Оптимизация метода ВЭЖХ для терапевтического лекарственного мониторинга противосудорожных препаратов, метотрексата и циклоспорина А

Актуальность темы

Здравоохранение — одна из главных областей человеческой деятельности, успехи которой прямо и косвенно зависят как от уровня развития аналитической химии в общем, так и от степени внедрения наиболее передовых методов химического анализа в практику. К таким методам относится и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая за последние 30 лет во многом определила заметный прогресс в практической медицине. Важнейшим приложением ВЭЖХ стал терапевтический лекарственный мониторинг, позволяющий оптимизировать индивидуальную дозировку лекарств, которая необходима для предотвращения побочных эффектов и повышения эффективности лечения.

ВЭЖХ как высокочувствительный и универсальный метод анализа, которому во многих случаях нет альтернативы, позволяет одновременно следить за изменением концентрации несколько лекарственных веществ (ЛВ), отличается достаточной точностью и воспроизводимостью. Однако, активное использование ВЭЖХ в повседневной (рутинной) клинической практике ограничено из-за отсутствия унифицированных методик анализа. В настоящее время для определения какого-либо ЛВ применяются своя «уникальная» процедура подготовки пробы и своя методика ВЭЖХ-анализа, которые в каждом конкретном случае предписывают использование разных колонок, разных элюентов и разных детекторов. Очевидно, что эти обстоятельства приводят к необходимости каждый раз изменять хроматографическую систему и калибровать хроматограф, что, в конечном итоге, значительно увеличивает продолжительность всего анализа, требуют высокой квалификации персонала и, наконец, существенно повышают стоимость анализа.

Один из возможных путей решения этой проблемы — разработка максимально унифицированных, экономичных и экспрессных методик подготовки пробы и хроматографических процедур. Реализация такого подхода, очевидно, позволит снизить расходы на проведение анализа и широко внедрить ВЭЖХ в практику лекарственного мониторинга.

Это направление развития ВЭЖХ, безусловно, представляется нам важным и актуальным.

Цель и задачи исследований.

1. Оптимизировать метод ВЭЖХ для задач терапевтического лекарственного мониторинга препаратов в сыворотке крови с целью широкого его внедрения в клиническую практику.

2. Унифицировать и оптимизировать метод ВЭЖХ для определения ряда лекарственных веществ (метотрексат, циклоспоринА, этосуксимид, гексамидин, фенобарбитал, ламиктал, дифенин, карбамазепин, бензонал, клоназепам, депакин), которые являются важнейшими объектами терапевтического лекарственного мониторинга.

3. Унифицировать и оптимизировать процедуру подготовки образцов крови для определения в них методом ВЭЖХ вышеперечисленных препаратов. Определить метрологические характеристики разработанных методик для подтверждения их соответствия требованиям, принятым для биоаналитических методов.

4 .Апробировать разработанные методики в клинической практике и подтвердить их пригодность для терапевтического лекарственного мониторинга.

Научная новизна работы представленной работы заключается в следующем:

1. Предложена унифицированная, оптимизированная и экономичная ВЭЖХ-методика для определения этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина, клоназепама и депакина (всепротивосудорожные препараты), метотрексата и циклоспорина А, позволяющая хроматографировать все соединения на колонке с обращенно-фазовым сорбентом типа «С 18» при использовании одной и той же двухкомпонентной подвижной фазы.

2. Предложена унифицированная и экономичная методика подготовки образца для прямого анализа этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в сыворотке крови методом.

ВЭЖХ. Ее отличительная особенность — возможность работы с малыми объемами образцов крови. Методика подготовки образца обеспечивает достаточную степень его очистки от балластных веществ крови и позволяет проводить более 400 анализов противосудорожных препаратов в сыворотке на одной колонке, что существенно повышает экономичность всего метода.

