объема конечного продукта для предотвращения разрушения клеток концентрата ПК под воздействием сверхнизких температур.

Степень разведения образцов ПК антикоагулянтом была различна и зависела от объема собранной крови. Объем антикоагулянта в системе постоянный и составляет 35,5 мл, объем собранной крови колебался в пределах от 20,0 до 170,0 мл. Пересчет результатов автоматического анализа крови проводился с учетом степени разведения каждого образца для каждого показателя.

Подсчет клеток ПК производился двумя методами:

• · все 3964 образцов ПК были подвергнуты анализу автоматическим счетчиком клеток крови ABX Pentra 60 C+ в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров;
• · для точной морфологической характеристики клеток ПК использовали мазки, окрашенные по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского).

Количество нормобластов определяли при подсчете лейкоцитарной формулы на 200 последовательно встречающихся лейкоцитов с дальнейшим пересчетом на 100 (нормобласты/100лейкоцитов).

Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток определялось по экспрессии мембранных маркеров (CD — clusters of differentiation) в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD3, CD4, CD8, CD13, CD14, CD16, CD19, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD56, CD61, CD62L, CD62E, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, HLA-DR «Becton Dickinson», США при помощи проточной цитометрии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson», США.

Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции ПК определялась двумя методами:

1. культивирование в течение 14 суток в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества КОЕ-mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.

Эффективность клонирования (ЭК) определяли как общее число КОЕ на 1×10⁵ эксплантированных клеток.

Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл ПК, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

2. Культивирование в полутвердой среде в системе «агаровая капля — жидкая среда» в течение 7 суток с расчетом следующих показателей:

колониеобразующая (КОС) и кластерообразующая (КлОС) способность — число колоний (малые-20−40 клеток, средние- 41−100 клеток и большие — более 100 клеток) и кластеров (малые — 5−9 клеток, большие — 10−19 клеток) на 1×10⁵ эксплантированных клеток.

эффективность клонирования (ЭК) — общее число колоний и кластеров на 1×10⁵ эксплантированных клеток.

для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл крови, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

пролиферативный потенциал (ПП) — отношение числа колоний к кластерам в культуре.

Уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов ПК. Исследование проводилось при помощи проточной цитофлюориметрии двумя методами: определение количества клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК при окрашивании Propidium iodid (PI) и определение числа локусов связывания мембранного фосфатидил-серина в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием Annexin V FITC («Phar Mingen»), согласно инструкциям производителей. Результаты реакции анализировали на проточном цитофлюориметре FACScan («Becton Dickinson», США). Обработку полученных данных производили при помощи программы WinMDI 2.8 for Windows. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов клеток ПК определяли как сумму PI⁺/Annexin V⁺ и PI^-/Annexin V⁺ клеток, а уровень некроза, как количество PI⁺/Annexin V^- клеток.

Исследование генетического полиморфизма HLA системы ПК. Были исследованы 2650 образцов пуповинной крови условно здоровых детей. Геномная ДНК выделялась из образцов ПК методом сепарации на магнитных частицах, который основан на способности магнитных частиц адсорбировать на своей поверхности высвобожденную из клеток ДНК с помощью специфических лиганд. Характеристики выделенной ДНК, её концентрацию и степень чистоты, измеряли с помощью спектрофотометра. Концентрация ДНК измерялась против чистого элюирующего раствора по оптической плотности OD_260/280 Образцы для исследования соответствовали предъявляемым стандартным требованиям: концентрация ДНК была > 50 нг/мкл, и А260/280 составляло 1,7−1,9. Генотипирование проводилось методом гибридизации с помощью олигонуклеотидных зондов. Считывание и интерпретация результатов проводилась с помощью сканирующего устройства и компьютерной программы PMP. Данным методом выявлялись HLA-специфичности по всем исследуемым локусам на уровне групп аллелей. Образцы, у которых были получены двойные интерпретации результатов, дополнительно типировались методом ПЦР с помощью аллель-специфических праймеров. Регистрация сигналов электрофореграммы, фотографирование изображения и документирование их в электронном виде осуществлялось с помощью гельдокументирующей системы «ДиДжиДок» (США) и с использованием компьютерной программы UPV. Интерпретация результатов проводилась с помощью таблиц.

2. Образцы периферической крови 187 детей с диагнозом ОЛЛ и 146 детей с диагнозом ОМЛ (112 мальчиков и 75 девочек, в возрасте от 6 мес. до 17 лет, средний возраст составил 8,3 лет ± 4,6) и 146 детей, больных ОМЛ (88 мальчиков и 58 девочек, в возрасте от 6 мес. до 17 лет, средний возраст составил 8,9 лет ± 5,2). Все пациенты имели неблагоприятный прогноз и нуждались в дальнейшей трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

В зависимости от иммунологического варианта дети, больные ОЛЛ, были разделены на три группы: 1 группа В-ОЛЛ (98 пациентов); 2 группа Т-ОЛЛ (37 пациентов); 3-ю группу составляли дети, с не установленным иммунологическим вариантом (52 пациента). Дети, больные ОМЛ, были разделены в зависимости от цитоморфологической характеристики заболевания в соответствии с FAB классификацией на группы: М2 — 28 больных, М4 — 26 больных, М5 — 28 больных и М7 — 18 больных. Группы больных вариантами ОМЛ М0 (5 детей), ОМЛ М1 (5 детей) и М6 (4 ребенка), были малочисленными и потому не были включены в исследование. Помимо этого, была выделена группа с не установленным морфологическим вариантом (32 ребенка).

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. Для оценки полученных результатов и степени достоверности ассоциативных связей между генами системы HLA и изучаемыми заболеваниями в работе были использованы показатели: частота встречаемости гена (f), критерий Z c поправкой Йейтса на непрерывность, точный двусторонний критерий Фишера, если один из параметров был меньше 5, уровень достоверности (р). В случае, когда нулевая гипотеза отвергалась с вероятностью ошибки меньше, чем 5%, рассчитывался относительный риск RR и отношение шансов OR с доверительными интервалами 95% CI, если один из показателей был равен 0, относительный риск вычислялся по модифицированной формуле Haldane для малых чисел. В случаях, когда RR>2 (OR>2) вычислялась этиологическая/превентивная фракция. Статистический анализ исследования ассоциаций проводился с использованием двупольной таблицы при помощи программы «Open Epi» (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health), версия 2.3 (2009/20/05). Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики пакета Excel Microsoft и программы «Biostat», «SISA» и «EpiMax Table Calculator». При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.