3. Показана пригодность разработанных методик подготовки пробы и ВЭЖХ-анализа для терапевтического лекарственного мониторинга противосудорожных препаратов (ПСП), метотрексата и циклоспорина, А путем апробации в рутинной клинической практике. На примере свыше 700 определений подтверждено соответствие метрологических характеристик разработанных методик требованиям, принятым для биоаналитических методов.

Практическая значимость работы.

Предложенные методики были использованы для терапевтического лекарственного мониторинга ПСП, метотрексата и циклоспорина, А в крови пациентов, проходившим лечение в Иркутской Государственной областной детской клинической больнице и в Иркутском Государственном институте усовершенствования врачей в период 1997;2003 гг. Данные мониторинга в сочетании с клиническими показателями были использованы врачами для коррекции доз лекарственных препаратов.

Внедрение разработанных методик для терапевтического лекарственного мониторинга в клиническую практику позволит более обоснованно определять тактику и стратегию лечения, сделав лечение эффективнее и безопаснее.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Оптимизированная ВЭЖХ-методика для определения ПСП, метотрексата и циклоспорина А, которая является экспрессной и экономичной вследствие унификации как условий ВЭЖХ-анализа, так и применения микроколоночного варианта ВЭЖХ. Время анализа составляет 10−15 мин.

2. Методика подготовки образца для прямого анализа этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в сыворотке крови, являющаяся простой, экспрессной и экономичной. Объем сыворотки крови для одного определения не превышает 50 мкл. На одной колонке выполняется более 400 анализов ПСП.

3. Результаты апробации разработанных методик подготовки пробы и ВЭЖХ-анализа в рутинной клинической практике, подтверждающие их пригодность для терапевтического лекарственного мониторинга.

4. Результаты исследования метрологических характеристик разработанных методик анализа, полученные путем обработки экспериментального материала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для биоаналитических методов анализов.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на: Всероссийском симпозиуме по теории и практике хроматографии и электрофореза (Москва, 1998) — Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва, 1999) — V Национальном Съезде фармацевтов Украины «Достижения современной фармацевтики и перспективы его развития в новом тысячелетии» (Киев, 1999) — VI Конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока — 2000» (Новосибирск, 2000) — VIII Всеросийском съезде неврологов (Казань, 2001) — II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск- 2002) — X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», (Москва, 2003) — 3-ем Международном симпозиуме по методам разделения в биологических науках (Москва, 2003).

По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 137 страницах текста, содержит 23 рисунок, 12 таблиц и 4 приложения. В списке цитируемой литературы 127 наименований.

5. ВЫВОДЫ.

1. Разработана и оптимизирована унифицированная ВЭЖХ-методика для определения концентрации этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина, клоназепама, депакина, метотрексата и циклоспорина, А в сыворотке крови. Ее основными особенностями являются: колонка: 0 2×75 мм с сорбентом Nucleosil 100−5 С18- элюенты: 0,2 М перхлорат лития (рН 3, Н3РО4) и ацетонитрилмноговолновое фотометрирование в УФ области спектрапродолжительность анализа: 10−15 мин.

Методика позволяет осуществлять лекарственный терапевтический мониторинг противосудорожных препаратов при проведении как moho-, так и комплексной терапии.

2. Разработана методика подготовки проб сыворотки крови для лекарственного терапевтического мониторинга этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата путем их прямого определения с помощью ВЭЖХ. Методика включает в себя 2 стадии: удаление свободных липидов экстракцией гексаном и осаждение белков добавлением 0,6 М раствора перхлората лития в ацетонитриле (рН 2). Методика подготовки пробы требует не более 50 мкл сыворотки, и позволяет выполнить на одной колонке не менее 400 анализов.

3. Практическая применимость разработанных методик ВЭЖХ-анализа и подготовки проб сыворотки крови для лекарственного терапевтического мониторинга показана на примере мониторинга концентрации противосудорожных препаратов у более, чем 700 больных и на примере мониторинга концентрации метотрексата при химиотерапевтическом лечении 30 пациентов.

4. Метрологические характеристики разработанных методик анализа удовлетворяют требованиям, принятым для биоаналитических методов. Относительное стандартное отклонение не превышает 15% в ^" тервале терапевтических концентраций для всех соединений.

2.8.

Заключение

.

Обзор литературных данных по ВЭЖХ-анализу лекарственных соединений, рекомендованных для ТЛМ, показывает, что существуют общие подходы к определению JIB в биологических жидкостях.

Подавляющее число определений выполняется на обращенных фазах С18 различных торговых марок, обладающих некоторыми сходными характеристиками (форма и диаметр зерна, размер пор, плотность прививки, эндкеппинг), но существенно различающиеся селективностью.

Различия в селективности используемых сорбентов зачастую обуславливают разнообразие используемых ПФ, хотя достаточно часто применяется бинарная ПФ ацетонитрил-водный буфер (рН 3). Концентрация ацетонитрила в ПФ варьируется в широких пределах, в зависимости от определяемого соединения, так как в TJIM используется обычно изократический режим элюирования.

Детекторы, чаще всего используемые в ТЛМ — УФ-спектрофотометры с перестраиваемой длиной волны. Применение детекторов с многоканальной регистрацией повышает достоверность идентификации пиков, позволяет оценивать их гомогенность, но высокая стоимость таких детекторов ограничивает их применение в рутинном анализе.

Подготовка пробы в ТЛМ зависит от концентрации определяемого ЛВ, его физико-химических свойств. Традиционные методы подготовки пробы включают в себя осаждение белка, ТФЭ или, реже, жидко-жидкостную экстракцию. К современным методам можно отнести применение предколонок, заполненными сорбентами с «ограниченным доступом» .

Обращает на себя внимание тот факт, что в ТЛМ практически для каждого ЛВ существует своя методика определения, предполагающая определенный сорбент, определенные элюенты, детектор, методику подготовки пробы. Работ, где в одних условиях определяется несколько различных ЛВ, очень мало, хотя очевидно, что необходимость анализа различных ЛВ в рамках одной лаборатории при большом разнообразии методик ведет к увеличению продолжительности анализа, требует высокой квалификации персонала и, в конечном итоге, существенно повышает стоимость анализа. Эту стоимость можно заметно снизить путем унификации условий подготовки пробы и условий хроматографического разделения, и такой подход для анализа JIB в биологических объектах используется в токсикологическом скрининге, где он обусловлен самой аналитической задачей [91, 92]. Аналогичный подход к определению терапевтических JIB позволил бы широко внедрить этот метод в рутинную практику. Решение этой проблемы представляется нам актуальной задачей.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Оборудование.

В работе использовали микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», Новосибирск) с колонками 02×75 мм, заполненными сорбентами Nucleosil 100−5 С18, Nucleosil 100−5 С18 РАН, Nucleosil 100−5 С18 АВ и Nucleosil 300−5 С8 (Macherey-Nagel, Германия) — Kromasil-100−5-С18, Kromasil-100−5-С8 и Kromasil-100−5-C4 («ЕКА Chemicals» (Швеция).

Центрифуга ОС-6МУХЛ (6000 об./мин), рН метр-иономер И-120.2.

3.2. Материалы.

В качестве стандартных (контрольных) веществ были использованы фармацевтические субстанции JIB, содержание основного вещества в которых не ниже 98%.

В качестве реагента для модификации вальпроевой кислоты использован п-бромфенацил бромистый («Sigma», США).

Для приготовления элюентов и обработки проб использованы: ацетонитрил (сорт 1) и гексан фирмы «Криохром» (Санкт-Петербург) — трифторуксусная кислота («Sigma», США), уксусная кислота, фосфорная кислота, перхлорат лития квалификации не ниже «х.ч». Хлористый метилен, метанол и триэтиламин были перегнаны перед использованием. Дистиллированная вода была дополнительно очищена с помощью системы «Norganic, Millipore Corporation» (США).

3.3. Методы.

3.3.1. Условия хроматографического определения JIB.

Элюенты и режимы элюирования. В качестве элюента, А использовали 0,2 М LiC104 — Н3РО4 (рН 3) — элюент Б — MeCN. При определении индивидуальных противосудорожных препаратов (ПСП) использовали изократическое элюирование. Содержание ацетонитрила в ПФ для каждого из определяемых соединений приведено в Главе 4 (п. 4.3). При определении двух и более ПСП применяли градиентное элюирование: 2000 мкл от 10 до 30% Б- 1000 мкл 30% Б.

При определении метотрексата применяли следующий режим градиентного элюирования: 2200 мкл от 5 до 20% Б- 1000 мкл 20% Б.

Циклоспорин, А определяли при градиентном элюировании: 2500 мкл от 50 до 80% Б- 1000 мкл 80% Б.

Скорость потока элюента при всех режимах была 150 мкл/мин.

Длины волн детектирования для каждого из определяемых соединений приведены в Главе 4 (п. 4.4.1).

Температура колонки. При определении циклоспорина, А температура колонки в процессе разделения была 70°Спри совместном присутствии в пробе дифенина и карбамазепина — 55°Сво всех остальных случаях — 40 °C.

Запись УФ-спектров. Для записи УФ-спектров готовили стандартные растворы определяемых соединений с концентрацией 0,2 мг/мл. В качестве растворителей для приготовления стандартных растворов использовали: метанол (гексамидин, фенобарбитал, ламиктал, дифенин, карбамазепин) — воду (этосуксимид, метотрексат) — смесь ацетонитрил — вода (циклоспорин А) — нейтрализованный реакционный раствор (яара-бромфенациловый эфир вальпроевой кислоты). Спектры записывали во время хроматографического анализа после остановки потока вблизи максимума пика (интервал длин волн 190 — 360 нм, шаг 2 нм).

3.3.2. Отбор и хранение проб крови.

Для определения максимального содержания ПСП кровь из локтевой вены отбирали через 1,5−2 часа после утреннего приема препарата или в течение суток в заданное время. Для определения минимальной концентрации циклоспорина, А кровь из локтевой вены отбирали за 1−2 часа до утреннего приема препарата. Для определения содержания метотрексата пробы крови отбирали через подключичный катетер через установленные интервалы времени после начала инфузии метотрексата (9 проб в процессе инфузии и 9−11 проб после ее окончания).

После добавления к цельной крови 1 капли раствора гепарина, плазму отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Аликвоту плазмы анализировали или хранили при — 20 °C до анализа.

3.3.3. Удаление липидов из сыворотки крови.

Отделение наиболее гидрофобных соединений сыворотки крови (липидов) от целевых компонентов проводили экстракцией гексаном, для чего к сыворотке крови добавляли гексан в соотношении 1:5 по объему, встряхивали в течение 5 мин, центрифугировали для разделения слоев, гексановый слой отбрасывали, а сыворотку использовали для дальнейшей работы.

3.3.4. Удаление белков из сыворотки крови.

После отделения удаления липидов к сыворотке крови добавляли 0,6 М раствор перхлората лития в ацетонитриле, содержащем 1% уксусной кислоты, в соотношении 1:1 по объему, центрифугировали и верхний слой (супернатант) использовали для работы.

3.3.5. Подготовка пробы сыворотки крови для определения гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата.

В пробирку вносили 120 мкл сыворотки крови и проводили обработку в соответствии с п. 3.3.3. В две пробирки помещали по 50 мкл обработанной сыворотки и осаждали белки в соответствии с п. 3.3.4. Аликвоту супернатанта (520 мкл) инжектировали в колонку. 3.3.6. Подготовка пробы для определения этосуксимида.

В пробирку вносили 200 мкл сыворотки крови, содержащей этосуксимид и обрабатывали в соответствии с п. 3.3.3. В две пробирки помещали по 80 мкл обработанной сыворотки и осаждали белки в соответствии с п. 3.3.4. Аликвоту супернатанта (2 мкл) инжектировали в колонку. Если концентрация этосуксимида в исходной сыворотке была ниже 3,3 мкг/мл, то в каждую пробирку, содержащую супернатант, добавляли по 200 мкл хлористого метилена для экстракции российская государственная библиотека ацетонитрила, встряхивали и после разделения слоев 2−10 мкл верхнего раствора инжектировали в колонку.

3.3.7. Подготовка пробы для определения вальпроевой кислоты.

Вальпроевую кислоту в сыворотке крови определяли в виде пара-бромфенацилового эфира, методика получения которого была любезно предоставлена Г. Г. Шамовским (ЗАО «ЭкоНова», Новосибирск). Подготовка пробы проводилась следующим образом: для удаления липидов к 200 мкл сыворотки крови добавляли 1 мл гексана, встряхивали 5 мин и гексановый слой отбрасывали. Для экстракции вальпроевой кислоты к оставшемуся водному слою добавляли 200 мкл 2 М водного раствора Н3РО4, 1 мл гексана, встряхивали 5 мин и разделяли слои центрифугированием. 500 мкл верхнего гексанового слоя переносили в другую пробирку и упаривали досуха в токе аргона. Для получения пара-бромфенацилового эфира к остатку приливали 400 мкл раствора пара-бромфенацила бромистого в ацетонитриле (5 мг/мл), 20 мкл раствора триэтиламина в ацетонитриле (28 мг/мл) и выдерживали при комнатной температуре 1 час. К пробе добавляли 10 мкл 2 М водного раствора Н3РО4 и хроматографировали. Производное стабильно не менее суток.

3.3.8. Подготовка пробы для определения клоназепама.

К 1,1 мл сыворотки крови, содержащей клоназепам, добавляли 5 мл гексана для удаления липидов. 1 мл обработанной сыворотки переносили в другую пробирку. Клоназепам экстрагировали из обработанной сыворотки следующим образом: к 1 мл сыворотки добавляли 50 мкл 2 М водного раствора КОН и 1 мл хлористого метилена, встряхивали 5 мин и отделяли нижний слой раствора, содержащий клоназепам. К оставшемуся водному раствору добавляли еще 1 мл хлористого метилена, повторяли экстракцию, экстракты объединяли и упаривали досуха в токе аргона. Остаток растворяли в 50 мкл раствора ацетонтрил-вода (1:1) и 20 мкл этого раствора инжектировали в колонку.

3.3.9. Подготовка пробы для определения циклоспорина А.

Из 1,2 мл сыворотки крови удаляли белок в соответствии с п. 3.3.4. После этого 2,2 мл супернатанта помещали в пробирку, добавляли 2,2 мл хлористого метилена, энергично встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали для разделения слоев. Верхний (водный) слой удаляли, в другую пробирку переносили аликвоту нижнего слоя (хлористый метилен-ацетонитрил) объемом 3 мл и упаривали досуха в токе аргона при 40 °C. Для экстракции липидов остаток растворяли в 140 мкл 50%-ного водного ацетонитрила, содержащем 1% трифторуксусной кислоты, добавляли 1 мл гексана и встряхивали 5 мин. После разделения слоев 100 мкл нижнего слоя (вода-ацетонитрил) инжектировали в колонку.

3.3.10. Оценка степени извлечения из сыворотки крови клоназепама и циклоспорина А.

Степень извлечения клоназепама и циклоспорина, А из сыворотки оценивали путем добавки известных количеств этих соединений в образцы донорской сыворотки. Пробы с добавкой обрабатывали в соответствии с методиками. Степень извлечения рассчитывали как отношение площадей пиков веществ на хроматограммах экстракта сыворотки и стандартного раствора.

3.3.11. Определение градуировочных зависимостей для JIB.

Градуировочные растворы для всех определяемых JIB готовили путем добавления 10 мкл стандартных растворов этих JIB с подходящей концентрацией к 200−4000 мкл донорской сыворотки. Далее пробы обрабатывались в соответствии с методиками. Градуировочная зависимость для каждого определяемого JIB получена для пяти концентраций (п=10).

3.3.12. Оценка селективности и специфичности методик анализа.

Влияние эндогенных компонентов сыворотки крови для каждого определяемого ЛВ оценивали путем анализа 10 различных образцов сыворотки крови как доноров, так и пациентов, не принимающих этот препарат.

Оценку селективности разработанных ВЭЖХ-методик (включая подготовку пробы) выполняли для каждого определяемого противосудорожного препарата путем добавок других ПЭП, используемых при проведении комплексной терапии.

3.3.13. Оценка метрологических характеристик методик анализа.

Предел обнаружения (ПрО) для каждого определяемого вещества рассчитывали как минимальную концентрацию этого соединения в исходной сыворотке крови, для которой отношение «сигнал/шум» в инжектируемой пробе равно 3. Относительное стандартное отклонение и отклонение от номинального значения при этом были менее 20%.

Предел количественного определения рассчитывали как концентрацию определяемого соединения в исходной сыворотке, для которой отношение «сигнал/шум» в инжектируемой пробе равно 10. Относительное стандартное отклонение и отклонение от номинального значения при этом были менее 15%.

Оценку воспроизводимости во всем интервале определяемых концентраций для определяемых соединений выполняли, используя реальные или модельные образцы, приготовленные на основе донорской сыворотки (п=10).

Правильность метода оценивали методом добавок при количестве параллельных определений для каждой концентрации не менее 5.

Линейность метода для каждого ЛВ оценивали в интервале рабочих концентраций.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Выбор масштаба ВЭЖХ.

Как было нами отмечено в Главе 2, длина хроматографических колонок, используемых в ТЛМ, варьируется от 100 до 250 мм, а их внутренний диаметр составляет 4,0−4,6 мм. При этом в настоящее время около 50% разделений в TJIM выполняется на колонках длиной 100−150 мм. Применение коротких колонокодин из возможных путей снижения стоимости анализа за счет сокращения его длительности и уменьшения расхода ПФ [16−18]. Уменьшение диаметра колонки при сохранении нагрузки на сорбент приводит к повышению чувствительности анализа, что, в свою очередь, снижает требования к чистоте растворителей [18]. Очевидно, что одновременное уменьшение длины и диаметра колонки по сравнению со «стандартной» колонкой позволяет получить существенные выгоды [17]. Простой расчет показывает, что применение колонки размером 02×75 мм взамен традиционной (04,6×250 мм) в 10−20 раз снижает расход растворителей и во столько же раз повышает чувствительность определения.

ВЭЖХ на колонках 02×75 мм мы считаем оптимальным масштабом для целей TJIM. Дальнейшее уменьшение колонки до размеров капиллярной представляется нецелесообразным, так как ее нельзя использовать в сочетании со стандартным аналитическим хроматографическим оборудованием (инжекторы, насосы, ячейка детектора), оборудование, специально разработанное для капиллярной ВЭЖХ, пока слишком дорого и поэтому мало пригодно для рутинного анализа. Отметим также, что выигрыш в чувствительности определения и экономия растворителей при переходе от колонок диаметром 2 мм к колонкам диаметром 1 мм и менее, становятся уже не такими заметными.

4.2. Выбор неподвижной фазы.

Для определения лекарственных веществ в TJIM используются обращенные фазы С8 и С18 различных торговых марок, синтезированные на основе силикагеля. Известно, что практически все ОФ, даже при условии «одинаковости» их нормируемых характеристик, могут существенно различаться по селективности.

Для оценки пригодности конкретных ОФ нами совместно с М. О. Родинко и И. Н. Азаровой было исследовано 7 сорбентов (частицы сферической формы с диаметром 5 мкм), некоторые характеристики которых приведены в таблице 3.